殷桂草，鄭生旗，張 偉，董 欣，祁樂(lè)中，李一帆

1. 揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，江蘇 揚(yáng)州 225000

2. 揚(yáng)州大學(xué)護(hù)理學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225000

膀胱癌具有高度異質(zhì)性，是世界上第五大常見(jiàn)惡性腫瘤［1］。2018年，全世界超過(guò)19.9 萬(wàn)人死于膀胱癌，新發(fā)膀胱癌病例超過(guò)54.9 萬(wàn)例［2］。約3/4 的膀胱癌在最初診斷時(shí)為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌［3］，可以通過(guò)經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除聯(lián)合膀胱內(nèi)灌注化療進(jìn)行治療，預(yù)后一般較好；一旦病變累及膀胱肌層，或出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，患者的5年總存活率將從80%下降到15%以下［4-5］。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)新的預(yù)后評(píng)估策略和有效的治療方法來(lái)改善膀胱癌患者的預(yù)后。

近年來(lái)，免疫療法顯示出積極的抗腫瘤作用［6-7］。研究證實(shí)，PD-1/PD-L1 檢查點(diǎn)抑制劑對(duì)肌層侵襲性和轉(zhuǎn)移性膀胱癌具有較好的療效［8］。腫瘤微環(huán)境中的免疫成分在腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)和臨床預(yù)后中發(fā)揮重要作用［9］，不同免疫細(xì)胞浸潤(rùn)豐度的膀胱癌患者在基因組、轉(zhuǎn)錄組和生物學(xué)過(guò)程上存在顯著異質(zhì)性［10］。因此，量化腫瘤中關(guān)鍵免疫細(xì)胞成分可以為預(yù)測(cè)腫瘤患者的免疫治療效果及預(yù)后評(píng)估提供新的方法。

隨著高通量技術(shù)的成熟和腫瘤免疫研究算法的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可以用來(lái)描述腫瘤免疫微環(huán)境［11］。然而，目前還沒(méi)有研究系統(tǒng)地探究免疫浸潤(rùn)評(píng)分與膀胱癌患者治療及預(yù)后的關(guān)系。本研究基于ssGSEA 算法獲得16種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的評(píng)分，通過(guò)無(wú)監(jiān)督聚類將患者分為高、低免疫浸潤(rùn)兩個(gè)聚類，研究不同聚類之間免疫檢查點(diǎn)相關(guān)基因的表達(dá)、化療藥物敏感性和免疫治療效果的差異；通過(guò)WGCNA 發(fā)現(xiàn)與關(guān)鍵免疫細(xì)胞相關(guān)的核心基因，Cox 回歸篩選預(yù)后相關(guān)基因，構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型，并利用多因素分析發(fā)現(xiàn)該風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是膀胱癌患者獨(dú)立的預(yù)后因素；最后，根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和臨床病理參數(shù)建立列線圖來(lái)預(yù)測(cè)患者1、3、5年的總存活率，為患者的預(yù)后評(píng)估及個(gè)性化治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集及處理

從TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//portal.gdc.cancer.gov/repository）中獲取19 份正常組織標(biāo)本和411份膀胱癌組織標(biāo)本的RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)及相關(guān)臨床數(shù)據(jù)。排除重復(fù)標(biāo)本和患者總存活時(shí)間不足30 d 的標(biāo)本。從GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/）下載GSE13507 中標(biāo)本的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)和患者的臨床數(shù)據(jù)。從TCIA 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//tcia.at/home）下載膀胱癌患者對(duì)不同免疫治療方案的免疫細(xì)胞陽(yáng)性比例分?jǐn)?shù)評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)，免疫細(xì)胞陽(yáng)性比例分?jǐn)?shù)得分越高代表患者免疫治療的效果可能越好。

1.2 采用ssGSEA分析免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況

利用“GSVA”包進(jìn)行ssGSEA，計(jì)算正常組織和腫瘤組織16 種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的評(píng)分，并使用R中的“l(fā)imma”、“ggplot2”和“ggpubr”包對(duì)正常組織和腫瘤組織免疫浸潤(rùn)評(píng)分的差異進(jìn)行比較。

1.3 采用無(wú)監(jiān)督聚類進(jìn)行膀胱癌患者分型分析

為了進(jìn)一步探討免疫浸潤(rùn)評(píng)分對(duì)膀胱癌患者預(yù)后和治療的價(jià)值，使用“ConsensusClusterPlus”包基于16 種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分對(duì)膀胱癌患者進(jìn)行聚類分型，設(shè)置maxK=9，reps=100，pItem=0.8，pFeature=1，distance=“manhattan”，clusterAlg=“pam”。同時(shí)，使用ggplot2 R 包生成無(wú)監(jiān)督聚類和相應(yīng)的代表性數(shù)據(jù)。之后，對(duì)不同聚類的患者進(jìn)行預(yù)后分析，并進(jìn)行主成分分析以驗(yàn)證分型的效果。使用“Heatmap”包繪制不同分型下免疫細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分的熱圖。使用“l(fā)imma”包、“ggplot2”包評(píng)估不同分型下免疫檢查點(diǎn)相關(guān)基因的表達(dá)及患者對(duì)免疫治療反應(yīng)的差異。最后，使用“prophytic”包評(píng)估不同分型的膀胱癌患者對(duì)臨床藥物的敏感性。

1.4 采用WGCNA 篩選與關(guān)鍵免疫細(xì)胞顯著相關(guān)的基因集

WGCNA 的輸入數(shù)據(jù)文件為：①TCGA 數(shù)據(jù)集中411 個(gè)膀胱癌腫瘤組織標(biāo)本的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)；②前述鑒定的關(guān)鍵免疫細(xì)胞的免疫浸潤(rùn)評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)。首先，通過(guò)中位數(shù)絕對(duì)偏差測(cè)量411 個(gè)標(biāo)本中基因表達(dá)的可變性，并確定在正常組織和腫瘤組織中差異表達(dá)的基因。構(gòu)建帶表型熱圖的樣本樹(shù)突圖。然后，通過(guò)軟閾值函數(shù)計(jì)算出最佳軟閾值，并通過(guò)軟閾值構(gòu)造加權(quán)鄰接矩陣。鄰接矩陣進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為拓?fù)渲丿B矩陣。然后，將具有相似表達(dá)的基因聚類成一個(gè)模塊，稱為共表達(dá)模塊。計(jì)算P值和相關(guān)系數(shù)以確定共表達(dá)模塊與表型之間的關(guān)聯(lián)。最后，鑒定出與關(guān)鍵免疫細(xì)胞浸潤(rùn)顯著相關(guān)的關(guān)鍵模塊，并提取模塊內(nèi)的關(guān)鍵基因用于下一步研究。

1.5 功能富集分析研究關(guān)鍵基因的潛在功能

使用“ClusterProfiler”包進(jìn)行富集分析，以探索關(guān)鍵基因潛在的功能，并選擇GO 和KEGG 作為背景數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.6 構(gòu)建基于關(guān)鍵基因的預(yù)測(cè)模型并驗(yàn)證

首先，采用“glmnet”包對(duì)1.4 篩選出來(lái)的基因進(jìn)行LASSO Cox 回歸分析，進(jìn)一步確定與膀胱癌患者預(yù)后相關(guān)的基因。然后，從HPA 數(shù)據(jù)庫(kù)下載膀胱癌預(yù)后相關(guān)基因在膀胱癌組織和正常膀胱組織中的免疫組織化學(xué)結(jié)果，驗(yàn)證其在組織中的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。針對(duì)無(wú)免疫組織化學(xué)結(jié)果的HOXB5和HOXB6采用qRT-PCR在臨床標(biāo)本中驗(yàn)證。具體方法：收集揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院8 份膀胱癌組織標(biāo)本和鄰近正常組織標(biāo)本，其中正常組織標(biāo)本距離腫瘤組織2 cm。所有操作規(guī)程均通過(guò)揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審查（2020-YKL03-G042）。所有標(biāo)本均存儲(chǔ)在－80 ℃冰箱保存。使用TRIzol 試劑（美國(guó)Invitrogen 公司）從樣品中提取總RNA，然后用RNeasyMaxi 試劑盒（德國(guó)Qiagen 公司）純化獲得RNA。完成上述步驟后，按照miScriptⅡRT試劑盒（德國(guó)Qiagen 公司）的說(shuō)明書(shū)，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用miScriptSYBR?GreenPCR 試劑盒（德國(guó)Qiagen公司）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)所需儀器為L(zhǎng)C480熒光定量PCR 儀。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共45 個(gè)循環(huán)。相關(guān)基因的引物序列見(jiàn)表1。然后，基于篩選并經(jīng)驗(yàn)證的膀胱癌預(yù)后相關(guān)基因構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型：風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=（Coef1×mRNA1的表達(dá)量）+（Coef2×mRNA2的表達(dá)量）+…+（Coefn×mRNAn 的表達(dá)量）。其中，Coef 為相應(yīng)mRNA 的LASSO Cox 回歸模型系數(shù)。通過(guò)中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分將膀胱癌患者分為高、低風(fēng)險(xiǎn)組。使用R 中的“Kaplan-Meier”包評(píng)價(jià)兩組患者的預(yù)后，使用R 中的“survivalROC”包生成ROC 曲線，并使用“timeROC”包計(jì)算模型的AUC值。同時(shí)，從GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載GSE13507 數(shù)據(jù)集（包含165 例具有完整臨床隨訪數(shù)據(jù)的膀胱癌患者），對(duì)模型進(jìn)行外部驗(yàn)證。

表1 qRT-PCR引物設(shè)計(jì)Table 1 qRT-PCR primers

1.7 構(gòu)建預(yù)測(cè)膀胱癌患者預(yù)后的列線圖

首先，結(jié)合風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和臨床病理特征進(jìn)行單因素和多因素Cox 回歸分析，以探索風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型是否為膀胱癌患者預(yù)后的獨(dú)立相關(guān)因素。然后，基于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和獨(dú)立的臨床病理特征構(gòu)建列線圖，并使用C 指數(shù)和校準(zhǔn)曲線驗(yàn)證列線圖的預(yù)測(cè)效能。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用R 4.0.3 和GraphPad 9.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。連續(xù)性變量用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述，采用Student’st檢驗(yàn)或Wilcoxon秩和檢驗(yàn)進(jìn)行比較；分類變量用頻率（%）描述，采用χ2檢驗(yàn)或Fisher 精確檢驗(yàn)。繪制Kaplan-Meier 生存曲線和時(shí)間依賴性ROC 曲線，評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型的預(yù)測(cè)價(jià)值。采用單因素和多因素Cox 回歸分析確定膀胱癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素。P<0.05 為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 正常組織與腫瘤組織免疫細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分差異及與患者預(yù)后的相關(guān)性

與正常組織標(biāo)本比較，膀胱癌組織標(biāo)本中B 細(xì)胞、肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、輔助性T 細(xì)胞和腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)評(píng)分明顯升高（均P<0.05），提示這五種免疫細(xì)胞可能在膀胱癌免疫微環(huán)境的改變中發(fā)揮重要作用，是膀胱癌的關(guān)鍵免疫細(xì)胞。見(jiàn)圖1。

圖1 癌癥基因組圖譜膀胱癌隊(duì)列中正常組織與腫瘤組織16種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)豐度比較Figure 1 Comparison of 16 kinds of immune cell infiltration abundance between normal tissues and tumor tissues in bladder cancer cohort from the Cancer Genome Atlas

聚類分析結(jié)果顯示，411 份膀胱癌患者標(biāo)本可初步分為三類（圖2）。生存曲線分析發(fā)現(xiàn)，聚類2 中患者的預(yù)后顯著優(yōu)于聚類1 和聚類3（均P<0.05），而聚類1和聚類3患者的預(yù)后無(wú)顯著差異（P>0.05），見(jiàn)圖3A?；诖?，本研究將聚類1 和聚類3 合并為一類（聚類1′）重新進(jìn)行生存分析。結(jié)果顯示，聚類1′和聚類2 中患者的存活率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3B）。進(jìn)一步行主成分分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)TCGA 樣本被劃分為兩個(gè)簇時(shí)，樣本可以明顯分離（附圖1），且聚類2 患者的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分明顯高于聚類1′患者（附圖2）。

2.2 不同聚類患者治療情況比較

比較不同聚類之間免疫檢查點(diǎn)相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，在聚類2 中免疫檢查點(diǎn)相關(guān)基因的表達(dá)均顯著升高（附圖3A）。TCIA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，聚類2 中患者對(duì)CTLA4 抑制劑、PD-1 抑制劑及兩者聯(lián)合更敏感，更能夠從免疫治療中獲益（附圖3B）。分析兩種分型患者對(duì)常用化療藥物的敏感性發(fā)現(xiàn)，與聚類1′比較，聚類2患者對(duì)恩貝酸、多西他賽、環(huán)巴胺和阿卡地新更為敏感（附圖3C）。

2.3 關(guān)鍵免疫細(xì)胞相關(guān)基因組篩選結(jié)果

從附圖4可以看出，當(dāng)軟域值為5時(shí)，數(shù)據(jù)更符合冪律分布，平均連通性趨于穩(wěn)定，數(shù)據(jù)適合進(jìn)一步研究。確定了軟閾值后，根據(jù)基因間表達(dá)量的相關(guān)性構(gòu)建基因聚類樹(shù)。將最小模塊數(shù)設(shè)置為10，深度靈敏度設(shè)置為 2，使用動(dòng)態(tài)剪切法識(shí)別模塊。最后，將相似度小于0.8的模塊合并，共得到25 個(gè)非灰色模塊（圖4）。在正相關(guān)性模塊中，棕色模塊中除肥大細(xì)胞外，其余相關(guān)系數(shù)均大于0.7，可見(jiàn)其與免疫細(xì)胞的相關(guān)性系數(shù)相對(duì)較大；在負(fù)相關(guān)性模塊中，僅有黑灰色模塊，見(jiàn)表2。本研究后續(xù)選擇棕色模塊和黑灰色模塊，匯總兩個(gè)模塊共得到35 個(gè)基因。相關(guān)基因的表達(dá)見(jiàn)附圖5。

圖4 基于最優(yōu)軟閾值構(gòu)建基因聚類樹(shù)及共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)Figure 4 Construction of gene clustering tree and coexpression network based on optimal soft threshold

圖5 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型在TCGA數(shù)據(jù)集中的驗(yàn)證Figure 5 Validation of the risk scoring model in the TCGA dataset

表2 不同模塊與關(guān)鍵免疫細(xì)胞的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis between different modules and key immune cells

2.4 關(guān)鍵基因富集分析結(jié)果

對(duì)35 個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行GO 分析結(jié)果顯示，在生物過(guò)程及分子功能分析中，35 個(gè)關(guān)鍵基因顯著參與單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞的分化以及正向調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生（附圖6）；在細(xì)胞成分分析中，相關(guān)基因主要富集于質(zhì)膜的外側(cè)。KEGG 富集分析結(jié)果顯示，這些基因主要參與T細(xì)胞受體信號(hào)通路、細(xì)胞黏附分子及細(xì)胞因子-受體相互作用（附圖7）。

圖6 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型在GSE13507數(shù)據(jù)集中的驗(yàn)證Figure 6 Validation of the risk scoring model in GSE13507 dataset

圖7 基于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分構(gòu)建膀胱癌患者預(yù)后相關(guān)列線圖Figure 7 Prognostic nomogram of bladder cancer patients based on risk score

2.5 膀胱癌預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型的構(gòu)建與驗(yàn)證

基于之前篩選出來(lái)的35個(gè)基因，進(jìn)一步通過(guò)LASSO Cox 回歸篩選出4 個(gè)與患者預(yù)后相關(guān)的基因GPR171、HOXB3、HOXB5和HOXB6。通過(guò)HPA數(shù)據(jù)庫(kù)比較相關(guān)基因的蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，GPR171 在腫瘤組織中高表達(dá)，HOXB3 在腫瘤組織中低表達(dá)（附圖8）；通過(guò)臨床組織標(biāo)本進(jìn)行驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，HOXB5和HOXB6mRNA 在腫瘤組織中均高表達(dá)（分別是正常組織的3.75 和2.87 倍，均P<0.01）?；贕PR171、HOXB3、HOXB5和HOXB6構(gòu)建膀胱癌患者的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型：風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=（－0.3654×GPR171 表達(dá)水平）+（－0.2885×HOXB3表達(dá)水平）+（－0.2885×HOXB5 表達(dá)水平）+（0.3087×HOXB6表達(dá)水平）。采用上述公式計(jì)算樣本的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分范圍為－2.41~－0.03，評(píng)分中位數(shù)為－0.83，根據(jù)中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分將膀胱癌患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，四個(gè)基因在高低風(fēng)險(xiǎn)組的表達(dá)見(jiàn)附圖9。

圖8 列線圖模型用于預(yù)測(cè)患者1、3、5年總存活率的校準(zhǔn)圖Figure 8 Calibration plots of nomogram models for predicting 1， 3， or 5 year overall survival rates

Kaplan-Meier 生存曲線提示，高風(fēng)險(xiǎn)組患者預(yù)后較差，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)（圖5A）。ROC 曲線分析結(jié)果顯示，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分預(yù)測(cè)患者1、3、5年總生存時(shí)間的曲線下面積分別為0.735、0.765、0.799，均超過(guò)0.7（圖5B）。在外部數(shù)據(jù)集GSE13507 中驗(yàn)證評(píng)分模型的預(yù)測(cè)價(jià)值，結(jié)果與前述一致，低風(fēng)險(xiǎn)組預(yù)后好（圖6A）；隨時(shí)間變化的ROC 曲線顯示，1年的AUC 為0.667，3年的AUC 為0.613，5年時(shí)AUC 為0.629（圖6B）。提示基于關(guān)鍵免疫細(xì)胞相關(guān)基因構(gòu)建的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型對(duì)于膀胱癌患者預(yù)后預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性較好。

2.6 膀胱癌預(yù)后評(píng)估列線圖的構(gòu)建和驗(yàn)證

單因素Cox 回歸分析結(jié)果顯示，年齡、T 分期、病理分期和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與患者的預(yù)后顯著相關(guān)；多因素分析顯示，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分、T 分期和病理分期是膀胱癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見(jiàn)表3。結(jié)合風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和臨床參數(shù)構(gòu)建列線圖，C 指數(shù)為0.72（圖7）；校準(zhǔn)曲線顯示，模型的預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際結(jié)果基本重合（圖8），提示列線圖對(duì)膀胱癌患者1、3、5年總存活率具有較好的預(yù)測(cè)效能。

表3 膀胱癌患者預(yù)后相關(guān)危險(xiǎn)因素分析結(jié)果Table 3 Analysis of prognostic risk factors in patients with bladder cancer

3 討 論

膀胱癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率較高且最致命的惡性腫瘤之一，腫瘤的高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)使得膀胱癌患者的預(yù)后較差，給社會(huì)和患者造成了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［2］。目前，手術(shù)結(jié)合膀胱內(nèi)灌注治療是非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的主要治療手段［12］。隨著對(duì)膀胱癌的免疫病理機(jī)制和腫瘤免疫微環(huán)境的進(jìn)一步了解，基于腫瘤免疫微環(huán)境調(diào)控的免疫治療已成為膀胱癌患者新的治療選擇［13］。腫瘤免疫微環(huán)境由許多具有抗腫瘤或促腫瘤活性的不同免疫細(xì)胞亞群組成。既往研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞作為先天免疫效應(yīng)細(xì)胞，在免疫治療中起著至關(guān)重要的作用，與免疫檢查點(diǎn)阻斷應(yīng)答有關(guān)［14-15］。Jiang等［16］通過(guò)巨噬細(xì)胞相關(guān)基因構(gòu)建并驗(yàn)證了預(yù)測(cè)膀胱癌患者預(yù)后的模型。除了巨噬細(xì)胞之外，CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞和B細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞參與機(jī)體免疫。這些細(xì)胞通過(guò)不同途徑促進(jìn)或抑制機(jī)體免疫微環(huán)境的形成，各個(gè)細(xì)胞間存在協(xié)同或抑制效應(yīng)，從而在腫瘤免疫中發(fā)揮作用。因此，系統(tǒng)研究免疫細(xì)胞在膀胱癌的作用具有重要意義。

隨著免疫檢查點(diǎn)抑制劑在臨床中的運(yùn)用，肌層浸潤(rùn)性膀胱癌患者能夠獲得更好的預(yù)后。PD-1（PDCD1）與腫瘤組織產(chǎn)生的PD-L1（CD274）結(jié)合，導(dǎo)致有限的宿主免疫應(yīng)答。PD-L1 抑制劑通過(guò)增加浸潤(rùn)的CD8+T 細(xì)胞水平，顯示出有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答［17］。T 淋巴細(xì)胞在癌癥的“免疫監(jiān)視”中發(fā)揮著重要作用，不僅通過(guò)表達(dá)多態(tài)性抗原受體以識(shí)別特異性抗原，還擁有效應(yīng)功能以及記憶特征［18-19］。因此，本研究以16 種免疫細(xì)胞為基礎(chǔ)，通過(guò)ssGSEA 算法量化了TGCA 膀胱癌隊(duì)列中免疫細(xì)胞的豐度，系統(tǒng)地探討了免疫細(xì)胞評(píng)分與膀胱癌患者治療及預(yù)后的關(guān)聯(lián)。通過(guò)無(wú)監(jiān)督聚類將膀胱癌基于免疫細(xì)胞評(píng)分分為兩個(gè)亞型，其中聚類2 患者的預(yù)后明顯優(yōu)于聚類1′患者。有報(bào)道稱，PD-L1 的高表達(dá)水平與膀胱癌腫瘤組織的惡性程度及不良預(yù)后顯著相關(guān)，且此類患者術(shù)后復(fù)發(fā)率較高［15］。本文資料顯示，PDCD1、CD28和CTLA4等重要免疫檢查點(diǎn)相關(guān)基因在聚類2 顯著上調(diào)，而免疫檢查點(diǎn)相關(guān)基因的表達(dá)與腫瘤免疫微環(huán)境顯著相關(guān)，低表達(dá)的免疫檢查點(diǎn)相關(guān)基因可能促進(jìn)腫瘤免疫逃逸［11］。阿特珠單抗是目前唯一批準(zhǔn)用于膀胱癌治療的PD-L1 抑制劑，但只有少數(shù)患者從免疫治療中受益［20］。本研究開(kāi)發(fā)的免疫評(píng)分聚類分型方法根據(jù)膀胱癌患者對(duì)PD-1 或CTLA4 抑制劑的敏感性進(jìn)行分層發(fā)現(xiàn)，聚類2 對(duì)PD-1 抑制劑和CTLA4 抑制劑聯(lián)合治療反應(yīng)更強(qiáng)，表明聚類2 是免疫有利亞群，聚類2 聚類中的患者更可能從阿特珠單抗治療中獲益。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)聚類2 對(duì)于部分化療藥物的半抑制濃度小于聚類1′，提示聚類2 的膀胱癌患者更容易從這些化療藥物中獲得臨床療效，避免更高劑量的化療藥物所致各種不良反應(yīng)。

為了更好地將這些相關(guān)免疫浸潤(rùn)評(píng)分應(yīng)用于臨床，本研究通過(guò)WGCNA 篩選出與關(guān)鍵免疫細(xì)胞顯著相關(guān)的基因，GO 富集分析顯示這些基因主要參與免疫細(xì)胞的分化與細(xì)胞因子產(chǎn)生的正向調(diào)節(jié)。KEGG 富集分析表明這些基因主要參與T 細(xì)胞受體信號(hào)通路。通過(guò)LASSO Cox 回歸進(jìn)一步篩選出四個(gè)與膀胱癌患者預(yù)后相關(guān)的基因。其中，GPR171 是一種G 蛋白偶聯(lián)受體，由神經(jīng)內(nèi)分泌途徑蛋白衍生的BigLEN 是GPR171 的內(nèi)源性配體。有研究顯示，GPR171 可調(diào)節(jié)攝食和焦慮行為［21］，并在多種腫瘤中被證實(shí)是T 淋巴細(xì)胞的特征基因［22-23］。研究發(fā)現(xiàn)，GPR171在腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中上調(diào)，且其在黑色素瘤患者中的表達(dá)可以預(yù)測(cè)患者接受免疫治療的反應(yīng)［24］。GPR171 在T淋巴細(xì)胞中的表達(dá)動(dòng)力學(xué)與其他免疫檢查點(diǎn)（如PD1、TIGIT、CD112R 和TIM36）非常相似，在T 淋巴細(xì)胞中GPR171 可上調(diào)并通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。此外，GPR171 信號(hào)的破壞可促進(jìn)T 淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫［25］。HOXB3、HOXB5 和HOXB6 都屬于HOXB 家族。HOXB基因家族是一個(gè)長(zhǎng)度約為180 bp的同源片段，編碼60 個(gè)氨基酸的同源結(jié)構(gòu)域，與轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)。HOXB 基因家族成員在腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和凋亡以及腫瘤的形成和發(fā)展中均起著至關(guān)重要的作用［26］。已有研究表明，多個(gè)HOXB 基因家族成員在膀胱癌、膽管癌、子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌種差異表達(dá)［27］，如ISL LIM 同源盒蛋白1 和LIM 同源盒蛋白5 在膀胱腫瘤中表達(dá)上調(diào)，并與腫瘤的發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［28］。HOXB3是一種蛋白編碼基因，與急性髓系白血病的一個(gè)生物學(xué)亞群顯著相關(guān)。乳腺癌和肺腺癌患者HOXB3 的表達(dá)與患者的預(yù)后相關(guān)。乳腺癌患者的HOXB3表達(dá)水平較低，往往預(yù)后較差［29］，而在肺腺癌中高表達(dá)HOXB3 的患者預(yù)后不良。研究發(fā)現(xiàn)，HOXB3 與惡性腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)［30］。在膀胱癌中，HOXB3與吉西他濱的耐藥性相關(guān)，并可作為膀胱癌患者預(yù)后的生物標(biāo)志物［29］。HOXB5 能夠與特定的DNA 側(cè)結(jié)合，從而影響器官發(fā)育和腫瘤發(fā)生中的關(guān)鍵信號(hào)通路［31］。據(jù)報(bào)道，HOXB5在腫瘤中表達(dá)失調(diào)，如HOXB5在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞表達(dá)上調(diào)，并通過(guò)增加基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲［32］。此外，HOXB5還具有通過(guò)激活Wnt/β-連環(huán)蛋白途徑促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌惡性進(jìn)展的能力［31］。在乳腺癌中，Zhang 等［33］報(bào)道HOXB5 的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力。研究證實(shí)，HOXB5在膀胱癌組織和細(xì)胞系中過(guò)度表達(dá)，并促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖和遷移［34］。HOXB6 在結(jié)直腸腫瘤中差異表達(dá)并可作為患者預(yù)后的生物標(biāo)志物［35］。研究表明，敲低HOXB6的表達(dá)能夠抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖［36］。此外，Huang等［37］報(bào)道了Hsa_circ_0007031 通過(guò)海綿miR-196a-5p 調(diào)節(jié)HOXB6 來(lái)促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖和遷移。目前關(guān)于HOXB6 與膀胱癌的研究還甚少，需要進(jìn)一步研究其機(jī)制。

本研究基于上述關(guān)鍵基因構(gòu)建了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型，并通過(guò)外部驗(yàn)證證實(shí)了該風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型的預(yù)測(cè)效能。結(jié)合臨床特征構(gòu)建的列線圖也展示出對(duì)膀胱癌患者預(yù)后較好的預(yù)測(cè)價(jià)值。與其他基因集構(gòu)建的膀胱癌預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型比較，本研究構(gòu)建的模型在預(yù)測(cè)膀胱癌患者5年存活率上有著更高的效能［38-39］。此外，相比Liang等［40］構(gòu)建的15個(gè)基因的模型，本研究構(gòu)建的模型納入的基因數(shù)較少，檢驗(yàn)難度小，便于臨床應(yīng)用。

綜上所述，本文系統(tǒng)研究了膀胱癌患者免疫細(xì)胞浸潤(rùn)狀態(tài)，并基于關(guān)鍵免疫細(xì)胞相關(guān)基因構(gòu)建了預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型，對(duì)膀胱癌患者的個(gè)體化治療具有重要意義。但是，由于樣本量有限，本研究中構(gòu)建的模型還需通過(guò)前瞻性、多中心、更大樣本的研究進(jìn)一步驗(yàn)證，并通過(guò)開(kāi)展相關(guān)功能體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探索關(guān)鍵免疫細(xì)胞和核心基因在膀胱癌中發(fā)揮作用的相關(guān)機(jī)制。

本文附圖見(jiàn)電子版。

志謝研究得到國(guó)家自然科學(xué)基金（82002675）、江蘇省科技計(jì)劃青年基金（BK2020938）、揚(yáng)州市重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目（YZ2020110）、揚(yáng)州市軟科學(xué)研究計(jì)劃（YZ2022267）、江蘇省博士后研究資助計(jì)劃（2020Z268）、揚(yáng)州大學(xué)高層次人才研究啟動(dòng)基金（2019LYF）支持

AcknowledgementsThis work was supported by the National Natural Science Foundation of China (82002675),Science and Technology Plan Youth Fund Project of Jiangsu Province (BK2020938), Key R&D Plan-Social Development Project of Yangzhou City (YZ2020110), Soft Science Research Plan of Yangzhou City (YZ2022267), Postdoctoral Research Funding Program of Jiangsu Province (2020Z268),and Yangzhou University High-level Talent Research Startup Fund (2019LYF)

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

Conflict of InterestsThe authors declare that there is no conflict of interests

?The author(s) 2024. This is an open access article under the CC BY-NC-ND 4.0 License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)