李德雨，胡穎超，劉 欣，于顧然

南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，江蘇 南京210029

AD是一種與年齡相關的神經(jīng)退行性疾病，由于全球人口老齡化加劇，AD 的患病率逐年升高，已成為全球性公共衛(wèi)生問題［1-2］。AD 的主要病理學特征為由Aβ組成的老年斑、過度磷酸化τ蛋白形成的神經(jīng)原纖維纏結以及突觸功能障礙［1］。

淀粉樣蛋白級聯(lián)假說一直被認為是AD 的主要發(fā)病機制之一，即AD 是由分泌酶對APP 切割導致Aβ 產(chǎn)生和清除之間不平衡所致［2］。淀粉樣斑塊沉積在細胞外，主要由APP 的兩種副產(chǎn)物Aβ40和Aβ42組成，其中Aβ42具有比Aβ40更高的成纖維率以及難溶性，Aβ42/Aβ40升高被認為是AD的典型特征［2-3］。此外，氧化應激也與AD 的發(fā)病有著密切聯(lián)系，受缺氧和線粒體功能障礙的影響，細胞內(nèi)活性氧生成增加［3-4］?；钚匝踉诩毎械乃娇梢哉{(diào)節(jié)細胞穩(wěn)態(tài)，低水平的活性氧可以作為信號分子，而高水平的活性氧則可引起細胞氧化損傷、細胞功能障礙及退行性變，而這可進一步促進AD的疾病進程［4-5］。氧化應激可表現(xiàn)為蛋白質氧化以及脂質過氧化，研究表明Aβ 可誘導體內(nèi)外神經(jīng)元及星形膠質細胞蛋白質氧化，Aβ1-42還可以誘導脂質過氧化，也就是說Aβ 沉積也可以促進氧化應激反應［1］。

知母（Anemarrhenae Rhizoma）為百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge.的干燥根莖，傳統(tǒng)醫(yī)學將其藥物作用歸納為清熱瀉火、滋陰潤燥［6］，現(xiàn)代藥理學認為知母及其活性成分具有抗癡呆、抗凋亡、抗氧化、抗炎、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用［5，7-8］，是治療AD 的中草藥之一。本研究通過網(wǎng)絡藥理學及實驗驗證探討知母改善AD的作用機制。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫和軟件

本研究參考的數(shù)據(jù)庫有TCMSP 數(shù)據(jù)庫（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）、OMIM數(shù)據(jù)庫（https：//omim.org/）、GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）、DrugBank 數(shù)據(jù)庫（https：//go.drugbank.com/）、STRING 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）等；使用的軟件有Venny 2.1 在線軟件作圖工具平臺（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）、Cytoscape 3.8.2軟件、R4.0.5軟件等。

1.2 材料、試劑和儀器

B95-8 細胞及人神經(jīng)上皮瘤SKNMC 細胞購于上海富衡生物科技有限公司。N2株系、CL4176株系秀麗隱桿線蟲（C. elegans）及線蟲食物尿嘧啶突變型大腸桿菌（E. coli）OP50均購自美國線蟲遺傳中心（Caenorhabditis Genetics Center）。知母購于江蘇省中醫(yī)院，已經(jīng)過藥劑師鑒定。將知母在純凈水中浸泡30 min，文火煎煮兩次，收集中藥液，離心、過濾取上清液進行成分分析（表1），并按照凍干機操作流程制備凍干粉，制備好的凍干粉置于－20 ℃保存。淋巴細胞分離液為天津灝洋華科生物科技有限公司產(chǎn)品；植物凝集素-M為上海懋康生物科技有限公司產(chǎn)品；20%胎牛血清為美國Gibco公司產(chǎn)品；環(huán)孢素A為上海弘順生物科技有限公司產(chǎn)品；Aβ1-42為美國CST公司產(chǎn)品；BACE1為湖南艾方生物科技有限公司產(chǎn)品；APP、PI3K、磷酸化PI3K、Akt、磷酸化Akt、GSK-3β、磷酸化GSK-3β、GAPDH、羊/兔二抗為武漢愛博泰克生物科技有限公司產(chǎn)品；NQO1、HO-1、β-肌動蛋白為武漢三鷹生物技術有限公司產(chǎn)品；百草枯、硫黃素S、β-巰基乙醇為上海凜恩科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；蛋白胨為英國OXOID 公司產(chǎn)品；氨芐青霉素、左旋咪唑為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；5-氟尿嘧啶為上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品。

表1 知母凍干粉中主要成分檢測結果Table 1 Main components of lyophilized powder of Anemarrhenae Rhizoma

凍干機（LYO QUEST-55）為西班牙Telstar 公司產(chǎn)品；酶標儀（ELX-800）、熒光酶標儀（Synergy HT）為美國Bio-Tek 公司產(chǎn)品；正置熒光顯微鏡（DS-Qi2）、倒置熒光顯微鏡（DS-Ri2）為日本Nikon公司產(chǎn)品；倒置相差顯微鏡（CKX41）、體視顯微鏡（SZ2-ILST）為日本Olympus 公司產(chǎn)品；伯樂凝膠成像儀（CHEMIDOC XRS+）為美國Bio-Rad 公司產(chǎn)品；線蟲培養(yǎng)箱（SPX-250B-Z）為上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司產(chǎn)品；恒溫振蕩儀（SKR1807-E）為美國Scilogex 公司產(chǎn)品；全自動樣品快速研磨儀（Tissuelyzer-FeII）為南京喬貝琳生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 網(wǎng)絡藥理學方法篩選和分析靶點

1.3.1 知母藥物活性成分及相關靶點篩選 在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中檢索“知母”的成分作為潛在活性成分，設定口服利用度≥30%、類藥性≥0.18，并獲取上述成分的結構，導入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫，取預測得分大于0的靶點作為藥物靶點。

1.3.2 AD 相關靶點及藥物-疾病共同靶點篩選 在OMIM、GeneCards、DrugBank 數(shù)據(jù)庫中以“Alzheimer’s disease”為關鍵詞進行檢索，獲得疾病作用靶點。在Venny2.1 在線軟件作圖工具平臺上輸入所篩選的藥物及疾病靶點，繪制韋恩圖，兩者取交集后獲得藥物-疾病共同靶點。

1.3.3 中藥-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡構建及分析 用Cytoscape 3.8.2 軟件構建“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡圖，使用Network Analyzer功能對知母的主要活性成分進行分析。使用Network Analyzer 對網(wǎng)絡圖進行拓撲分析，度值表示該成分與作用靶點的關聯(lián)個數(shù)，度值越大說明該成分越重要。

1.3.4 PPI 網(wǎng)絡構建及核心靶點分析 將上述藥物-疾病共同靶點輸入STRING 數(shù)據(jù)庫中進行檢索，設置蛋白種類為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值為0.4，獲取靶點相互作用的網(wǎng)絡關系數(shù)據(jù)，將其導入Cytoscape 軟件，繪制蛋白相互作用網(wǎng)絡圖，以節(jié)點的大小、顏色及其深淺變化代表度值的大小。將PPI 網(wǎng)絡導入Cystoscap 3.8.2中，通過Network Analyzer 工具進行拓撲分析，選取度值大于平均分的基因作為核心靶點，將前三十個靶點使用R 4.0.5繪制條形圖。

1.3.5 GO 和KEGG 通路富集分析 基于R 軟件使用Bioconductor 生物信息軟件包以P<0.05，Q<0.05 為標準進行關鍵靶基因GO 和KEGG 功能富集分析，并將結果以條形圖和氣泡圖形式輸出。

1.4 細胞實驗

1.4.1 外周血淋巴細胞提取及LCL 構建 外周血淋巴細胞提取自江蘇省中醫(yī)院于顧然教授門診中簡易智力狀態(tài)檢查量表評分18分以下的AD患者及社區(qū)醫(yī)院體檢中的健康體檢者（倫理審查號2020NL-102-03、2020NL-102-05）。結合文獻［9］中的方法，選擇轉化率較高的環(huán)孢素A 法構建體外LCL。經(jīng)患者知情同意后采集3 mL 抗凝全血與等量無血清RPMI-1640 培養(yǎng)基混勻，緩慢滴加于淋巴細胞分離液平面，800×g離心20 min，此時可以看見離心管里自上而下分為血漿層、淋巴細胞層、淋巴細胞分離液層和紅細胞層，小心吸出淋巴細胞層細胞加入10 mL 無血清RPMI-1640 培養(yǎng)基中混勻，200×g離心10 min，棄上清液，重復一次。將所得細胞沉淀加入2 mL 轉化培養(yǎng)基（終濃度為2 μg/mL 植物凝集素加入含20%胎牛血清、青-鏈霉素、RPMI-1640 的完全培養(yǎng)基）與1.2 mL EB 病毒溶液（B95-8 細胞反復凍融的細胞懸液）中并混勻，再轉入24 孔板中的兩個孔置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，每孔加入終濃度為2 μg/mL 的環(huán)孢素A 溶液。在5%二氧化碳、37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察細胞狀態(tài)，根據(jù)細胞狀態(tài)每3~6天半數(shù)換液，3~4 d可見細胞聚團、體積稍增大。成功構建的LCL如圖1 所示。

圖1 不同培養(yǎng)時期淋巴母細胞樣細胞系的形態(tài)Figure 3Morphology of lymphoblastoid cell line in different periods of in vitro culture

1.4.2 細胞培養(yǎng) B95-8 細胞、LCL 細胞使用含20%胎牛血清、青-鏈霉素、兩性霉素B 的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，根據(jù)細胞狀態(tài)，每3~6天半數(shù)換液；SKMNC 細胞使用含10%胎牛血清和青-鏈霉素的MEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，每1~2 天換液。所有細胞置于5%二氧化碳、37 ℃細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.4.3 MTT 法和CCK-8 法檢測SKNMC 細胞和LCL 細胞活性 采用MTT 法檢測SKNMC 細胞活性。SKNMC 細胞按1×104個/孔種植于96 孔板中，培養(yǎng)24 h 后加入濃度為25、50、75、100 mg/L 的知母凍干粉溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入20 μL MTT 溶液，避光培養(yǎng)4 h，離心后棄上清液，加入150 μL/孔DMSO 溶液并充分振蕩，酶標儀490 nm波長處測定吸光度值。

由于LCL 為懸浮細胞，為避免離心重懸引起的誤差，故選用CCK-8 法檢測。LCL 細胞按（7~8）×103個/孔種植于96 孔板中，正常對照為健康體檢者的LCL 細胞，模型對照為AD 患者的LCL細胞，其他組分別加入終濃度為25、50、75 mg/L知母溶液，24 h 后每孔加入10 μL CCK-8 溶液，繼續(xù)孵育2 h，用酶標儀在波長450 nm 處測定吸光度值。細胞活性（%）=（實驗組吸光度值－空白組吸光度值）/（正常對照組吸光度值－空白組吸光度值）×100%

1.4.4 LCL-SKNMC 細胞共培養(yǎng)模型的構建和細胞分組 將SKNMC 細胞種植于Transwell 小室下層，24 h 后觀察細胞形態(tài)，待其密度達70%以上時用于構建共培養(yǎng)模型，LCL 細胞種植于Transwell 小室上層進行共培養(yǎng)，其中正常對照組為健康體檢者的LCL 細胞，模型對照組為AD 患者的LCL 細胞，其他各組于模型對照組中加入不同濃度的知母溶液（25、50、75 mg/L），給藥24 h后用于后續(xù)實驗。

1.4.5 DCFH-DA探針檢測共培養(yǎng)模型中生成的活性氧 共培養(yǎng)模型加入不同濃度（25、50、75 mg/L）知母凍干粉溶液或1 mmol/LN-乙酰半胱氨酸，24 h 后移走上層LCL 細胞，PBS 清洗SKNMC 細胞，加入終濃度為10 μmol/L 的DCFHDA 溶液，繼續(xù)避光孵育20~30 min，棄上清液，PBS 洗三遍后，倒置熒光顯微鏡下拍照，采用Image J處理圖像。

1.4.6 免疫熒光染色檢測共培養(yǎng)模型中生成的Aβ1-42共培養(yǎng)模型加入不同濃度（25、50、75 mg/L）知母凍干粉溶液或1 mmol/LN-乙酰半胱氨酸，24 h 后移走上層LCL 細胞，PBS 清洗SKNMC 細胞，之后分別用4%多聚甲醛固定、0.3% Triton-X100通透各20 min，繼續(xù)用免疫熒光封閉液室溫封閉1 h，加入Aβ1-42抗體（1∶200），4 ℃避光孵育過夜。室溫復溫1 h，PBST洗三遍，加入熒光二抗孵育1 h，避光操作，之后加入DAPI 染色10 min，PBST 清洗后扣片，正置熒光顯微鏡下觀察并拍照，用Image J處理圖像。

1.4.7 蛋白質印跡法檢測共培養(yǎng)模型中蛋白表達 共培養(yǎng)模型常規(guī)處理后，PBS清洗細胞三次，細胞裂解液冰上裂解30 min，裂解后的細胞液超聲三次，每次15 s，4 ℃、13 225×g離心20 min，收集上清液，按照BCA 試劑盒測定蛋白濃度，細胞上清液加入SDS 上樣緩沖液，100 ℃煮10 min 并于－80 ℃保存。制備好的蛋白樣品加入10%~15% SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠中恒壓電泳，聚偏二氟乙烯恒流轉膜60 min，5%脫脂牛奶封閉1 h，與一抗（Aβ1-42、APP、BACE1、PI3K、磷酸化PI3K、Akt、磷酸化Akt、GSK-3β、磷酸化GSK-3β、NQO1、HO-1、GAPDH、β-肌動蛋白）結合，4 ℃孵育過夜。TBST 洗三次后與羊/兔二抗室溫孵育1 h，TBST 洗三次，ECL 化學發(fā)光法檢測，伯樂凝膠成像儀觀察條帶，Image Lab分析條帶灰度。

1.5 線蟲實驗

1.5.1 線蟲的培養(yǎng) 將線蟲置于涂有E.coliOP50的NGM 培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，其中N2 株系線蟲于20 ℃培養(yǎng)、CL4176 株系線蟲于16 ℃培養(yǎng)。待線蟲生長至產(chǎn)卵期時，使用限時產(chǎn)卵法或者次氯酸鈉裂解法同期化線蟲，同期化的線蟲用于實驗。

1.5.2 百草枯氧化脅迫實驗研究氧化應激狀態(tài)下線蟲的壽命 收集同期化的N2 線蟲，調(diào)整線蟲密度為20~25 條/10 μL 于96 孔板中培養(yǎng)，每孔含有E.coliOP50、氨芐青霉素、5-氟尿嘧啶，加入90 μL 知母凍干粉溶液使其終濃度為1~100 mg/mL，空白對照組加入等量培養(yǎng)基，恒溫振蕩儀培養(yǎng)24 h 后每孔加入終濃度為75 mmol/L 的百枯草［10］，充分混勻。12 h 觀察并記錄線蟲的存活數(shù)，直至線蟲全部死亡。每組設三個平行組。

1.5.3 壽命實驗研究正常狀態(tài)下線蟲的壽命 同期化N2 線蟲轉移至含有知母凍干粉溶液的NGM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，從轉移當天開始記錄，每兩天記錄線蟲的存活數(shù)及死亡數(shù)，直至線蟲全部死亡。每組設三個平行組。

1.5.4 熱應激實驗研究熱應激狀態(tài)下N2 線蟲的壽命 同期化的N2 線蟲于含有知母凍干粉溶液的NGM 培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h 后轉移至37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，每小時觀察并記錄線蟲數(shù)，直至線蟲全部死亡。每組設三個平行組。

1.5.5 癱瘓實驗研究CL4176 線蟲癱瘓時間 CL4176 轉基因線蟲體壁肌肉中轉入了人源性Aβ1-42基因，當生存溫度由16 ℃調(diào)整為23 ℃時，其體壁肌肉中可表達人源性Aβ1-42蛋白，表現(xiàn)出AD 樣的癱瘓表型［11］。同期化CL4176 線蟲，之后轉移至含有知母凍干粉溶液的NGM 培養(yǎng)基中再次同期化，16 ℃培養(yǎng)36 h 后于23 ℃培養(yǎng)28 h，觀察線蟲癱瘓情況，每兩小時記錄。每組設三個平行組。

1.5.6 DCFH-DA 探針檢測N2 線蟲生成的活性氧 按照1.5.1處理線蟲，M9緩沖液收集線蟲，加入終濃度為10 μmol/L 的DCFH-DA 溶液，避光孵育20 min，熒光酶標儀（激發(fā)波長為485 nm、發(fā)射波長為538 nm）測定熒光強度值，每十分鐘測量一次，連續(xù)測量2 h。

1.5.7 硫黃素S 染色檢測CL4176 線蟲咽部沉積的Aβ 按照1.5.1 培養(yǎng)CL4176 線蟲。收集線蟲，4%多聚甲醛4 ℃固定24 h，37 ℃下通透液（5% β-巰基乙醇、1% TritonX-100、12 mmol/L Tris，pH7.4）通透24 h，0.125%硫黃素S/50%乙醇溶液室溫避光染色2 min，50%乙醇脫色三次，每次2 min，M9 緩沖液清洗線蟲三次，之后用M9 緩沖液重懸線蟲。滴加線蟲于載玻片上，并加入左旋咪唑溶液麻痹線蟲。正置熒光顯微鏡觀察線蟲咽部Aβ 沉積數(shù)，Image J測量線蟲咽部面積，統(tǒng)計單位面積內(nèi)的Aβ沉積數(shù)［12］。

1.6 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 22.0和Graph Pad Prism 8.0統(tǒng)計分析。正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）描述，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，方差齊時使用Turkey 檢驗，方差不齊時使用Dunnett’s T3檢驗；計數(shù)資料采用例數(shù)（%）［n（%）］描述。使用Kaplan-Meier檢驗及Log-Rank（Mantel-Cox）對線蟲進行生存分析。

2 結 果

2.1 中藥-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡構建

對知母的有效成分進行篩選共得到15 個潛在活性成分（表2），將所篩選出的知母活性成分使用Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫篩選出518 個藥物靶點。以“Alzheimer’s disease”為關鍵詞分別在OMIM、GeneCards、DrugBank 數(shù)據(jù)庫進行檢索，去重后共獲得1014 個疾病靶點。將篩選出的518 個藥物靶點與1014 個疾病靶點輸入Venny 2.1 在線軟件，繪制韋恩圖，兩者取交集后獲得藥物-疾病共同靶點103 個（附圖1）。將知母中15個潛在活性成分和103 個藥物-疾病共同靶點輸入Cytoscape 軟件中，繪制出“藥物-成分-靶點-疾病”相互作用的網(wǎng)絡圖（圖2）。

表2 知母潛在活性成分Table 2 Potential active components of Anemarrhenae Rhizoma

圖2 藥物-成分-靶點-疾病相互作用的網(wǎng)絡圖Figure 2 Network diagram of drug-components-target-disease interactions

2.2 PPI網(wǎng)絡構建及分析

PPI 網(wǎng)絡圖如圖3 所示，將PPI 網(wǎng)絡進行拓撲分析，篩選出的核心靶點如圖4所示，知母可能通過ALB、Akt1、TNF、EGFR、VEGFA、mTOR、APP等相關靶點發(fā)揮抗AD作用。

圖3 知母作用于阿爾茨海默病相關靶點的蛋白質-蛋白質相互作用網(wǎng)絡Figure 3 Protein-protein interaction network of Anemarrhenae Rhizoma acting on Alzheimer’s disease related targets

圖4 知母作用于阿爾茨海默病的核心靶點分析結果Figure 4 Analysis of the core target of Anemarrhenae Rhizoma on Alzheimer’s disease

將103個共同靶點進行GO分析，結果顯示交集基因集合共富集至1857 條生物學過程通路、122 條細胞組分表達過程和150 個與分子功能相關的過程，每個部分均選取前二十個條目，結果見附圖2。所涉及的生物學過程主要包括細胞對單胺、兒茶酚胺刺激反應、對單胺、兒茶酚胺、多巴胺的反應、跨突觸信號傳導的調(diào)控、認知、蛋白質絲氨酸-蘇氨酸激酶活性的正調(diào)控、肽酪氨酸磷酸化、學習或記憶、神經(jīng)元死亡等過程；在細胞組分上主要作用于突觸前膜、突觸膜的組成部分、突觸膜、突觸前膜固有成分、γ-氨基丁酸受體復合物、氯離子通道復合體等；分子功能主要有神經(jīng)遞質、突觸后神經(jīng)遞質受體活性、藥物結合、G 蛋白偶練5-羥色胺、5-羥色胺受體活性、配體門控陰離子通道活性、γ-氨基丁酸受體活性、胰島素受體底物結合、蛋白磷酸酶結合等。

將103 個共同靶點經(jīng)R 語言運行后共得到140 條KEGG 通路，根據(jù)P<0.05 選取前二十條通路形成KEGG 功能富集分析圖。如附圖3 所示，主要涉及阿爾茨海默病、內(nèi)分泌抵抗、胰島素抵抗及多種癌癥等生物過程，以及神經(jīng)活性配體-受體相互作用、PI3K/Akt 信號通路、鈣信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路、紅細胞原癌基因B 信號通路等。

2.3 知母對SKMNC細胞及LCL活性的影響

與不加知母溶液的對照組比較，25、50、75 mg/L 知母組中SKNMC 細胞的活性分別為（98.7±8.6）%、（97.8±7.6）%、（96.3±7.3）%，較對照組無明顯下降（均P>0.05），而加入100 mg/L 知母后細胞活性下降至（85.3±1.9）%，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），因此選擇25、50、75 mg/L 濃度用于后續(xù)細胞實驗。進一步評估知母對LCL 的影響發(fā)現(xiàn)，在正常對照細胞中，與不加知母溶液的LCL 比較，加25、50、75 mg/L知母后LCL 的活性分別為（102.3±1.7）%、（103.9±6.5）%和（100.2±3.9）%，差異無統(tǒng)計學意義（均P>0.05）；在模型對照細胞中，與不加知母溶液的LCL 比較，加25、50、75 mg/L知母后LCL的活性分別為（101.6±1.3）%、（101.4±0.7）%和（101.4±4.1）%，差異無統(tǒng)計學意義（均P>0.05）。由此可見，25、50、75 mg/L 知母對SKMNC 和LCL 細胞活性均不會產(chǎn)生明顯影響。

2.4 知母對LCL-SKNMC共培養(yǎng)模型中活性氧、Aβ1-42生成以及Aβ 生成相關蛋白表達的影響

DCFH-DA 探針檢測結果顯示，與正常對照組比較，模型對照組可見明顯的活性氧積累（P<0.01），而不同濃度知母組活性氧積累較模型對照組明顯減少（均P<0.01），并表現(xiàn)出濃度相關性，N-乙酰半胱氨酸組的活性氧生成也較模型對照組明顯減少（P<0.01），見圖5、表3。免疫熒光染色結果顯示，與正常對照組比較，模型對照組可見較多的Aβ1-42生成（P<0.01），而知母組和N-乙酰半胱氨酸組Aβ1-42生成較模型對照組減少，其中50、75 mg/L知母組及N-乙酰半胱氨酸組的Aβ1-42生成量與模型對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（均P<0.01），見圖6、表3。蛋白質印跡法檢測結果顯示，與正常對照組比較，模型對照組BACE1、APP、Aβ1-42表達上調(diào)（均P<0.05），而各知母組上述蛋白的表達低于模型對照組，且呈現(xiàn)出濃度相關性，見圖7、表4。上述結果提示，知母可減少共培養(yǎng)模型中活性氧生成，減少Aβ1-42的產(chǎn)生，抑制Aβ 生成相關蛋白BACE1、APP、Aβ1-42的表達。

圖5 各組DCFH-DA探針檢測活性氧生成情況Figure 5 Reactive oxygen species production in each group（ DCFH-DA probe assay）

圖6 各組免疫熒光染色觀察Aβ1-42生成情況Figure 6 Aβ1-42 production in each group（ immunofluorescence staining）

圖7 各組Aβ相關蛋白表達電泳圖Figure 7 Electrophoretogram of Aβ-related proteins expression in each group

表3 各組共培養(yǎng)模型活性氧、Aβ1-42生成比較Table 3 Production of reative oxygen species and Aβ1-42 in co-culture models（±s，%）

表3 各組共培養(yǎng)模型活性氧、Aβ1-42生成比較Table 3 Production of reative oxygen species and Aβ1-42 in co-culture models（±s，%）

與正常對照組比較，**P<0.01；與模型對照組比較，##P<0.01.Aβ：β淀粉樣蛋白.

組 別正常對照組模型對照組25 mg/L知母組50 mg/L知母組75 mg/L知母組N-乙酰半胱氨酸組n333333活性氧100±13 227±24**121±7##98±4##86±9##85±10##Aβ1-42 100±4 499±48**435±33 309±66##105±21##112±19##

表4 各組共培養(yǎng)模型Aβ相關蛋白表達比較Table 4 Expression of Aβ related proteins in co-culture models（±s，%）

表4 各組共培養(yǎng)模型Aβ相關蛋白表達比較Table 4 Expression of Aβ related proteins in co-culture models（±s，%）

與正常對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型對照組比較，#P<0.05，##P<0.01. BACE：β-分泌酶；APP：淀粉樣前體蛋白；Aβ：β-淀粉樣蛋白；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶.

組 別正常對照組模型對照組25 mg/L知母組50 mg/L知母組75 mg/L知母組n33333 Aβ1-42/GAPDH 100±27 220±25*167±28 120±43#109±52#APP/GAPDH 100±9 152±6**105±15##91±13##80±19##BACE1/β-肌動蛋白100±15 153±5*103±15#96±24##97±13#

2.5 知母對LCL-SKNMC 共培養(yǎng)模型中PI3K/Akt/GSK-3β 通路相關蛋白表達的影響

結合網(wǎng)絡藥理學結果，進一步分析知母對PI3K/Akt/GSK-3β 通路相關蛋白表達的影響。與正常對照組比較，模型對照組PI3K、Akt、GSK-3β 磷酸化水平受到明顯抑制（均P<0.05），而加入知母各組上述蛋白的磷酸化水平得到逆轉，并呈現(xiàn)一定的濃度相關性，見圖8、表5。對抗氧化反應元件相關蛋白HO-1 和NQO1 進行檢測發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，模型對照組HO-1、NQO1 表達無明顯變化，但各知母組HO-1、NQO1 表達增加，見圖8、表5。結果提示，知母可通過調(diào)控PI3K/Akt/GSK-3β 通路促進抗氧化反應元件相關蛋白表達，發(fā)揮抗氧化作用。

圖8 各組Akt/GSK-3β通路相關蛋白表達電泳圖Figure 8 Electrophoretogram of Akt/GSK-3β pathway related protein expression

表5 各組Akt/GSK-3β通路相關蛋白表達比較Table 5 Comparison of effect of Anemarrhenae Rhizoma on the expression of Akt/GSK-3β pathway proteins in co-culture model（±s，%）

表5 各組Akt/GSK-3β通路相關蛋白表達比較Table 5 Comparison of effect of Anemarrhenae Rhizoma on the expression of Akt/GSK-3β pathway proteins in co-culture model（±s，%）

與正常對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型對照組比較，#P<0.05，##P<0.01. PI3K：磷脂酰肌醇3-激酶；Akt：蛋白激酶B；GSK：糖原合成激酶；HO：血紅素氧合酶；NQO：NAD（P）H醌氧化還原酶；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶.

組 別正常對照組模型對照組25 mg/L知母組50 mg/L知母組75 mg/L知母組n33333磷酸化PI3K/PI3K 100±14 31±7*60±18 101±29#171±29##磷酸化Akt/Akt 100±6 46±7**80±26 103±6#117±12##磷酸化GSK-3β/GSK-3β 100±28 19±3**70±23#76±15#117±12##NQO1/GAPDH 100±11 86±15 96±20 132±14#162±17#HO-1/GAPDH 100±25 100±26 117±26 133±17 192±49#

2.6 線蟲體內(nèi)實驗驗證知母對各種狀態(tài)下線蟲壽命的影響

知母濃度篩選實驗結果顯示，100 mg/mL 知母處理后N2 線蟲在氧化應激狀態(tài)下的最大生存時間明顯縮短（圖9），而10、20、40 mg/mL 知母可以延長N2 線蟲在正常、氧化應激和熱應激等狀態(tài)下的平均生存時間及最大生存時間（附圖4A~C 和表6），因此選擇10、20、40 mg/mL 濃度的知母用于后續(xù)線蟲實驗。

圖9 知母處理線蟲在氧化應激下的生存曲線Figure 9 Survival curve of N2 nematodes under oxidative stress after treatment with Anemarrhenae Rhizoma

表6 各組線蟲平均壽命及癱瘓時間比較Table 6 Comparison of lifespan and paralysis time of nematodes in each group

2.7 線蟲體內(nèi)實驗驗證知母對AD 活性氧產(chǎn)生的影響

DCFH-DA探針檢測結果顯示，隨著檢測時間的延長，每組線蟲體內(nèi)活性氧生成均呈現(xiàn)增加，其中模型對照組活性氧增加最快，而不同濃度知母和N-乙酰半胱氨酸均可減少線蟲體內(nèi)活性氧的生成，并存在濃度依賴性，見圖10。結果提示，知母可抑制百枯草誘導的N2線蟲體內(nèi)活性氧的增加，具有抗氧化作用。

圖10 各組線蟲加入DCFH-DA后熒光強度值變化Figure 10 Effect of different concentrations of Anemarrhenae Rhizoma on reactive oxygen species production in N2 nematodes

2.8 知母可延緩CL4176線蟲癱瘓及抑制Aβ 蛋白沉積

癱瘓實驗結果顯示，知母處理的CL4176線蟲癱瘓時間延后（附圖4D），其中20、40 mg/mL 知母處理組癱瘓時間與對照組差異有統(tǒng)計學意義（均P<0.05，表6），表明知母在一定程度上具有抗AD 作用。Aβ蛋白檢測結果顯示，未經(jīng)藥物處理的CL4176 線蟲可見咽部沉積大量Aβ 蛋白（100.0±5.9）%，而10、20和40 mg/mL 知母處理后CL4176 線蟲咽部Aβ 蛋白沉積分別減少至（77.7±5.2）%、（55.2±2.0）%和（51.3±9.0）%（均P<0.01），見圖11，表明知母可抑制CL4176 線蟲咽部Aβ 蛋白沉積，發(fā)揮抗AD作用。

圖11 各組線蟲硫黃素染色結果Figure 11 Effect of different concentrations of Anemarrhenae Rhizoma on Aβ protein deposition in CL4176 nematodes

3 討 論

AD 是一種大腦細胞退化的疾病，是造成癡呆的主要原因［13］，隨著全球人口老齡化進程加快，AD 患者數(shù)量呈逐年增加趨勢，嚴重影響社會和經(jīng)濟發(fā)展［14-15］。故而，尋找有效的藥物來延緩該疾病發(fā)生，對全社會意義重大。目前隨著中醫(yī)藥的廣泛運用，知母對該病的療效越來越得到肯定［16］，但其機制尚不明確。因此，本研究通過網(wǎng)絡藥理學方法及實驗驗證探索知母治療AD 的作用機制。

根據(jù)PPI 網(wǎng)絡結果，本研究篩選出ALB、Akt1、TNF、EGFR、VEGFA、mTOR、APP 等關鍵靶點，其中ALB、Akt1 的度值最高，提示這兩個靶點可能是知母治療AD 最關鍵靶點。其中ALB 多用于腫瘤研究［17］，而Akt1 常用于AD 研究。Akt1基因編碼的是絲氨酸/蘇氨酸激酶，細胞外的信號激活可通過PI3K 實現(xiàn)。KEGG 結果顯示，知母治療AD 通路中占比排序分別是神經(jīng)活性配體-受體相互作用、PI3K/Akt 信號通路、鈣信號通路、內(nèi)分泌抵抗、胰島素抵抗、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE/RAGE 信號通路等通路，這些信號通路與AD 的發(fā)病機制均相關。神經(jīng)系統(tǒng)中最基本的單位是神經(jīng)元，而神經(jīng)元是信息交流與學習的重要功能單位，神經(jīng)活性配體-受體相互作用是在記憶和學習方面起主要作用［18］。而PI3K/Akt 信號通路在AD 的發(fā)病機制中至關重要。有研究顯示，PI3K/Akt 信號通路的增強可加強自噬，從而增加Aβ 的清除［19］。另外，PI3K/Akt通路是與細胞防御相關的多功能典型信號通路，該通路的激活參與了氧化還原反應的調(diào)節(jié)，并在保護細胞免受氧化應激方面起著關鍵作用［20］。PI3K/Akt 信號通路還可以通過調(diào)控GSK-3β 磷酸化來影響APP 和Aβ 的生成，研究表明，GSK-3β是PI3K/Akt 通路下游的關鍵元件，與AD 中Aβ 沉積相關，Akt 介導的磷酸化可抑制其表達，抑制GSK-3β 活性可改善認知缺陷并降低氧化應激反應［20-21］?？寡趸磻挥诩毎酥?，當受到應激刺激時可被激活，導致抗氧化反應元件下游基因的轉錄和表達，包括抗氧化劑、抗氧化蛋白酶體、Ⅱ期解毒酶等［22］?？寡趸磻患せ詈髸鹂寡趸壜?lián)反應，幾種內(nèi)源性抗氧化酶，如HO-1、NQO1 在氧化應激級聯(lián)反應中可被進一步調(diào)節(jié)［23-24］，而這兩個蛋白是PI3K/Akt 信號通路中與氧化應激相關的重要蛋白［25-26］。在氧化應激條件下，細胞內(nèi)活性氧數(shù)增加，導致細胞膜結構和功能破壞［27］。中樞神經(jīng)系統(tǒng)極易受到氧化應激的影響，AD 患者大腦中存在過多的活性氧和生物活性物質，可以促進Aβ斑塊的沉積，Aβ蛋白在大腦中發(fā)揮破壞作用，包括降低突觸可塑性、抑制海馬的長期增強和產(chǎn)生活性氧等［23，28］。在AD 中，β-分泌酶和γ-分泌酶產(chǎn)生具有淀粉樣蛋白特征的APP成分，其中BACE1是參與APP代謝的β-分泌酶，可通過裂解APP生成Aβ［3，29］。隨著年齡的增長，β-分泌酶在AD 患者大腦中的表達水平也逐漸升高，在細胞模型中，氧化應激以及缺血缺氧、能量剝奪等情況均可促進BACE1的高表達［3］。

本研究通過細胞共培養(yǎng)實驗進行體外研究發(fā)現(xiàn)，模型對照組活性氧生成明顯增加，氧化應激增多，而知母可減少共培養(yǎng)模型SKNMC細胞中活性氧的生成，具有抗氧化作用；根據(jù)免疫熒光染色結果，與正常對照組比較，模型對照組可見較多的Aβ1-42生成，而各知母組減少了細胞中Aβ1-42生成，具有抗AD 作用；蛋白質印跡法檢測結果顯示，與正常對照組比較，模型對照組BACE1、APP、Aβ1-42表達上調(diào)，而各知母組上述蛋白的表達低于模型對照組，同時，知母可上調(diào)共培養(yǎng)模型SKNMC細胞中PI3K、Akt、GSK-3β 的磷酸化水平和HO-1及NQO1 蛋白的表達，即可通過PI3K/Akt/GSK-3β減輕AD LCL 誘導的毒性作用，增加抗氧化應激能力，從而發(fā)揮抗AD 作用。知母的上述作用機制在體內(nèi)研究中也得到了證實。在秀麗隱桿線蟲中，知母可延長正常狀態(tài)及應激狀態(tài)下線蟲的壽命，減少活性氧的積累，減少溫度誘導下CL4176 轉基因線蟲AD 樣癱瘓表型及咽部的Aβ沉積，具有抗AD作用。

綜上所述，本研究從網(wǎng)絡藥理學方面探討了知母治療AD的可能作用機制，并從細胞及線蟲層面驗證了知母可減少AD 中Aβ 的生成，減輕活性氧的積累，抑制氧化應激作用，起到一定的抗AD作用，有望為后續(xù)研究知母治療AD的相關作用機制及為相關藥物的研發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

本文附圖見電子版。

志謝研究得到國家重點研發(fā)計劃（2022YFC3501403）、江蘇省研究生科研與實踐創(chuàng)新計劃（KYCX23-2168）支持

AcknowledgementsThis work was supported by the National Key R&D Program of China (2022YFC3501403),and Jiangsu Graduate Student Research and Practice Innovation Program (KYCX23-2168)

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

Conflict of InterestsThe authors declare that there is no conflict of interests

?The author(s) 2024. This is an open access article under the CC BY-NC-ND 4.0 License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)