吳民華，吳子健，葉曉霞，譚靖怡，王 燊，黃瓊林

（1.廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東 湛江 524023；2.廣東醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 湛江 524023；3.廣東醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 湛江 524023）

葉綠體是植物的3 種質(zhì)體之一，廣泛存在于陸生植物、藻類以及一些原生生物，是細(xì)胞內(nèi)具有獨立遺傳體系和執(zhí)行光合作用的重要細(xì)胞器[1]。葉綠體基因組結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，為由1 個大單拷貝區(qū)（Large single copy，LSC）和1 個小單拷貝區(qū)（Small single copy，SSC）以及插隔在它們之間的1 對反向重復(fù)區(qū)（Inverted repeat，IR）組成的環(huán)狀四分體，通常編碼約130 個基因[2]。葉綠體基因組包含大量的遺傳信息，核苷酸置換速率適中、基因組大小適中，且各植物類群葉綠體基因組之間具有良好的共線性[3]。此外，IR 區(qū)經(jīng)常發(fā)生收縮和擴張，從而引起葉綠體基因組的變異和進(jìn)化[4]。葉綠體基因組已應(yīng)用于藥用植物的真?zhèn)舞b定[5]、系統(tǒng)進(jìn)化[6]、種屬譜系地理分析[7]等研究，已有露兜樹[8]、高良姜[9]、遠(yuǎn)志[10]等多種藥用植物相繼被報道。

雞矢藤（Paederia scandens）為茜草科（Rubiaceae）雞矢藤屬（Paederia）藤本植物，在我國南方地區(qū)分布廣泛，主產(chǎn)于廣東、廣西、福建、江西等嶺南省區(qū)[11]。雞矢藤以根或全草入藥，具有消食健胃、化痰止咳、清熱解毒、止痛的功效，常被用于治療飲食積滯、小兒疳積、熱痰咳嗽、熱毒瀉痢、咽喉腫痛等多種病癥[12]。雞矢藤主要含有揮發(fā)油類、環(huán)烯醚萜苷類、黃酮類等化學(xué)成分，其中環(huán)烯醚萜苷類成分活性顯著、結(jié)構(gòu)獨特，特別是其結(jié)構(gòu)中含有硫原子以及二聚體受到較多的關(guān)注[13]。目前，對雞矢藤的研究主要集中在化學(xué)成分及其藥理作用，而其葉綠體基因組等基因組學(xué)的報道尚少。鑒于此，擬分析雞矢藤葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)和基因組成等特征，比較雞矢藤和相關(guān)物種葉綠體基因組的差異，并探究它們之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，旨在從基因組層面為雞矢藤的種質(zhì)鑒別、遺傳多樣性、進(jìn)化發(fā)育等方面研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 雞矢藤的采集和處理

雞矢藤植株采集于廣東省梅州市興寧市葉南鎮(zhèn)，取約100 mg 葉片，采用磁珠法植物DNA 提取試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，貨號：CW2528）提取基因組DNA，并使用DNA 文庫制備試劑盒（美國因美納科學(xué)器材有限公司，貨號：FC-131-1024）制備DNA 測序文庫，隨后交由深圳惠通生物科技有限公司進(jìn)行雙端模式高通量測序。

1.2 葉綠體基因組的組裝和注釋

經(jīng)測序獲得的雞矢藤葉綠體基因組初始讀序，作質(zhì)檢和過濾處理后，分別利用SPAdes 3.11.0 和PLANN 軟件進(jìn)行序列拼接和基因注釋，并統(tǒng)計獲得注釋基因的數(shù)量和種類。采用BankIt 軟件將雞矢藤葉綠體基因組序列和注釋信息提交至GenBank，登記號為OQ784936。運用OGDRAW v1.3.1 軟件完成雞矢藤葉綠體基因組圈圖的繪制。

1.3 葉綠體基因組的特點分析

采用CodonW v1.3 軟件計算雞矢藤葉綠體基因組編碼區(qū)（Coding space，CDS）中全部密碼子的相對同義密碼子使用情況（Relative synonymous codon usage，RSCU），以評價雞矢藤葉綠體基因組的密碼子偏好性。RSCU 值越大，密碼子的使用頻次越高，若RSCU＞1，則認(rèn)為其是使用偏好性密碼子。參照黃瓊林[9]的方法，采用MISA v2.1 在線軟件檢索雞矢藤葉綠體基因組中含有的簡單重復(fù)序列（Simple sequence repeat，SSR），并分析其組成類型、分布等特點。

1.4 葉綠體基因組的比較分析

植物葉綠體基因組相鄰兩部分的分界處稱為邊界，因此，葉綠體基因組內(nèi)共有4 個邊界，分別稱為JLB（LSC-IRB）、JSB（SSC-IRB）、JSA（SSC-IRA）和JLA（LSC-IRA）。使用IRscope 軟件對雞矢藤、高山野丁香（Leptodermis forrestii）、茜草（Rubia cordifolia）、鉤藤（Uncaria rhynchophylla）、海巴戟天（Morinda citrifolia）進(jìn)行4 個邊界的比較分析，隨后使用Perl腳本將上述5 種植物的葉綠體基因組序列轉(zhuǎn)換并導(dǎo)入mVISTA 軟件進(jìn)行序列差異分析以及結(jié)果的可視化。

1.5 系統(tǒng)進(jìn)化分析

從GenBank 下載茜草科植物雞矢藤、薄皮木（Leptodermis oblonga）、高山野丁香、管萼野丁香（Leptodermis ludlowii）、柔枝野丁香（Leptodermis gracilis）、糙葉野丁香（Leptodermis scabrida）、拉薩野丁香（Leptodermis hirsutiflora）、茜草、柄花茜草（Rubia podantha）、紫參（Rubia yunnanensis）、拉拉藤（Galium spurium）、巴戟天（Morinda officinalis）、海巴戟天、虎刺（Damnacanthus indicus）、鉤藤、毛鉤藤（Uncaria hirsute）、大葉鉤藤（Uncaria macrophylla）、白鉤藤（Uncaria sessilifructus）、攀莖鉤藤（Uncaria scandens），忍冬科植物長白忍冬（Lonicera ruprechtiana）、女貞葉冬忍（Lonicera ligustrina）、小葉忍冬（Lonicera microphylla）、唐古特忍冬（Lonicera tangutica），敗醬科植物少蕊敗醬（Patrinia monandra）、巖敗醬（Patrinia rupestris）、白花敗醬（Patrinia villosa）、糙葉敗醬（Patrinia scabra）以及單子葉植物芭蕉（Musa basjoo，用作外群）的葉綠體基因組序列。將所有序列導(dǎo)入MAFFT v7.427 軟件進(jìn)行序列多重比對，然后使用RAxML 8.2.12 軟件構(gòu)建最大似然法進(jìn)化樹，其中建樹模型為GTRGAMMA、自展檢驗值為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞矢藤葉綠體基因組的測序質(zhì)量

雞矢藤葉綠體基因組高通量測序產(chǎn)出15 057 915 條初始讀序，將低質(zhì)量序列、文庫構(gòu)建時附加的接頭序列及含有無法確定堿基的序列去除后，獲得15 010 950條待分析讀序，測序有效率達(dá)到99.7%，平均堿基測序錯誤率約為0.03%。識別正確率＞99%的堿基占比97.0%，識別正確率＞99.9%的堿基占比91.6%。本次測序的平均測序深度為2 115×，顯著高于后續(xù)序列拼接要求的100×。整體而言，雞矢藤葉綠體基因組測序質(zhì)量較佳。

2.2 雞矢藤葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)和組成

如圖1 所示，雞矢藤葉綠體基因組為153 456 bp 的環(huán)狀雙鏈四分體結(jié)構(gòu)，GC 含量為37.7%，依次由83 542 bp 的LSC、26 513 bp 的IRA、16 888 bp 的SSC 和26 513 bp 的IRB 排列而成，其中IRA和IRB的序列互相反向重復(fù)。

圖1 雞矢藤葉綠體基因組Fig.1 Chloroplast genome of P.scandens

雞矢藤葉綠體基因組含有133 個基因，分別由88 個蛋白質(zhì)編碼基因（Protein-coding gene，PCG）、8個核糖體RNA（Ribosomal RNA，rRNA）和37 個轉(zhuǎn)運RNA（Transfer RNA，tRNA）組成（表1）。其中，PCG 中的atpF、petB、petD、ndhA、ndhB、rpl16、rps16、rpoC1，以及tRNA 中的trnK-UUU、trnV-UAC、trnLUAA、trnG-UCC、trnI-GAU、trnA-UGC具有1個內(nèi)含子，PCG 中的ycf3、clpP則存在2 個內(nèi)含子。雞矢藤葉綠體基因組中有19 個基因為雙拷貝基因，包括PCG 中的ndhB、rps7、rpl2、rpl22、rpl23、ycf1、ycf2、ycf15，所有rRNA 以及tRNA 中的trnl-CAU、trnLCAA、trnV-GAC、trnI-GAU、trnA-UGC、trnR-ACG、trnNGUU，余下基因則是單拷貝基因。

表1 雞矢藤葉綠體基因組基因及其注釋信息Tab.1 Genes summary in P.scandens chloroplast genome

2.3 雞矢藤葉綠體基因組的密碼子偏好性分析

雞矢藤葉綠體基因組有26 983 個密碼子，包括氨基酸編碼密碼子61 種26 895 個以及終止密碼子3 種88 個。其中，編碼亮氨酸的密碼子最多，達(dá)2 934 個；編碼半胱氨酸的密碼子最少，僅304 個。所有密碼子及其RSCU 值見圖2，UUA 的RSCU 值最高，為1.81，是雞矢藤葉綠體基因組使用頻次最多的密碼子；而AGC 的RSCU 值最小，為0.37，是雞矢藤葉綠體基因組使用頻次最少的密碼子。在雞矢藤葉綠體基因組中，RSCU＞1 的密碼子有31 種，以A∕T（U）結(jié)尾的有29 種，占比93.5%；RSCU＞1.5 的密碼子共12 種，全部是以A∕T（U）結(jié)尾，說明雞矢藤葉綠體基因組在進(jìn)化過程中偏好使用第3 位是A∕T（U）的密碼子。

圖2 雞矢藤葉綠體基因組的相對同義密碼子使用情況Fig.2 Relative synonymous codon usage in chloroplast genome of P.scandens

2.4 雞矢藤葉綠體基因組的SSR分布和組成

如表2 所示，通過預(yù)設(shè)參數(shù)在雞矢藤葉綠體基因組中找到54 個SSR，包括36 個單核苷酸、8 個二核苷酸、4 個三核苷酸、4 個四核苷酸、1 個五核苷酸和1 個六核苷酸（表2）。雞矢藤葉綠體基因組各類SSR均是以A∕T及其組合居多，而且A∕T單核苷酸占比最高（33∕54，61.1%）。這些SSR 均分布在單拷貝區(qū)，其中45 個在LSC，9 個在SSC，而IR 區(qū)沒有SSR位點。從所在位置來看，位于基因間隔區(qū)（Intergenic space，IGS）最多，有31個；其次是在基因內(nèi)含子（Intron）內(nèi)，為13 個；最少的是在基因CDS區(qū)，只有10個。

表2 雞矢藤葉綠體基因組SSR信息Tab.2 SSR information in P.scandens chloroplast genome個

2.5 雞矢藤葉綠體基因組的IR邊界比較

對雞矢藤、高山野丁香、茜草、鉤藤、海巴戟天等5 種茜草科植物的葉綠體基因組進(jìn)行邊界分析，結(jié)果如圖3 所示。雞矢藤和高山野丁香的JLB 位于基因間隔區(qū)，分別在rps19和rpl2、rps19和trnH基因之間，而其余3 種植物的JLB 均落在rps19基因內(nèi)。雞矢藤的JSB 處于ycf1和ndhF基因的重疊區(qū)域，高山野丁香和茜草的JSB 落在ndhF基因內(nèi)，鉤藤和海巴戟天的JSB 則位于trnN和ndhF基因的間隔區(qū)。除了鉤藤的JSA 位于rps15和trnN基因的間隔區(qū)外，其余4 種植物的JSA 均落在ycf1基因內(nèi)。與海巴戟天的JLA落在trnH基因內(nèi)不同，另外4種植物的JLA均處于基因間隔區(qū)，其中高山野丁香的JLA 在trnH和psbA基因之間，其他的在rpl2和trnH基因之間。由此可見，IR 收縮和擴張在茜草科5 種植物葉綠體基因組中引起較明顯的差異。

圖3 茜草科5種植物的葉綠體基因組IR邊界的比較Fig.3 Comparison on boundaries of IR in chloroplast genomes of five Rubiaceae species

2.6 雞矢藤葉綠體基因組的序列比對

對雞矢藤、高山野丁香、茜草、鉤藤和海巴戟天等5 種茜草科植物葉綠體基因組進(jìn)行全序列比對，結(jié)果經(jīng)可視化后如圖4 所示。在5 種植物葉綠體基因組中，編碼區(qū)的序列相似度較高，大多數(shù)基因的同源性達(dá)到90%以上，而基因間隔區(qū)和內(nèi)含子等非編碼區(qū)存在明顯的堿基突變或缺失。

圖4 茜草科5種植物葉綠體基因組序列差異分析Fig.4 Sequence divergence among chloroplast genomes from five Rubiaceae species

2.7 基于葉綠體基因組的雞矢藤系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用葉綠體基因組序列建立的雞矢藤系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖5 所示。雞矢藤的3 條葉綠體基因組序列最先聚集在一起，形成雞矢藤屬分支，說明葉綠體基因組序列在雞矢藤種內(nèi)具有高度的同源性。隨后雞矢藤屬再與野丁香屬匯成雞矢藤族分支，繼而與茜草族、巴戟天族聚成茜草亞科，最終與金雞納亞科共同構(gòu)成茜草科分支。忍冬科、敗醬科植物也單獨形成分支。系統(tǒng)進(jìn)化樹清晰地展現(xiàn)了雞矢藤在茜草科內(nèi)的進(jìn)化位置，聚類效果良好。

圖5 雞矢藤等植物的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree among various plants including P.scandens

3 結(jié)論與討論

雞矢藤在我國已有上千年的藥用歷史，鑒于其藥用價值，針對其進(jìn)行資源保護(hù)和產(chǎn)品開發(fā)可以產(chǎn)生較高的經(jīng)濟(jì)和社會效益。本研究開展雞矢藤葉綠體基因組測序及其序列解析，有望促進(jìn)雞矢藤種質(zhì)鑒定、居群多樣性、分子植物育種等方面的深入研究。雞矢藤葉綠體基因組包括LSC、IRA、SSC 和IRB 4 個區(qū)域，總長度為153 456 bp。雞矢藤葉綠體基因組共編碼133 個基因，除了少數(shù)基因功能未知外，這些基因多與雞矢藤光合作用以及葉綠體自我復(fù)制相關(guān)。雞矢藤的葉綠體基因組結(jié)構(gòu)特征和基因組成與銹毛莓[14]、紫參[15]等大多數(shù)植物相似，符合植物葉綠體基因組典型特征。

密碼子偏好性是指物種在長期的進(jìn)化過程中受自然選擇、堿基突變、基因漂變等多種因素影響而形成有的密碼子使用頻率明顯高于其他同義密碼子的現(xiàn)象[16]。在雞矢藤葉綠體基因組中，使用頻次較高的密碼子（RSCU＞1）幾乎都是以A∕T結(jié)尾（占比93.5%），使用頻次高的密碼子（RSCU＞1.5）全部是以A∕T 結(jié)尾，表明雞矢藤葉綠體基因組在進(jìn)化過程中出現(xiàn)了一定的密碼子使用偏好性，傾向使用末位堿基是A∕T 的密碼子。此情況也出現(xiàn)在千果欖仁[17]、豇豆[18]等植物中。

SSR標(biāo)記為共顯性標(biāo)記，具有種類豐富、多態(tài)性高和試驗可操作性強等特點，被認(rèn)為是研究品種鑒定、進(jìn)化和親緣關(guān)系的理想DNA 標(biāo)記之一[19]。雞矢藤葉綠體基因組共含有54 個SSR，主要分布在LSC和IGS，且以A∕T 單核酸重復(fù)基序最多，與雞矢藤葉綠體基因組的低GC 含量相符。雞矢藤葉綠體基因組SSR 的組成和分布與遠(yuǎn)志[10]、祁連圓柏[20]等多種植物類似。

序列比對結(jié)果表明，雞矢藤等5 種茜草科植物在IR邊界以及基因間隔區(qū)、內(nèi)含子等非編碼區(qū)均有堿基差異，且非編碼區(qū)的變異水平更高，說明葉綠體基因組在茜草科不同屬的植物之間有著顯著的序列變異，對茜草科植物有較好的分類效果。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，本研究測序所得的雞矢藤葉綠體基因組序列與2條從GenBank 下載的序列之間出現(xiàn)先后聚集情況，說明3條序列并非完全一致，即葉綠體基因組在雞矢藤中存在種內(nèi)差異，提示葉綠體基因組是探究不同居群∕產(chǎn)地雞矢藤之間遺傳多樣性的潛在方法。

本研究較為全面地解析了雞矢藤葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)組成和序列特點，比較了雞矢藤與茜草科相關(guān)物種的葉綠體基因組差異，并基于葉綠體基因組序列探討了雞矢藤在茜草科的進(jìn)化位置，可為今后雞矢藤的品種栽培、進(jìn)化發(fā)育、分子輔助育種等資源保護(hù)和利用研究提供基因組材料。