李丹丹 劉 虹 陳亞君 李福東 耿凡毅

肺是人體重要的呼吸器官,具有氣體交換和防御等功能,在感染、有毒化學(xué)物質(zhì)、放射等各種因素導(dǎo)致肺損傷后,肺組織中的各種常駐干細(xì)胞會迅速增殖分化為各種功能性肺組織細(xì)胞,從而改善肺功能[1]。近年來,越來越多的研究表明,肺常駐干細(xì)胞在肺修復(fù)過程中發(fā)揮著重要的作用。肺在解剖結(jié)構(gòu)上可細(xì)分為4個不同的區(qū)域:氣管、支氣管、細(xì)支氣管和肺泡,在肺修復(fù)過程中,每個區(qū)域的穩(wěn)態(tài)由區(qū)域特異性常駐干細(xì)胞保證,這些細(xì)胞及其分化的后代在穩(wěn)態(tài)條件下表現(xiàn)出穩(wěn)定的特性,但在損傷后可以顯示出強(qiáng)大的修復(fù)潛能[2]。研究者通過鑒定細(xì)胞標(biāo)志物、體內(nèi)譜系追蹤分析及體外類器官培養(yǎng)等方式增加了對肺常駐干細(xì)胞的認(rèn)識[3]。多項(xiàng)研究表明,在肺常駐干細(xì)胞修復(fù)肺損傷的過程中,多種信號通路參與其中并發(fā)揮著重要作用。

一、不同區(qū)域的肺常駐干細(xì)胞

1.近端氣管常駐干細(xì)胞:氣管由假復(fù)層柱狀上皮組成,包括基底細(xì)胞(basal cell,BC)、分泌細(xì)胞和纖毛細(xì)胞等。氣管功能包括感知環(huán)境、分泌、再生、排斥感染、處理毒素和清除碎片等。基底細(xì)胞和表達(dá)Scgb1a1的分泌細(xì)胞被認(rèn)為是參與氣管損傷修復(fù)的常駐干細(xì)胞群[4]。

(1)基底細(xì)胞:基底細(xì)胞是具有自我更新和多向分化潛能的多能干細(xì)胞。作為氣管的常駐干細(xì)胞,基底細(xì)胞在體內(nèi)穩(wěn)態(tài)時通常保持靜止?fàn)顟B(tài),當(dāng)發(fā)生急性肺損傷時,基底細(xì)胞短時間內(nèi)可迅速增殖,并分化為多種氣管上皮細(xì)胞維持氣管結(jié)構(gòu)和功能[5]。Zuo等[6]通過支氣管鏡刷取人支氣管上皮細(xì)胞,從中分離出高度表達(dá)SOX9的基底細(xì)胞,將體外擴(kuò)增的人SOX9 BC移植到博來霉素誘導(dǎo)肺損傷的小鼠肺中,可以觀察到BC分化為肺泡細(xì)胞和細(xì)支氣管上皮細(xì)胞,包括分泌細(xì)胞和纖毛細(xì)胞,有效地阻斷了肺纖維化的進(jìn)展,從而改善小鼠的肺功能,并且將人SOX9 BC移植到支氣管擴(kuò)張患者的肺中,可以極大地改善患者的癥狀,證明了基底細(xì)胞具有修復(fù)能力,為以后的干細(xì)胞療法提供了治療思路。

(2)分泌細(xì)胞:表達(dá)Scgb1a1的分泌細(xì)胞分布在氣管內(nèi),顯示出有限的干細(xì)胞特性。當(dāng)氣管損傷時,分泌細(xì)胞以緩慢的速度自我更新并分化為纖毛細(xì)胞,但不能產(chǎn)生其他類型的細(xì)胞[7]。分泌細(xì)胞在基底細(xì)胞選擇性耗盡后表現(xiàn)出穩(wěn)定地去分化為基底樣細(xì)胞的潛能,這些基底樣細(xì)胞是多能的,在二氧化硫或流感病毒感染引起的氣道損傷后,這些細(xì)胞可以分化為基底細(xì)胞、分泌細(xì)胞和纖毛細(xì)胞來再生氣管上皮[4]。

2.細(xì)支氣管常駐干細(xì)胞:細(xì)支氣管常駐干細(xì)胞包括神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞(pulmonary neuroendocrine cell,PNEC)、v-分泌細(xì)胞、支氣管肺泡干細(xì)胞(bronchioalveolar stem cell,BASC)、遠(yuǎn)端氣道干細(xì)胞(distal airway stem cell,DASC)等。

(1)神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞:神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞被證明是體內(nèi)基底細(xì)胞的后代,通常聚集在神經(jīng)內(nèi)分泌體(neuroendocrine bodies,NEBs)中,具有作為干細(xì)胞的增殖和分化潛能。在萘誘導(dǎo)的嚴(yán)重肺損傷后,PNEC增殖并分化為分泌細(xì)胞和纖毛細(xì)胞以促進(jìn)上皮細(xì)胞修復(fù)[8]。

(2)v-分泌細(xì)胞:v-分泌細(xì)胞是細(xì)支氣管的常駐干細(xì)胞之一,在大多數(shù)分泌細(xì)胞凋亡后促進(jìn)細(xì)支氣管的修復(fù)和再生。在萘誘導(dǎo)損傷的小鼠模型中可觀察到大部分分泌細(xì)胞凋亡,并且研究者通過譜系追蹤研究確定了分泌細(xì)胞的亞群:v-分泌細(xì)胞[7]。v-分泌細(xì)胞可以在兩個區(qū)域觀察到:毗鄰NEBs和小鼠的支氣管肺泡連接處(bronchioalveolar duct junction,BADJ)。與大部分分泌細(xì)胞比較,v-分泌細(xì)胞特征性地表達(dá)高水平的Scgb3a2和Upka3, 而Scgb1a1表達(dá)水平很低[7]。在穩(wěn)態(tài)或輕度至中度損傷期間,v-分泌細(xì)胞對細(xì)支氣管上皮再生的貢獻(xiàn)很小。而在萘介導(dǎo)的嚴(yán)重肺損傷之后,位于NEBs和BADJ附近的v-分泌細(xì)胞顯著地促進(jìn)了細(xì)支氣管上皮的修復(fù)和再生[7]。這表明,肺損傷的類型和嚴(yán)重程度可能有助于觀察細(xì)胞來源和再生程度。

(3)支氣管肺泡干細(xì)胞:支氣管肺泡干細(xì)胞位于支氣管肺泡導(dǎo)管連接處,表達(dá)Scgb1a1和SPC,可以分化為多種上皮細(xì)胞[7]。多項(xiàng)研究表明,BASC在體外3D培養(yǎng)21天后可形成細(xì)支氣管樣和肺泡樣結(jié)構(gòu)[9]。在細(xì)支氣管或肺泡損傷的動物模型中,BASC可以分別分化為分泌細(xì)胞和纖毛細(xì)胞或肺泡細(xì)胞來修復(fù)遠(yuǎn)端氣道和肺泡[10, 11]。

(4)遠(yuǎn)端氣道干細(xì)胞:遠(yuǎn)端氣道干細(xì)胞是分布在小鼠和人遠(yuǎn)端氣道基底上皮中的表達(dá)TP63和KRT5的干細(xì)胞群,可以自我更新并分化為肺泡和支氣管上皮細(xì)胞來促進(jìn)肺修復(fù)[12]。DASC已被證明在肺損傷后具有強(qiáng)大的再生能力,在H1N1流感病毒感染后, DASC激活并增殖,沿遠(yuǎn)端氣道遷移到肺泡區(qū)域并形成“豆莢”。這些“豆莢”可以密封損傷的肺泡屏障,從而根據(jù)損傷程度向成熟上皮和組織的再生分化[2]。將小鼠DASC移植到博來霉素誘導(dǎo)肺損傷的小鼠模型中,可以觀察到DASC增殖并分化成1型肺泡上皮細(xì)胞,通過減弱膠原蛋白的沉積抑制肺纖維化,極大地改善了肺纖維化小鼠的肺功能并降低了小鼠死亡率[13]。

3.肺泡常駐干細(xì)胞:肺泡細(xì)胞由1型肺泡細(xì)胞(alveolar type 1 cell,AT1)和2型肺泡細(xì)胞(alveolar type 2 cell,AT2)組成。AT1是薄而扁平的細(xì)胞,覆蓋95%的肺泡表面,表達(dá)AQP5、PDPN、和HOPX等標(biāo)志物。AT2細(xì)胞分泌肺表面活性劑,以降低肺的表面張力并維持肺泡穩(wěn)態(tài)[14]。SPC是AT2的特異性標(biāo)志物。

(1)1型肺泡細(xì)胞:AT1通常被認(rèn)為是一種終末分化并處于靜止?fàn)顟B(tài)的細(xì)胞類型,但有研究表明在肺損傷后,AT1有再生肺泡的潛能。在3D類器官培養(yǎng)中,單個HOPX AT1細(xì)胞能夠產(chǎn)生包含AT1和AT2細(xì)胞的類器官[4]。對AT1和AT2進(jìn)行譜系追蹤發(fā)現(xiàn),高氧或低氧誘導(dǎo)新生小鼠肺損傷后, AT2再生能力有限,而AT1表現(xiàn)出強(qiáng)大的再生能力,可分化為AT2促進(jìn)肺泡修復(fù)[15]。

(2) 2型肺泡細(xì)胞:AT2在損傷期間充當(dāng)肺泡上皮的干細(xì)胞,通常保持靜止?fàn)顟B(tài),在損傷后被激活并表現(xiàn)出顯著的再生能力,以恢復(fù)肺泡在穩(wěn)態(tài)和再生狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)和功能[14]。在銅綠假單胞菌誘導(dǎo)的肺損傷后的修復(fù)階段,Liu等[16]通過譜系追蹤分析鑒定出表達(dá)干細(xì)胞抗原Sca-1的AT2,與Sca-1 陰性的AT2比較,Sca-1 AT2具有相對顯著的增殖效率和分化成AT1的潛力。Nabhan等[17]通過觀察Wnt靶基因Axin2在小鼠肺中的表達(dá),鑒定出罕見的AT2亞群:表達(dá)Axin2的AT2細(xì)胞,Axin2 AT2具有干細(xì)胞潛能,在肺損傷后迅速擴(kuò)增并產(chǎn)生AT1和AT2細(xì)胞再生肺泡。

二、相關(guān)通路研究進(jìn)展

多項(xiàng)研究揭示了各種信號通路參與肺損傷后的修復(fù)過程,如 Wnt、Notch、Hippo等通路。

1.Wnt通路:Wnt通路在肺組織的干細(xì)胞增殖和分化中起著重要的作用。Wnt通路可分為經(jīng)典Wnt路(Wnt/β-catenin通路)和非經(jīng)典Wnt通路(Wnt/Ca2+通路、Wnt/PCP通路)[4]。成年小鼠氣管損傷后,基底細(xì)胞內(nèi)激活經(jīng)典Wnt通路促進(jìn)肺修復(fù),而抑制Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)降低了基底細(xì)胞的增殖速率并阻礙了肺氣道上皮的再生[18]。在萘誘導(dǎo)的肺損傷中,Wnt配體(Wnt3A、Wnt5A和Wnt7B)在修復(fù)的早期階段在分泌細(xì)胞中上調(diào),激活 Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可導(dǎo)致BASC數(shù)量大幅增加[4]。肺氣腫患者或小鼠肺泡的Wnt/β-catenin蛋白活性降低,從肺氣腫小鼠模型中分離的遠(yuǎn)端氣道干細(xì)胞及肺泡類器官形成能力受損,使用Wnt激動劑激活Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo),遠(yuǎn)端氣道干細(xì)胞的類器官形成能力顯著提高,同時,肺泡類器官的數(shù)量增加[18]。Axin2 AT2通過Wnt/β-catenin通路積極參與肺修復(fù)。Axin2 AT2可促進(jìn)離體肺類器官的形成,激活Wnt信號通路會引起Axin2 AT2自我更新反應(yīng),并增強(qiáng)肺類器官增殖,而抑制Wnt信號減慢了肺類器官形成及Axin2 AT2擴(kuò)增,反而有利于Axin2 AT2向AT1分化[17]。同時,Raslan等[19]在分泌細(xì)胞和AT2中檢測到強(qiáng)烈的R-spondin2(Rspo2)表達(dá),Rspo2是Wnt通路的激活因子。在離體3D類器官培養(yǎng)中,Rspo2通過激活Wnt信號通路促進(jìn)肺泡類器官形成和分化。萘誘導(dǎo)的小鼠氣道損傷后,Rspo2表達(dá)顯著下降,同時他們觀察到缺乏Rspo2基因的小鼠在萘誘導(dǎo)的肺損傷后表現(xiàn)出明顯的氣道再生缺陷。了解Wnt信號通路參與干細(xì)胞增殖與分化過程為利用肺常駐干細(xì)胞治療肺部疾病提供了新的思路。

2. Notch通路:Notch通路對肺上皮的穩(wěn)態(tài)和修復(fù)至關(guān)重要。這條通路由4個受體(Notch1、Notch2、Notch3和Notch4)、5個典型配體(Jagged1和Jagged2)以及Delta樣配體(Dll1、Dll3和Dll4)組成[20]?；准?xì)胞是氣道修復(fù)過程中的主要干細(xì)胞群,受到Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的強(qiáng)烈影響。Notch通路是基底細(xì)胞分化所必需的,激活Notch通路可促進(jìn)基底細(xì)胞分化為分泌細(xì)胞,在肺損傷時維持氣管上皮穩(wěn)態(tài)[21]。在肺修復(fù)階段,Notch通路促進(jìn)DASC激活,但抑制了其分化為肺泡細(xì)胞。研究者用γ分泌酶抑制劑與DASC共培養(yǎng),觀察到抑制Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可促進(jìn)DASC向肺泡細(xì)胞分化[22]。敲除小鼠Notch受體后,可觀察到PNEC的數(shù)量和大小明顯增加,表明Notch通路在正常穩(wěn)態(tài)期間限制PNEC增殖或分化,而在萘誘導(dǎo)的肺損傷中,PNEC中Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)水平升高,促進(jìn)PNEC的增殖和轉(zhuǎn)分化為分泌細(xì)胞和纖毛細(xì)胞[23]。在銅綠假單胞菌誘導(dǎo)的急性肺損傷的小鼠中,可觀察到AT2中的 Notch信號在損傷后的增殖階段被激活,但隨著AT2分化為AT1,Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)水平下降,有助于 AT2 細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)[24], 這種從高到低的開關(guān)對于AT2胞分化成AT1細(xì)胞至關(guān)重要。

3. Hippo通路:Hippo是肺上皮細(xì)胞增殖、分化的關(guān)鍵通路。YAP/TAZ是Hippo信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的核心因子,在器官發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)和修復(fù)中非常重要。Yap是基底細(xì)胞維持穩(wěn)態(tài)所必需的。基底細(xì)胞在YAP缺失時經(jīng)過其無節(jié)制的分化而丟失,導(dǎo)致氣道假復(fù)層柱狀上皮被簡化為柱狀上皮。相反,YAP信號過表達(dá)會加快基底細(xì)胞的增殖速率并阻止其分化,導(dǎo)致上皮增生[25]。在基底細(xì)胞耗竭后,分泌細(xì)胞可以去分化為基底樣細(xì)胞促進(jìn)肺修復(fù),YAP在分泌細(xì)胞中的過表達(dá)會促進(jìn)這種分化,同時抑制分泌細(xì)胞增殖,相反,抑制Hippo/YAP通路將阻止這種去分化[26]。Hippo通路在AT2向AT1的分化過程中起著至關(guān)重要的作用,在感染肺炎鏈球菌的小鼠中,YAP/TAZ在AT2中表達(dá)顯著增加,促進(jìn)AT2增殖和分化為AT1來減輕肺部炎癥和修復(fù)肺泡上皮,而將AT2細(xì)胞中的YAP/TAZ基因特異性敲除后,小鼠肺部炎癥加重,導(dǎo)致肺部纖維化病變[27]。

三、展 望

損傷后肺強(qiáng)大的修復(fù)能力反映了肺組織學(xué)的復(fù)雜性,不同解剖區(qū)域的肺常駐干細(xì)胞具有其獨(dú)特的分化潛能。多種信號通路在肺常駐干細(xì)胞增殖和分化過程中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。除了上述介紹的Wnt通路、Notch通路及Hippo通路,還有BMP通路、Hedgehog通路、TGF-β通路等通路在調(diào)節(jié)肺常駐干細(xì)胞修復(fù)階段發(fā)揮著重要作用。目前,我們正處于實(shí)現(xiàn)肺再生醫(yī)學(xué)前景的開始。關(guān)于肺常駐干細(xì)胞修復(fù)肺損傷的機(jī)制尚不十分明確,仍需要開展深入的研究予以進(jìn)一步證實(shí)。