趙建亮 劉 閆 宮迎春 劉 超 趙新巍 周 平 尹春艷

青島蘇貝爾作物營(yíng)養(yǎng)有限公司 青島 266000

黃腐酸含有羧基、羥基等多種含氧官能團(tuán)，這使其具備較高的活性[1，2]。黃腐酸結(jié)構(gòu)復(fù)雜，因來源不同更是千差萬別。人們對(duì)黃腐酸的分子結(jié)構(gòu)沒有定論，Schnitzer[3]根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)的黃腐酸分子結(jié)構(gòu)如圖1所示。但從有機(jī)合成角度來看，此結(jié)構(gòu)并不是一個(gè)大分子結(jié)構(gòu)，只是幾個(gè)小的、存在強(qiáng)極性氫鍵的有機(jī)分子形成的超分子體系，仍是混合物。黃腐酸的結(jié)構(gòu)至今無準(zhǔn)確的報(bào)道。

圖1 Schnitzer提出的黃腐酸結(jié)構(gòu)模型Fig.1 Fulvic acid structure model proposed by Schnitzer

隨著現(xiàn)代技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)黃腐酸的研究逐漸深入，已將其廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)、環(huán)境、醫(yī)藥等方面?；邳S腐酸在各領(lǐng)域的重要作用，因此對(duì)黃腐酸的研究更為有意義。黃腐酸分為從風(fēng)化煤、褐煤、泥炭等有機(jī)礦物中提取的礦物源黃腐酸和以農(nóng)林、廚余廢棄物、酒精廢棄物為原料經(jīng)微生物發(fā)酵制得的生物質(zhì)黃腐酸[4]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)從泥炭、褐煤和風(fēng)化煤等低階煤中提取黃腐酸已做了大量研究，近年來各行業(yè)對(duì)礦物源黃腐酸的應(yīng)用頻率大大升高，因此針對(duì)礦物源黃腐酸提取、分級(jí)及鑒定也顯得尤為重要。

本文主要對(duì)礦物源黃腐酸常用的提取方法進(jìn)行了探討，同時(shí)進(jìn)一步總結(jié)了提取后的黃腐酸分級(jí)和鑒定，但由于生物質(zhì)黃腐酸逐步興起，其中也穿插了一些對(duì)礦物源與生物質(zhì)黃腐酸的鑒別。最后，列舉了一些目前黃腐酸行業(yè)存在的問題及對(duì)未來發(fā)展進(jìn)行了展望，以期為黃腐酸的深入研究與應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 黃腐酸提取

1.1 堿溶酸析法

堿溶酸析法是指向樣品中加入堿溶液，在加熱、攪拌等條件下充分反應(yīng)，得到腐植酸鹽溶液，再用酸溶液調(diào)節(jié)pH到一定范圍，離心、過濾即得黃腐酸產(chǎn)品。此過程利用黃腐酸溶于酸性溶液的特性，隨著酸的加入，溶液pH降低，不溶于酸的棕腐酸和黑腐酸依次析出，最終將黃腐酸提取出來。

馬力通等[5]采用堿溶酸析法，將8種堿性萃取劑提取黃腐酸的產(chǎn)率、純度和結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明Na2SO3提取的黃腐酸濃度最高，達(dá)0.284 g/L。焦元?jiǎng)俒6]則用1%的NaOH與稀硫酸提取風(fēng)化煤中黃腐酸，探究不同終點(diǎn)pH對(duì)黃腐酸提取率的影響，發(fā)現(xiàn)pH增大使非黃腐酸物質(zhì)溶解量增加且提取率升高。

此法提取簡(jiǎn)單，成本低，適合大批量生產(chǎn)，是提取黃腐酸最常用方法之一。但得到的黃腐酸純度較低，易含較多非黃腐酸物質(zhì)，需進(jìn)一步純化。實(shí)際生產(chǎn)多選用KOH、NaOH為堿溶試劑提取黃腐酸。

1.2 化學(xué)氧化法

化學(xué)氧化法是指利用化學(xué)氧化劑將大分子腐植酸類物質(zhì)氧化降解成小分子黃腐酸類物質(zhì)。

Zhang Y等[7]以過氧化氫和甲酸為氧化劑并輔以微波提取新疆哈密褐煤中的黃腐酸，研究表明甲酸可以促進(jìn)過氧化氫從褐煤中提取黃腐酸，其最佳收率可達(dá)9.13%。鄭紅磊[8]采用過氧化氫氧化法提取內(nèi)蒙古呼倫貝爾褐煤中的黃腐酸，發(fā)現(xiàn)在過氧化氫濃度為17.5%、煤與過氧化氫比例為3.8∶1、溫度65 ℃、時(shí)間60 min的條件下黃腐酸的收率可達(dá)15.22%。

化學(xué)氧化法可以提高黃腐酸產(chǎn)率，增強(qiáng)含氧官能團(tuán)活性與數(shù)量，但氧化劑的選擇是關(guān)鍵，硝酸易產(chǎn)生污染環(huán)境的副產(chǎn)物，而過氧化氫不穩(wěn)定。

1.3 硫酸丙酮法

天然黃腐酸多以黃腐酸鹽的形式存在，如煤炭中黃腐酸多以鈣鎂的金屬鹽形態(tài)存在，硫酸中的氫離子取代黃腐酸鹽中的金屬離子，生成游離狀態(tài)的黃腐酸溶于丙酮，過濾去除不溶的硫酸鹽和雜質(zhì)得到黃腐酸溶液，蒸發(fā)去掉溶劑即為黃腐酸產(chǎn)品。

焦元?jiǎng)俒6]采用硫酸丙酮法提取風(fēng)化煤中的黃腐酸，使用的提取液為10%的丙酮溶液，在液固比7.5、時(shí)間1 h、酸煤比0.05、溫度30 ℃的條件下，黃腐酸的提取率達(dá)41%。但丙酮易揮發(fā)，易對(duì)人體和環(huán)境造成傷害。文鵬麗[9]采用乙醇替代丙酮，在液固比為4、反應(yīng)時(shí)間1 h、提取液含水量15%、酸煤比0.1的條件下提取內(nèi)蒙古風(fēng)化煤中的黃腐酸，提取率可達(dá)32.28%。

1.4 離子交換法

離子交換法與硫酸丙酮法基本類似，利用強(qiáng)酸性離子交換樹脂中的氫離子取代可溶性黃腐酸鹽中的金屬離子，從而去除金屬離子，得到黃腐酸。王彩虹等[10]將DAX-8型樹脂與001×7 H+型樹脂相結(jié)合，提取的黃腐酸純度可達(dá)94.49%。

離子交換法方法簡(jiǎn)單，除可用于提取黃腐酸外，還可對(duì)黃腐酸粗品純化得到更高純度的黃腐酸，使用的離子交換樹脂活化后可重復(fù)利用，但離子交換樹脂的再生活化工藝復(fù)雜，成本比較高，生產(chǎn)上通常不采用。

除了上述提取黃腐酸的方法外，還有微生物法（主要為發(fā)酵法），楊鑫[11]從混合菌株中篩選出一種對(duì)峨山褐煤提取效果最好的菌株，此方法提取的黃腐酸的水溶性和絮凝極限均變好，活性官能團(tuán)增多。

2 黃腐酸的定性定量分析

黃腐酸含多種官能團(tuán)，結(jié)構(gòu)復(fù)雜。此外，制備黃腐酸的礦物源和生物質(zhì)源原料有本質(zhì)上的區(qū)別，以及黃腐酸提取方式的多樣性，使黃腐酸物質(zhì)組成差異巨大。目前市場(chǎng)上出現(xiàn)用有機(jī)物類非黃腐酸冒充礦物源黃腐酸的案例，因此選取科學(xué)有效的分析手段對(duì)黃腐酸結(jié)構(gòu)及性質(zhì)進(jìn)行定性定量分析以及如何鑒別真假黃腐酸是近年來研究的熱點(diǎn)。

2.1 黃腐酸含量檢測(cè)

根據(jù)《黃腐酸鉀》（HG/T 5334—2018）和《黃腐酸原料及肥料 術(shù)語(yǔ)》（GB/T 38072—2019）規(guī)定，黃腐酸原料、以黃腐酸為有機(jī)原料制成的肥料和以黃腐酸為基礎(chǔ)制備的黃腐酸鹽類均分為礦物源和生物質(zhì)源。對(duì)于礦物源黃腐酸，中國(guó)腐植工業(yè)協(xié)會(huì)腐植酸質(zhì)量檢測(cè)中心推薦采用《礦物源游離黃腐酸含量的測(cè)定》（GB/T 34765—2017）國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[12]，《黃腐酸鉀》（HG/T 5334—2018）和《肥料中黃腐酸的測(cè)定 容量滴定法》（NY/T 3162—2017）也是常用的檢測(cè)礦物源黃腐酸標(biāo)準(zhǔn)。僅有《黃腐酸鉀》一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)既適合礦物源又適合生物質(zhì)黃腐酸，而殷慧敏[13]對(duì)該標(biāo)準(zhǔn)稍加修改，先用七水硫酸鋅和五水硫酸銅沉淀分離黃腐酸后氧化滴定檢測(cè)，同時(shí)引入沉淀系數(shù)，可以很好地區(qū)分礦物源黃腐酸與生物質(zhì)黃腐酸。

黃腐酸檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)大致分為提取、酸化分離、去除金屬離子、氧化和滴定5個(gè)步驟，即利用重鉻酸鉀的強(qiáng)氧化性來氧化黃腐酸中碳元素，再用硫酸亞鐵銨標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定剩余重鉻酸鉀量間接求得黃腐酸含量，只是不同標(biāo)準(zhǔn)可能會(huì)在試劑濃度、碳系數(shù)和酸析pH等方面略有差異。

2.2 元素分析

元素分析是對(duì)黃腐酸樣品中特定元素的定量分析，也是黃腐酸定量的主要方法之一。黃腐酸中所含的C、H、N、S、O 5種元素，前4種常采用元素分析儀測(cè)定，氧元素利用差減法亦可得出。黃腐酸中元素的差異可以反映官能團(tuán)及分子結(jié)構(gòu)的變化，如C/O和C/H比分別反映了黃腐酸含氧官能團(tuán)數(shù)量和芳香程度。李亞軍[14]利用微波輔助過氧化氫氧化呼倫貝爾褐煤，發(fā)現(xiàn)煤樣中氮元素與硫元素含量分別減少0.73%和0.09%，說明過氧化氫氧化有助于脫氮、脫硫。因此，元素分析可以對(duì)黃腐酸提取與純化后的產(chǎn)物進(jìn)行初步驗(yàn)證且為后續(xù)標(biāo)準(zhǔn)提供理論依據(jù)，但此方法受限于結(jié)晶水對(duì)結(jié)構(gòu)的影響。

2.3 官能團(tuán)含量的測(cè)定

黃腐酸所含的大量含氧官能團(tuán)（羧基、羥基、羰基等），對(duì)其理化性質(zhì)與生理活性有重要影響。常采用氫氧化鋇滴定法測(cè)得樣品中總酸基含量，醋酸鈣測(cè)定羧基含量，總酸基減羧基為酚羥基含量[15]。

2.4 波譜分析

波譜分析法是根據(jù)每種原子特有的特征譜線來鑒別物質(zhì)及確定含量的方法。

2.4.1 紫外-可見光譜

紫外-可見光譜是利用黃腐酸分子對(duì)紫外（200～400 nm）和可見光（400～800 nm）的吸收所得。由于黃腐酸結(jié)構(gòu)復(fù)雜，各官能團(tuán)的吸收光譜會(huì)發(fā)生不同程度的位移或重疊，故其光譜對(duì)黃腐酸結(jié)構(gòu)分析存在局限性。目前，在腐植酸應(yīng)用研究中普遍認(rèn)為465 nm和665 nm處吸光度比值（E4/E6）反映黃腐酸分子的芳香縮合度，比值越高，芳香縮合度越低；但對(duì)此特征常數(shù)的討論也不斷，部分學(xué)者認(rèn)為E4/E6比值與分子量有關(guān)而與芳香縮合度無關(guān)[16]，關(guān)于此比值的界定仍需進(jìn)一步研究。

2.4.2 紅外光譜

紅外光譜中不同的化學(xué)鍵有不同的吸收波長(zhǎng)位置。由于黃腐酸結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性及各基團(tuán)相互影響，定量分析困難，但可以利用紅外光譜確定黃腐酸的特征峰及其歸屬，對(duì)其官能團(tuán)進(jìn)行定性分析。趙亞玲[17]將河南風(fēng)化煤中提取的礦物源黃腐酸、秸稈和蘋果渣發(fā)酵提取的生物質(zhì)黃腐酸進(jìn)行紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)圖譜具有相似之處。

2.4.3 核磁共振波譜

核磁共振波譜是根據(jù)物質(zhì)吸收光能量的磁場(chǎng)區(qū)或化學(xué)位移不同來辨別化合物結(jié)構(gòu)的。黃腐酸結(jié)構(gòu)以C、H、O為主，因此核磁共振氫譜與核磁共振碳譜是研究腐植酸分子結(jié)構(gòu)與官能團(tuán)的主要波譜。路亞楠等[18]利用1H NMR鑒定了不同萃取劑提取褐煤中腐植酸對(duì)其結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)的影響；張超[19]利用核磁共振碳譜和氫譜表征從風(fēng)化煤和造紙黑液中提取的黃腐酸，發(fā)現(xiàn)二者結(jié)構(gòu)大體相同，但造紙黑液里的黃腐酸結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜且含較多芳香結(jié)構(gòu)。但此方法因黃腐酸可以準(zhǔn)確積分的烷基氫少，加上其溶解度在非水溶劑中不好或容易吸水問題，以及活性氫（來源COOH，OH或NH，SH）本身的積分易受環(huán)境影響而無法標(biāo)準(zhǔn)化等導(dǎo)致定量分析的準(zhǔn)確度比較低。

2.4.4 色譜-質(zhì)譜分析

黃腐酸大分子經(jīng)化學(xué)降解或熱降解后變成小分子碎片，進(jìn)入色譜柱分離，由質(zhì)譜儀定性定量分析碎片離子的組成，反推測(cè)黃腐酸的可能局部結(jié)構(gòu)。目前，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC/MS）是分析黃腐酸物質(zhì)碎片結(jié)構(gòu)的通用手段。王智[20]將礦物源黃腐酸與生物質(zhì)黃腐酸用熱裂解-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)比其組分，發(fā)現(xiàn)生物質(zhì)黃腐酸含有礦物源黃腐酸所沒有的稠環(huán)芳香化合物。Qin Y等[21]對(duì)氧化褐煤提取的黃腐酸用透析袋透析為100～500分子量大小的黃腐酸，采用GC/MS對(duì)其研究，共得到47種碎片離子類化合物。

2.4.5 熒光光譜法

利用黃腐酸樣品被紫外線照射后發(fā)出反映黃腐酸特性的熒光進(jìn)行鑒定[14]。在黃腐酸溶液濃度低時(shí)，熒光強(qiáng)度與濃度呈正比，可以準(zhǔn)確地定性定量分析；若濃度較大，會(huì)發(fā)生自吸收或自猝滅，熒光強(qiáng)度與濃度無線性關(guān)系，對(duì)黃腐酸的定量分析產(chǎn)生局限性。

2.4.6 拉曼光譜法

拉曼光譜是根據(jù)光散射效應(yīng)的分析技術(shù)，從分子能級(jí)的變化來鑒定黃腐酸分子結(jié)構(gòu)，可對(duì)黃腐酸樣品進(jìn)行快速、無損檢測(cè)。但此法在黃腐酸結(jié)構(gòu)分析方面研究不多。

3 黃腐酸分級(jí)

盡管目前國(guó)內(nèi)外采用很多先進(jìn)儀器和方法來表征分析黃腐酸，但黃腐酸是由一系列相對(duì)分子量較小的有機(jī)分子結(jié)合而成的混合物，本身的異質(zhì)性限制人們對(duì)黃腐酸的表征與分析，使得當(dāng)下仍無明確清晰的黃腐酸組成及作用機(jī)理。因此，根據(jù)黃腐酸分子量、溶解性對(duì)其進(jìn)行分級(jí)，得到不同梯度性質(zhì)相似的物質(zhì)，降低黃腐酸異質(zhì)性，便于更好地研究不同級(jí)分黃腐酸的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)組成和作用機(jī)理。

3.1 梯度淋洗法

此方法采取溶劑梯度和溫度梯度相結(jié)合的手段對(duì)黃腐酸進(jìn)行分級(jí)。將黃腐酸溶于內(nèi)置玻璃珠的溶劑（乙醇）中，減壓蒸餾后去除乙醇，黃腐酸將均勻附著在玻璃珠表面，將其放于玻璃柱中，用不同淋洗液（乙醇與非溶劑復(fù)配）和溫度梯度對(duì)玻璃柱淋洗，依次減壓蒸餾即得不同分子量的黃腐酸。張德和[22]用該法對(duì)黃腐酸進(jìn)行分級(jí)得到了12個(gè)分子量級(jí)別的組分，且回收率高達(dá)99.6%，但此方法造成淋洗液的過度浪費(fèi)。

3.2 分子篩層析法

分子篩采用多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，分離出不同分子量大小的黃腐酸，因此又叫凝膠過濾法。黃腐酸分子量較大的物質(zhì)由于不能流入凝膠孔內(nèi)，會(huì)快速流過凝膠間，流出凝膠柱；而分子量較小的物質(zhì)會(huì)進(jìn)入凝膠內(nèi)部，按分子量大小依次流出凝膠柱，分子量越小，流出越晚。若樣品濃度過高，會(huì)減弱分離效果，導(dǎo)致黃腐酸分級(jí)收率較差[23]。

3.3 膜分離法

膜分離法分為透析袋分級(jí)和加壓超濾。透析袋分級(jí)是將裝有黃腐酸溶液的特定相對(duì)分子量的透析袋置于緩沖溶液中，利用半透膜內(nèi)外不同的濃度差，比半透膜分子量小的物質(zhì)被透析出來為透析液，分子量大的物質(zhì)留在袋內(nèi)為保留液。通過不同分子量透析袋透析所得的透析液減壓蒸餾即得黃腐酸的不同級(jí)分[21]。此法操作便捷，透析袋可循環(huán)使用。梁媛媛等[24]采用透析膜將黃腐酸分為＜3000、3000～10000和＞10000 Da 3個(gè)分子量等級(jí)，發(fā)現(xiàn)分子量越小的黃腐酸親水性與活性越高，低施用量效果顯著。

加壓超濾與透析袋分級(jí)原理類似，同樣利用特定超濾膜來分級(jí)，不同點(diǎn)在于加壓超濾利用儀器對(duì)超濾膜加壓來對(duì)黃腐酸分級(jí)。不同分子量的物質(zhì)在壓力作用下通過不同孔徑的超濾膜被分離出來[25]。超濾膜越小，所需壓力越大，分離速度越慢。

4 存在問題

黃腐酸蘊(yùn)含豐富的含氧官能團(tuán)決定其具備諸多的特性，這使得它在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、環(huán)境、醫(yī)藥領(lǐng)域得以廣泛應(yīng)用。越來越多的學(xué)者對(duì)黃腐酸展開研究，但由于其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)使得對(duì)黃腐酸研究仍面臨許多問題：（1）低階煤種類豐富，提取方法繁多，都會(huì)導(dǎo)致提取到的黃腐酸結(jié)構(gòu)（官能團(tuán)種類、數(shù)量）差異化。因此，對(duì)不同來源、不同提取方式所得的黃腐酸結(jié)構(gòu)及作用機(jī)理的研究十分重要；（2）目前來看，我國(guó)低階煤資源豐富，但隨著工業(yè)化進(jìn)程加快，勢(shì)必面臨能源短缺問題，如何高效地從低階煤中提取黃腐酸或?qū)ふ倚碌膩碓粗档盟伎?；?）黃腐酸檢測(cè)主要為容量法，此方法受碳系數(shù)影響較大，常出現(xiàn)同一個(gè)產(chǎn)品不同單位檢測(cè)黃腐酸含量不同，甚至差距較大的現(xiàn)象，這些都與黃腐酸碳系數(shù)不統(tǒng)一或不合理有關(guān)[26]；（4）近年來關(guān)于生物質(zhì)黃腐酸的研究增多，相比類黃腐酸、發(fā)酵有機(jī)酸等，生物質(zhì)黃腐酸逐漸被大家認(rèn)可[27]，但不同來源黃腐酸所含羧基、羥基等活性官能團(tuán)數(shù)量、位置不同，與其他原料可能發(fā)生的反應(yīng)及其作用于土壤中的機(jī)理也不同，在此基礎(chǔ)上制得的黃腐酸肥料難以保證良好的穩(wěn)定性是目前肥料行業(yè)普遍出現(xiàn)的問題；（5）如何更好地鑒定礦物源黃腐酸與生物質(zhì)黃腐酸也是目前存在的主要問題，黃腐酸肥料生產(chǎn)成本較高、而原料的質(zhì)量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)匱乏，針對(duì)生物質(zhì)黃腐酸檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)也只有《黃腐酸鉀》標(biāo)準(zhǔn)，很難做到很好地區(qū)分兩種黃腐酸，容易導(dǎo)致黃腐酸類肥料生產(chǎn)以假亂真、粗制濫造。

5 展望

黃腐酸在多領(lǐng)域有很大應(yīng)用潛力，如醫(yī)藥和畜牧領(lǐng)域，對(duì)人體及動(dòng)物多種疾病預(yù)防與治療效果顯著，為以后提高藥效和長(zhǎng)期安全性還需進(jìn)一步摸清其在人體和動(dòng)物中的起效機(jī)理。黃腐酸在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用仍是主流，其良好的水溶性使其在肥料復(fù)配中極具優(yōu)勢(shì)，添加氨基酸、海藻酸等天然活性物質(zhì)與黃腐酸配伍，開發(fā)新型黃腐酸肥料，是實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的一個(gè)思路。

黃腐酸雖應(yīng)用廣泛，還是更要注重其結(jié)構(gòu)與組成的基礎(chǔ)研究，為后續(xù)黃腐酸肥料標(biāo)準(zhǔn)的制定和黃腐酸類新產(chǎn)品的推出奠定基礎(chǔ)；本文概述的黃腐酸提取、鑒定及其分級(jí)部分雖主要以礦物源黃腐酸為主，在定性定量及分級(jí)部分也只是粗略列舉了關(guān)于礦物源黃腐酸與生物質(zhì)黃腐酸測(cè)定和結(jié)構(gòu)方面的差異，如何快速清晰的對(duì)二者進(jìn)行鑒別和檢測(cè)也是一直以來許多行業(yè)關(guān)注的問題；其次，表征黃腐酸結(jié)構(gòu)的的儀器與方法很多，科學(xué)搭配，整理和完善不同來源、不同提取方法制得的黃腐酸的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，更加合理的應(yīng)用黃腐酸，提高黃腐酸利用率，讓用黃腐酸制成的產(chǎn)品更加穩(wěn)定，減少因質(zhì)量問題而被市場(chǎng)淘汰的概率；在黃腐酸肥料產(chǎn)業(yè)，含礦物源黃腐酸的肥料產(chǎn)品一直占市場(chǎng)較大比例，生物質(zhì)黃腐酸雖然備受爭(zhēng)議，但也逐漸被認(rèn)可，針對(duì)不同種類的黃腐酸肥料，應(yīng)定向細(xì)化標(biāo)準(zhǔn)，做到每類含黃腐酸產(chǎn)品均有檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)可循，讓黃腐酸行業(yè)健康穩(wěn)定地發(fā)展。