鐘鵬英，張玉超，張芳華，張喜利，劉文龍*（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)沙 410208；2.中藥成藥性與制劑制備湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410208；.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，長(zhǎng)沙 410208）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種慢性肺部疾病，其特點(diǎn)是氣道氣流受限，并伴有炎癥和肺氣腫，COPD患者氣流受限的直接原因是氣道重塑，而肺氣腫則源于肺泡壁的廣泛破壞[1-2]。煙霧中含有各種有毒物質(zhì)，容易吸引巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，促進(jìn)內(nèi)源性物質(zhì)的釋放，并加速氧化應(yīng)激引起的肺組織損傷[3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，到2030 年，COPD可能與高血壓和糖尿病一起成為全球三大死因，極大地阻礙醫(yī)療保健的發(fā)展，損害人類健康[4]。目前還沒有可逆轉(zhuǎn)或阻止疾病發(fā)展的治療方案，為此，迫切需要確定治療研究的新機(jī)制或新靶點(diǎn)。代謝組學(xué)（代謝物分析）是一種新興的方法，可用于鑒定代謝物的生物標(biāo)志物和發(fā)現(xiàn)受干擾的代謝途徑，依據(jù)代謝途徑的變化從而發(fā)現(xiàn)不同疾病中的治療標(biāo)志物[5-7]，在COPD疾病中發(fā)現(xiàn)其部分代謝表達(dá)也出現(xiàn)了紊亂[8]，選取關(guān)鍵代謝途徑進(jìn)行治療，有可能成為治療新方式。

人參化橘紅復(fù)方含人參、甘草、化橘紅和陳皮，其中，藥材陳皮和化橘紅含有柚皮素、柚皮苷和陳皮苷，其抑制黏蛋白分泌和調(diào)節(jié)炎癥的作用已得到廣泛認(rèn)可，具有祛痰和鎮(zhèn)咳作用，可用于治療慢性支氣管疾病[9]，人參皂苷Rg1、人參皂苷Rg3和總?cè)藚⒃碥赵缫驯蛔C明可通過調(diào)節(jié)輔助性T細(xì)胞1和T細(xì)胞2 的比例來(lái)平衡內(nèi)環(huán)境。人參皂苷Rg1可介導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），進(jìn)而抑制氣道重塑來(lái)增強(qiáng)COPD患者的肺功能和存活水平[10-11]。然而，對(duì)于其如何干預(yù) COPD的作用機(jī)制并不清晰，本研究經(jīng)血清代謝組學(xué)分析并驗(yàn)證與COPD相關(guān)的生物標(biāo)志物和代謝通路，為人參化橘紅治療COPD提供更加豐富的理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

24只雄性SPF級(jí)SD大鼠，（200±20）g [湖南晶達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)為：SYXK 2019-0009]。大鼠自由進(jìn)食和飲水，飼養(yǎng)溫度為20～25℃，濕度為50%～70%。所有實(shí)驗(yàn)均按照湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案和指南進(jìn)行（倫理審查號(hào)：LL2022090602）。

1.2 試藥

人參化橘紅（西藏嘉唐保健品有限公司）；TBST、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，RIPA（強(qiáng)）組織細(xì)胞快速裂解液（賽文科技有限公司）；脂多糖（LPS，Sigma生物技術(shù)有限公司）；HE染色（武漢皮諾飛生物技術(shù)有限公司）；黃果樹香煙（中國(guó)，含焦油 10 mg，尼古丁 0.9 mg，一氧化碳 12 mg）；琥珀酸合成酶（ASS1）、激活激酶（P21）、磷脂酶（PLD1）抗體、山羊抗鼠IgG二抗（Affnity）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）ELISA試劑盒（上海撫生生物有限公司）；氨茶堿（太原集團(tuán)有限公司）；水合氯醛（合肥博美生物科技有限責(zé)任公司）；氯化鈉注射液（湖南科倫制藥有限公司）；無(wú)水乙醇、甲醇和乙腈（上海安譜實(shí)驗(yàn)有限公司）；超純水（屈臣氏集團(tuán)有限公司），自制煙熏盒子（80 cm×40 cm×20 cm）。

1.3 儀器

Q1320583超聲儀（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；電泳儀和化學(xué)發(fā)光成像分析儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；UPLC-Q-TOF/MS質(zhì)譜儀、Heraeus Fresco17離心機(jī)、酶標(biāo)儀（美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司）。

2 方法

2.1 COPD造模和給藥

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組。對(duì)照組（6只）暴露于室內(nèi)空氣中，模型組（18只）于自制箱子中熏二手煙，每次 1.5 h，每次9支煙，每日2次（間隔4 h），每周6 d，共45 d；第1日和第14日用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉大鼠，用脫毛膏清創(chuàng)咽喉部，暴露喉部，用靜脈注射針代替氣管插管，向氣管內(nèi)注入0.2 mL質(zhì)量濃度為1 mL·mg－1的LPS，然后將大鼠直立旋轉(zhuǎn)10～20 s，使LPS均勻分布在肺部，2 d內(nèi)不接觸二手煙。人參化橘紅人體給藥每日3 g，氨茶堿每日1 g，大鼠按1 mL/100 g灌胃，人參化橘紅給藥質(zhì)量濃度為0.027 g·mL－1，氨茶堿給藥質(zhì)量濃度為0.009 g·mL－1。

2.2 樣品采集

末次給藥后，禁食12 h，各組大鼠經(jīng)麻醉處理，腹主動(dòng)脈取血；室溫下靜置30 min后，以4℃、3000 r·min－1（離心半徑9 cm）離心15 min，分離上層血清，－80℃保存。

2.3 組織病理學(xué)觀察

取大鼠右肺組織于4%多聚甲醛溶液中固定48 h后，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書步驟，HE染色觀察肺組織內(nèi)炎癥情況。參考文獻(xiàn)報(bào)道分級(jí)[12]：0級(jí)，正常形態(tài)；1級(jí)，輕度肺間質(zhì)充血和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；2級(jí)，血管周圍水腫形成，肺組織結(jié)構(gòu)部分損壞，中度中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；3級(jí)，肺組織結(jié)構(gòu)損壞嚴(yán)重，高密度中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。

2.4 ELISA法檢測(cè)血清TNF-α、IL-1β、MMP-9和TIMP-1水平

收集血清按照相關(guān)試劑盒說(shuō)明書嚴(yán)格操作，檢測(cè)血清中TNF-α、IL-1β、MMP-9和TIMP-1水平。

2.5 血清代謝組學(xué)分析

移取100 μL樣品至EP管中，加入400 μL提取液（甲醇-乙腈＝1∶1，含同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)混合物），渦旋混勻30 s；超聲10 min（冰水?。?；－40℃靜置1 h；將樣品于4℃、12 000 r·min－1（半徑8.6 cm）離心15 min；取上清液及QC樣品（另取等量上清混合成）上機(jī)檢測(cè)。

2.6 檢測(cè)條件

色譜柱 Waters ACQUITY UPLC BEH Amide（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相A為含25 mmol·L－1乙酸銨和 25 mmol·L－1氨水，B為乙腈，采用梯度洗脫（0～0.5 min，95%B；0.5～7 min，95%～65%B；7～8 min，65%～40%B；8～9 min，40%B；9～9.1 min，40%～95%B；9.1～12 min，95%B）；流速0.5 mL·min－1，柱溫30℃，樣品盤溫度4℃，進(jìn)樣量2 μL。

2.7 Western blot檢測(cè)

取大鼠左肺組織于－80℃保存。按照 BCA法蛋白質(zhì)含量檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。取50 mg右肺組織，用冷PBS沖洗 3 次，用RIPA 裂解液提取蛋白質(zhì)，用 BCA 法檢測(cè)勻漿中的蛋白質(zhì)濃度。將 5×SDS上樣緩沖液與100 μg蛋白按比例混合，煮沸5 min，然后用 10% SDSPAGE 凝膠電泳分離，電泳條件為120 V，1 h；用甲醇活化的 PVDF 轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件為 200 A，1 h。轉(zhuǎn)膜后，用 5%脫脂奶粉在 37℃下封閉2 h。按說(shuō)明書用 P21、PLD1、ASS1和 GAPDH 一抗（1∶2200）在 4℃下孵育過夜，洗膜后加入稀釋的二抗。二抗稀釋后加入山羊抗兔 IgG 二抗（1∶7000）封閉，37℃室溫下輕輕振蕩孵育2 h。使用 BIO-Rad-ChemiDoc XRS 凝膠電泳，導(dǎo)出圖像，測(cè)定各目標(biāo)條帶與 GAPDH 內(nèi)參的灰度值，計(jì)算比值，得出預(yù)測(cè)蛋白的相對(duì)表達(dá)含量。

2.8 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 25軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）。使用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

原始數(shù)據(jù)經(jīng)ProteoWizard軟件轉(zhuǎn)成mzXML格式后，使用自主編寫的R程序包（內(nèi)核為XCMS）進(jìn)行峰識(shí)別、峰提取、峰對(duì)齊和積分等處理，然后與BiotreeDB（V2.1）自建二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)匹配進(jìn)行物質(zhì)注釋，算法打分的Cutoff值設(shè)為0.3。采用Sigmca-17軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行無(wú)監(jiān)督模式的主成分分析（PCA）及有監(jiān)督模式的正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），得到能夠反映組間貢獻(xiàn)率的代謝物變量重要性投影（VIP）值散點(diǎn)圖，利用HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//hmdb.ca）與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.kegg.jp）對(duì)篩選得到的差異代謝物進(jìn)行鑒定，辨別出潛在生物標(biāo)志物，隨后使用MetaboAnalyst 5.0數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.metaboanalyst.ca）對(duì)潛在生物標(biāo)志物進(jìn)行富集分析。

3 結(jié)果

3.1 病理切片結(jié)果

HE染色顯示，對(duì)照組大鼠肺組織有少許炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管壁基本完整，未見明顯黏膜水腫和肺泡破壞；模型組大鼠支氣管壁增厚，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡破裂，形成了大肺泡，肺泡壁增厚。與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織病理評(píng)分升高（P＜0.01）；與模型組相比，人參化橘紅組炎性浸潤(rùn)減少，肺泡破裂情況少見，病理評(píng)分降低（P＜0.01）。結(jié)果見圖1。

圖1 不同組別HE染色及評(píng)分圖（×200，n＝6）Fig 1 HE staining and scoring charts of different groups（×200，n＝6）

3.2 人參化橘紅對(duì)COPD大鼠血清內(nèi)TNF-α、IL-1β、MMP-9和TIMP-1水平的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清內(nèi)TNF-α、IL-1β、MMP-9和TIMP-1顯著上升（P＜0.01）；與模型組比較，人參化橘紅組TNF-α、IL-1β、MMP-9和TIMP-1均出現(xiàn)不同程度下降（P＜0.05，P＜0.01），可知用藥后炎癥浸潤(rùn)的效果明顯改善，且肺氣道內(nèi)氣道壁增厚現(xiàn)象有所改善（見圖2）。

圖2 大鼠血清內(nèi)TNF-α、IL-1β、MMP-9和TIMP-1水平比較（n＝6）Fig 2 TNF-α，IL-1β，MMP-9，and TIMP-1 levels in rat serum（n＝6）

3.3 多元統(tǒng)計(jì)分析

模型組大鼠和人參化橘紅組血清樣品能夠明顯分離，且無(wú)交叉重疊，表明COPD大鼠體內(nèi)發(fā)生了明顯的代謝差異變化；PCA圖中橫坐標(biāo)PC[1]和縱坐標(biāo)PC[2]分別表示排名第一和第二的主成分的得分，每個(gè)散點(diǎn)代表一個(gè)樣本，散點(diǎn)的顏色和形狀表示不同的分組，樣本點(diǎn)分布越靠近，說(shuō)明樣本中代謝物的種和含量越相似；反之，樣本越遠(yuǎn)，其整體代謝水平差異越大，其結(jié)果可知樣本全部處于95%置信區(qū)間內(nèi)。結(jié)果見圖3。

圖3 大鼠血清代謝物的多元統(tǒng)計(jì)分析Fig 3 Multivariate statistical analysis of rat serum metabolites

在圖3結(jié)果中，OPLS-DA模型中R2Y與Q2接近于1，則表明模型對(duì)Y變量的解釋性越好且模型的預(yù)測(cè)能力越好，同時(shí)采用200次置換測(cè)試驗(yàn)證了OPLS-DA模型的可靠性，所有模擬值均小于真實(shí)值，且Q2的回歸線截距均小于 0.05。結(jié)果表明，OPLS-DA模型具有良好的擬合度和預(yù)測(cè)能力，其對(duì)血清樣品的差異具有良好的解釋性。

3.4 人參化橘紅生物標(biāo)志物及KEGG富集分析

采用UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)的代謝組學(xué)分析，根據(jù)設(shè)定的參數(shù)（VIP＞1且P＜0.05）篩選差異代謝物，將它們的二級(jí)質(zhì)譜圖分別與HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中代謝物的二級(jí)質(zhì)譜圖進(jìn)行匹配，反復(fù)比對(duì)，共得到33個(gè)潛在生物標(biāo)志物，詳細(xì)見表1；將上述差異代謝物代入Metabo Analyst 5.0富集分析共發(fā)現(xiàn)15條代謝路徑，見圖4，其中涉及組氨酸代謝、精氨酸合成、花生四烯酸代謝、甘油磷脂代謝和膽堿代謝等，隨后通過相關(guān)文獻(xiàn)找到與COPD相關(guān)的通路（精氨酸合成[13]、花生四烯酸代謝[14]和甘油磷脂代謝[15]）及其對(duì)應(yīng)的酶（ASS1、P21和PLD1）。

表1 人參化橘紅潛在生物標(biāo)志物Tab 1 Potential biomarkers Ginseng-Chemotaxis

圖4 KEGG富集分析得出15條路徑Fig 4 15 paths yielded by KEGG enrichment analysis

3.5 代謝通路結(jié)果驗(yàn)證

選擇上述涉及的酶，利用Western blot驗(yàn)證，結(jié)果如圖5，與模型組相比，P21和ASS1的蛋白灰度值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而PLD1無(wú)顯著差異，由此推測(cè)人參化橘紅可能通過促進(jìn)ASS1和抑制P21，以促進(jìn)精氨酸合成和抑制花生四烯酸代謝來(lái)干預(yù)COPD的發(fā)生發(fā)展。

4 討論

COPD是一種多種癥狀疊在一起的肺功能性疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，治愈難度大，臨床上對(duì)其治療多以延緩其發(fā)展，減輕患者癥狀為首要目標(biāo)[16]。本研究以LPS和煙霧誘導(dǎo)大鼠COPD模型，經(jīng)人參化橘紅干預(yù)一段時(shí)間，可明顯看出肺組織和血清內(nèi)炎癥浸潤(rùn)減少，MMP-9和TIMP-1的抑制對(duì)于氣道壁的增厚有所改善，提示該方對(duì)COPD的肺組織具有一定的保護(hù)作用，隨后為了探明其代謝機(jī)制，利用UPLC-Q-TOF/MS分析模型組和人參化橘紅組之間的血清，考察COPD相關(guān)生物標(biāo)志物及其代謝通路。

精氨酸是必需氨基酸的一種，促進(jìn)精氨酸的合成，對(duì)于抑制COPD發(fā)展是有積極意義的。有研究發(fā)現(xiàn)，COPD患者病情惡化時(shí)，精氨酸酶支氣管上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和肺泡巨噬中參與調(diào)節(jié)炎癥和氣道重塑的關(guān)鍵成分[17]。隨著時(shí)間的推移，COPD患者肺動(dòng)脈高壓和動(dòng)脈壓呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，應(yīng)用精氨酸干預(yù)后，肺組織損傷減輕，肺功能得到改善[18-19]。

花生四烯酸代謝是構(gòu)成炎癥的重要一環(huán)，通過抑制炎癥反應(yīng)達(dá)到阻礙疾病進(jìn)程是治療眾多疾病的基礎(chǔ)，經(jīng)脂氧酶的代謝作用后，可活化NF-κB，肺泡灌洗液和肺組織內(nèi)炎癥因子白細(xì)胞數(shù)量顯著增加，推測(cè)其可能增加氧化應(yīng)激和蛋白酶的負(fù)荷，加重了COPD的發(fā)生發(fā)展[20]。其次其通過改變花生四烯酸代謝后，可阻礙血栓素B2和白三烯等炎癥因子的形成，降低肺組織內(nèi)細(xì)胞凋亡指數(shù)，減少煙霧誘導(dǎo)累積的毒性效應(yīng)[21]。甘油磷脂代謝作為COPD患者肺組織內(nèi)代謝紊亂的重要標(biāo)志物[22]，其前體物質(zhì)植物鞘磷脂可代謝為脂肪酸，隨后并入甘油磷脂內(nèi)，在細(xì)胞的凋亡、遷移和炎癥中均可表達(dá)，對(duì)于COPD的診斷具有重大價(jià)值[23]。但根據(jù)Western blot的檢測(cè)結(jié)果可知，人參化橘紅對(duì)抑制其表達(dá)無(wú)顯著性差異，可能對(duì)甘油磷脂代謝抑制無(wú)明顯作用。

綜上所述，本研究通過血清代謝組學(xué)探究人參化橘紅干預(yù)COPD的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)人參化橘紅可通過促進(jìn)精氨酸的合成和抑制花生四烯酸代謝，抑制肺組織的炎癥浸潤(rùn)，保護(hù)肺功能。