楊靖涵，高杰，孫立麗，劉亞男，任曉亮（天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 301617）

半夏為天南星科植物半夏Pinelliaternata（Thunb.）Breit.的干燥塊莖，歸脾、胃、肺經(jīng)。現(xiàn)代研究表明，半夏的化學(xué)成分主要包括生物堿[1]、有機(jī)酸[2]、揮發(fā)油[3]、氨基酸[4]等，半夏具有臟器毒性、黏膜刺激性、生殖毒性等毒副作用，炮制可以減少生品的毒性，從而達(dá)到減毒增效、改變藥性的目的[5]。2020年版《中國藥典》收載的半夏的炮制品主要有半夏、姜半夏、法半夏、清半夏四種[6]。藥理學(xué)研究證實(shí)半夏具有鎮(zhèn)咳、祛痰、止嘔、抗炎、抗氧化的功效，而半夏的不同炮制品在臨床中均具有止咳的作用[7-8]。王銳等[9]采用“同時(shí)蒸餾-萃取”的方法提取了半夏的揮發(fā)油，并證明了半夏的揮發(fā)油具有一定的生理活性。也有研究表明，半夏揮發(fā)油具有止咳、抗炎、抗氧化等功效，這與半夏的藥理作用具有較好的相關(guān)性[1，10-11]。因此從半夏揮發(fā)油中篩選質(zhì)量標(biāo)志物是可行的思路。

半夏的炮制工藝多以復(fù)制法為主，經(jīng)炮制后揮發(fā)性的成分種類差異較大，因此通過建立指紋圖譜探索共有的化學(xué)特征，進(jìn)而確定其質(zhì)量標(biāo)志物是有效可行的思路[12-16]。Heracles Ⅱ超快速氣相電子鼻的分析原理與氣相色譜類似，物質(zhì)中的揮發(fā)性成分不同，對色譜柱的吸附與解吸也存在較大差異，能夠?qū)崿F(xiàn)混合氣體之間的分離與分析[17]，和氣相色譜相比，具有更短的色譜柱和更薄的填充材料，能夠極大縮短揮發(fā)性成分的分離時(shí)間，提高樣品分析效率[18]，其配備的Arochembase數(shù)據(jù)庫具有類似于GC-MS的成分定性功能。因此超快速氣相電子鼻具有操作簡單，檢測快捷，無需對樣品做過多處理等優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)χ兴幊煞诌M(jìn)行快速的分離、定性、分析[19]。目前已被廣泛用于中藥材基原[20]、炮制品[21]、摻偽品[22]、采收期和貯存期[23]等方面的研究中。本研究借助Heracles Ⅱ超快速氣相電子鼻技術(shù)獲得半夏及其炮制品的氣相色譜圖，建立半夏不同炮制品的超快速氣相電子鼻檢測方法，并分析了半夏不同炮制品之間的氣味成分及差異標(biāo)志物，進(jìn)一步結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，預(yù)測不同炮制品的差異成分靶點(diǎn)和通路信息，旨在從揮發(fā)性成分的角度，解釋半夏不同炮制品的分子作用機(jī)制，為炮制品的質(zhì)量控制研究提供新思路。

1 樣品、儀器與試藥

1.1 樣品

半夏收集于河北、四川、甘肅等地，具體樣品批次見表1，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)竇志英教授鑒定為天南星科植物半夏Pinelliaternate（Thunb.）Breit.的塊莖。所有樣品均按2020年版《中國藥典》[6]中半夏炮制方法自制4 種半夏炮制品。

表1 樣品來源信息Tab 1 Sample source information

1.1.1 半夏 取半夏藥材，除去雜質(zhì)，即得樣品SBX-S1～S6。

1.1.2 姜半夏 選取直徑大小約為1 cm的凈制半夏，用水浸泡至內(nèi)無干心時(shí)，取出；另取生姜片煎湯，加白礬與半夏共煮透，取出，晾干。即得樣品JBX-S1～JBX-S6。每100 g凈制半夏用生姜25 g，白礬12.5 g。

1.1.3 法半夏 選取直徑大小約為1 cm的凈制半夏，用水浸泡至內(nèi)無干心。取適量甘草，加水煎煮，合并煎液，倒入適量的石灰液中，加入浸透的半夏，每日攪拌1～2 次，保持溶液pH 12以上，至剖面黃色均勻，口嘗微有麻舌感時(shí)取出，洗凈，晾干，即得樣品FBX-S1～FBX-S6。每100 g凈制半夏用甘草15 g，生石灰10 g。

1.1.4 清半夏 選取直徑大小約為1 cm的凈制半夏，用8%的白礬水浸泡至內(nèi)無干心，口嘗微有麻舌感時(shí)取出，洗凈，晾干。即得樣品QBXS1～QBX-S6。每100 g凈制半夏用白礬20 g。

將以上4種炮制品分別打粉，過4號藥典篩，備用。精密稱取藥材粉末0.5 g，分別置于20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，加蓋密封，平行兩次進(jìn)樣。半夏不同炮制品見圖1。

圖1 半夏及其不同炮制品Fig 1 Pinelliae Rhizoma and its processed products

1.2 儀器與試藥

HeraclesⅡ超快速氣相電子鼻（法國Alpha MOS公司）；FA2004型萬分之一天平，（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）。nC6-nC16正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)溶液（批號：563121，美國RESTEK公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 Heracles Ⅱ超快速氣相電子鼻儀器條件

Heracles Ⅱ超快速氣相電子鼻配有兩根色譜柱：一根為非極性的MXT-5色譜柱，另一根為弱極性的MXT-1701色譜柱。待測樣品通過平行工作的兩根色譜柱進(jìn)行分離后，使用氫火焰離子檢測器FID對分離出的物質(zhì)進(jìn)行檢測，從而得到半夏及其炮制品的有效氣味信息，具體分析條件參數(shù)如表2所示。

表2 Heracles Ⅱ超快速氣相電子鼻分析條件Tab 2 Analysis conditions of Heracles Ⅱultra-fast gas phase electronic nose

2.2 炮制品氣味成分定性分析

根據(jù)“2.1”項(xiàng)下條件，將所得圖譜信息導(dǎo)入Origin Pro 2022軟件得到半夏及其炮制品的色譜圖（如圖2所示），得半夏不同炮制品對照氣味峰指紋圖譜（如圖3所示）。利用正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)溶液對各氣味信息進(jìn)行定性，樣品保留時(shí)間校準(zhǔn)為Kovats保留指數(shù)，利用Arochembase數(shù)據(jù)庫和Alphasoftv12.44軟件處理后，得到半夏及其炮制品的可能氣味信息如表3所示。

圖2 半夏不同炮制品氣味指紋圖譜Fig 2 Odor fingerprint of Pinelliae Rhizoma and its processed products

圖3 半夏及其炮制品對照氣味峰指紋圖譜比較Fig 3 Common mode of odor fingerprint of Pinelliae Rhizoma and its processed products

表3 半夏及其不同炮制品可能氣味信息Tab 3 Possible compounds information of Pinelliae Rhizoma and its processed products

結(jié)果表明，4種炮制品氣味之間的共有成分為正十三烷；半夏的特有氣味成分為2-甲基丙酸乙酯、正己醛、壬酸丙酯、丙戊酸、5-甲基十五烷、肉桂酸正丙酯；姜半夏的特有氣味成分為正己烷、3-戊酮、2-甲基-1-戊醇、苯甲酸、4-三癸醇；法半夏的特有氣味成分為甲酸甲酯、甲基丁香酚；清半夏的特有氣味成分為二乙基酮、正十六烷。由此可見半夏不同炮制品之間氣味存在差異，因此這些不同的氣味信息可能是鑒別半夏及其炮制品的物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.3 半夏不同炮制品氣味成分分析

利用電子鼻獲取半夏不同炮制品氣味信息，通過Kovats保留指數(shù)定性，采用峰面積歸一化法得到半夏不同炮制品的氣味成分相對含量。結(jié)果見表4。半夏不同炮制品中共鑒定出21種成分，包括酯類6種，烷烴類5種，醇類2種，酸類2種，醛類、酚類各1種，其他類4種。

表4 半夏及其不同炮制品氣味成分相對含量Tab 4 Relative content of odorant components in Pinelliae Rhizoma and its different processed products

結(jié)果表明，半夏不同炮制品中，共同存在的成分為酯類和烴類。半夏的氣味成分主要為酯類、烴類、酸類、醛類；姜半夏的氣味成分主要為酯類、烴類、醇類、酸類；法半夏的氣味成分主要為酯類、烴類、酚類等；清半夏的氣味成分主要為酯類、烴類。其中，姜半夏炮制過程中加入炮制輔料生姜，賦予了姜半夏辛辣的、香料的氣味；法半夏炮制過程中加入輔料甘草汁，賦予了法半夏甜的、水果的氣味，這表明不同的物料對半夏不同炮制品的影響不盡相同，因此炮制后的化學(xué)成分、藥效、作用機(jī)制也會有所改變[24]。

2.4 多元統(tǒng)計(jì)分析

2.4.1 主成分分析（PCA） 根據(jù)Heracles Ⅱ超快速氣相電子鼻得到半夏及其炮制品的色譜圖，以其色譜圖峰面積為變量進(jìn)行PCA分析，結(jié)果如圖4所示。判別指數(shù)為70，主成分（PC1＝54.424%，PC2＝18.414%）的累計(jì)貢獻(xiàn)率為72.838%，表明所建立的模型能夠較好地反映樣品的氣味信息。四種炮制品能夠被良好地區(qū)分：半夏主要分布在第二、三象限，且樣品分布較為分散，說明樣品之間氣味差異較大；姜半夏、法半夏、清半夏主要分布在第一、四象限，與半夏分布距離較遠(yuǎn)，且這三種炮制品之間也能較好地區(qū)分。以上結(jié)果表明半夏的不同炮制品之間存在氣味差異，PCA模型可以用于區(qū)分半夏及其炮制品，后續(xù)可以進(jìn)一步使用有監(jiān)督模型進(jìn)一步分析。

圖4 PCA模型得分圖Fig 4 PCA model score chart

2.4.2 判別因子分析（DFA） DFA是在PCA模型的基礎(chǔ)上，擴(kuò)大組間的差異，縮小組內(nèi)的差異的一種分析方法[25-26]。DFA模型的得分圖如圖5所示，樣品按照不同的炮制方法分為4類。判別因子（DF1＝70.299%，DF2＝22.999%）的累計(jì)貢獻(xiàn)率為93.298%，DFA模型能較好地區(qū)分半夏不同炮制品。半夏沿著DF1的正半軸分布，沿著DF1方向姜半夏、法半夏、清半夏距離半夏生品的距離較遠(yuǎn)，有著明顯的界限，說明半夏經(jīng)炮制后氣味成分信息差異較大；各個(gè)炮制品中，姜半夏和法半夏主要分布在第三象限，清半夏則主要分布在第一象限，姜半夏和法半夏的距離相對較近，說明姜半夏和法半夏的氣味信息較為相似，而清半夏的氣味信息則與這兩種炮制品的氣味信息有較大的差異。半夏和不同炮制品之間距離有著明顯的界限，結(jié)果與PCA模型分析結(jié)果一致。

圖5 DFA模型得分圖Fig 5 DFA model score chart

2.4.3 偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA） 采用IBM SPSS Statistics對21個(gè)氣味色譜峰進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果如表5所示，除正己烷外的其他20個(gè)峰均有顯著性差異（P＜0.05）；采用SIMCA14.1軟件對21個(gè)峰進(jìn)行PLS-DA分析，生成的VIP圖如圖6所示。結(jié)果表明，模型解釋概率R2Y為0.967，模型預(yù)測率Q2為0.959，表明模型具有較好的解釋率和可靠性。選取VIP值大于1的變量作為潛在氣味差異標(biāo)志物。其中甲基丁香酚、二乙基酮、正十六烷、辛酸庚酯、丙烯酸丙酯的VIP值大于1，推測這5個(gè)成分是影響半夏及其炮制品氣味的差異標(biāo)志物。

圖6 半夏及其炮制品PLS-DA模型中21個(gè)色譜峰VIP值Fig 6 VIP values of 21 chromatographic peaks in PLS-DA models of Pinelliae Rhizoma and its processed products

表5 半夏及其炮制品組別間氣味成分方差分析Tab 5 Variance analysis of odor components among Pinelliae Rhizoma and its processed products

2.5 半夏不同炮制品氣味差異成分網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.5.1 差異物靶點(diǎn)預(yù)測分析 在PubChem數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound）中檢索半夏炮制前后差異性氣味成分的丁香酚、二乙基酮、正十六烷、辛酸庚酯、丙烯酸丙酯的SIMILES號，導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫（https：//www.swisstargetprediction.ch/），選擇Probability＞0.1進(jìn)行篩選和靶點(diǎn)預(yù)測分析，利用Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）將靶點(diǎn)蛋白轉(zhuǎn)換成標(biāo)準(zhǔn)基因名，篩去重復(fù)的靶點(diǎn)，最終得到與其有作用的靶點(diǎn)共133個(gè)。

2.5.2 疾病基因靶點(diǎn)的獲取 在GeneCard和DisGeNET數(shù)據(jù)庫中檢索關(guān)鍵詞“Cough”，將所得數(shù)據(jù)合并，去除重復(fù)值，獲得疾病靶點(diǎn)的相關(guān)信息，共得到了1823個(gè)作用靶點(diǎn)，將藥物主要成分與疾病基因取交集，共得到48個(gè)共同靶點(diǎn)。

2.5.3 蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將篩選的48個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫（https：//www.string-db.Org）構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，物種選擇為“Homo sapiens”，最低關(guān)聯(lián)度值選擇為＞0.4，得到差異性成分潛在作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖。將其以TSV格式導(dǎo)入Cytoscape3.9.1中，進(jìn)行可視化和拓?fù)浞治觥：Y選出標(biāo)準(zhǔn)值＞2倍Degree的中位數(shù)值，1倍Betweenness和Closeness的中位數(shù)值，篩選出發(fā)揮活性的核心靶點(diǎn)，包括Toll樣受體4（TLR4）、半胱氨酸蛋白酶3（CASP3）、雌激素受體（ESR1）、糖原合酶激酶3（GSK3B）、絲裂原激活蛋白激酶14（MAPK14）等。

2.5.4 GO功能富集和KEGG通路富集分析 利用David數(shù)據(jù)庫（https：//www.david.ncifcrf.gov/tools.jsp）對篩選的核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路富集分析。選擇生物屬性為“Homo sapiens”，標(biāo)識符號為“OFFICIAL-GENE-SYMBOL”，列表選擇為“Gene List”。GO功能富集共得206個(gè)條目，其中BP通路（biological process）206條，CC通路（cellular component）45條，MF通路（molecular function）50條。取前10條繪制為條形圖，如圖7A所示。其中BP通路主要包括對脂多糖的反應(yīng)、蛋白質(zhì)磷酸化通路、腺苷酸環(huán)化酶抑制G蛋白偶聯(lián)受體信號傳導(dǎo)通路等；CC通路主要包括質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)、高分子通路等；MF主要包括蛋白激酶信號通路、G蛋白耦聯(lián)腺苷受體信號通路、ATP結(jié)合受體通路等。共得KEGG富集的92條通路，取前20條通路，繪制KEGG氣泡圖，如圖7B所示，主要涉及的通路為PI3K-Akt信號通路、表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制通路、Coronavirus disease-COVID-19信號通路、乙型病毒型肝炎信號通路等。進(jìn)一步利用Cytoscape 3.9.1繪制“成分-靶點(diǎn)-通路”圖，如圖8所示。

圖7 GO功能富集分析（A）和KEGG通路富集分析（B）Fig 7 GO functional enrichment analysis（A）and KEGG pathway enrichment analysis（B）

圖8 半夏揮發(fā)性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)Fig 8 Volatile component-target-pathway network of Pinelliae Rhizoma

3 討論與結(jié)論

目前已有大量實(shí)驗(yàn)從半夏不同炮制品的非揮發(fā)性成分角度探究其止咳的機(jī)制，但尚未有從揮發(fā)性成分角度進(jìn)行研究的報(bào)道。氣味是中藥較為重要的一個(gè)屬性，半夏不同炮制品之間氣味差異明顯，其內(nèi)在的化學(xué)成分更是不同炮制品發(fā)揮藥效的重要依據(jù)。本研究運(yùn)用了Heracles Ⅱ超快速氣相電子鼻技術(shù)，在預(yù)實(shí)驗(yàn)考察了進(jìn)樣量、震蕩時(shí)間、震蕩溫度等實(shí)驗(yàn)條件后最終確立了最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件，實(shí)現(xiàn)了對半夏不同炮制品揮發(fā)性成分的快速檢測，獲取了相關(guān)的氣相色譜信息，并基于此建立了半夏不同炮制品的氣味指紋圖譜。電子鼻共定性出21種可能存在的氣味特征性成分，明確了炮制前后各炮制品氣味種類和相對含量的變化。半夏經(jīng)炮制后醛類成分消失，增加了如2-甲基-1-戊醇、4-三癸醇、甲基丁香酚、乙基氯、二乙基酮等醇類、酚類和其他類的成分。姜半夏的炮制過程中加入生姜能夠緩和半夏的刺激性，半夏經(jīng)炮制后揮發(fā)油的相對含量減少，揮發(fā)性成分的種類數(shù)增加，因此姜半夏炮制的減毒機(jī)制尚需進(jìn)一步研究[24]；法半夏的炮制過程中引入了甘草汁，氣味研究結(jié)果表明炮制后法半夏新增甲基丁香酚這一物質(zhì)，現(xiàn)代藥理學(xué)已證實(shí)甲基丁香酚能夠松弛氣道平滑肌，從而起到鎮(zhèn)咳、平喘的作用[25-26]，推測甘草的加入使得法半夏的止咳作用增強(qiáng)。利用PCA、DFA、PLS-DA等多元分析方法，篩選出了5種氣味差異性成分。

進(jìn)一步利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，基于篩選出的5種氣味差異性成分，探究半夏不同炮制品止咳的分子作用機(jī)制。繪制PPI網(wǎng)絡(luò)，共篩選出48個(gè)靶點(diǎn)蛋白，其中核心靶點(diǎn)蛋白包括Toll樣受體4（TLR4）、半胱氨酸蛋白酶3（CASP3）、雌激素受體（ESR1）、糖原合酶激酶3（GSK3B）、絲裂原激活蛋白激酶14（MAPK14）等。TLR4可有效殺傷T細(xì)胞及激活樹突狀細(xì)胞，在介導(dǎo)細(xì)胞因子、調(diào)控氣道炎性介質(zhì)的釋放方面具有重要的調(diào)控作用[27-29]；CASP3與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，其位于兩條細(xì)胞凋亡通路的中心，活化后可參與切割細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能蛋白，較好地反映凋亡過程[30-31]；ESR1與雌激素相關(guān)，可能在肺部疾病中起關(guān)鍵作用[32]；GSK3B參與調(diào)控糖原合成酶的活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖和凋亡等[33]，MAPK14主要參與細(xì)胞生長、分化、應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等多種細(xì)胞活動[34-35]。此外，MAPK14的激活是一種氧化和觸發(fā)黏附蛋白的調(diào)節(jié)器，能夠磷酸化激活MAPKAP2來增強(qiáng)炎性因子的表達(dá)和分泌[36]。

KEGG富集分析主要涉及的通路為PI3K-Akt信號通路、表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制通路、乙型病毒型肝炎信號通路等。研究證明，PI3K/Akt信號通路的激活會使得氣道中的炎性因子遷移到炎性病灶中，同時(shí)PI3K/Akt信號通路在支氣管哮喘中也表現(xiàn)出有效的抗炎活性[33，37]。EGFR信號通路在維持上皮細(xì)胞穩(wěn)定性、促進(jìn)氣道上皮組織修復(fù)方面起著至關(guān)重要的作用[30，38]。乙型病毒性肝炎通路表現(xiàn)為直接或間接與免疫和炎癥相關(guān)，說明半夏不同炮制品在抗炎方面發(fā)揮著一定的作用[39]。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)在比較研究半夏炮制前后成分變化的基礎(chǔ)上，聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步探討了半夏炮制增效的原理，對“藥物-成分-靶點(diǎn)”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵成分分析，發(fā)現(xiàn)原料藥材與炮制輔料均在治療疾病的過程中發(fā)揮重要作用。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的結(jié)果推測，半夏不同的炮制品中的甲基丁香酚、二乙基酮、正十六烷等物質(zhì)作為潛在的止咳有效成分，通過TLR4、CASP3、ESR1等關(guān)鍵靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)PI3K-Akt、EGFR等信號通路的激活，從而抑制組織炎癥反應(yīng)和氣道結(jié)構(gòu)重塑，發(fā)揮止咳的作用。本研究從分子作用機(jī)制的角度闡釋半夏中揮發(fā)性成分的止咳作用機(jī)制，今后將通過相關(guān)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證半夏不同炮制品在藥性與臨床止咳作用之間的聯(lián)系與差別。