陳瑞琦，熊洪，劉宏偉（廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科研究室，廣東 湛江 524001）

膀胱癌（bladder cancer，BC）是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，是世界上第十大常見癌癥[1]。數(shù)據(jù)顯示，近年來我國膀胱癌的總發(fā)病率呈上升趨勢[2]。膀胱癌根據(jù)其浸潤深度可分為肌層浸潤性膀胱癌（muscle-invasive bladder cancer，MIBC）和非肌層浸潤性膀胱癌（non muscle-invasive bladder cancer，NMIBC）[3]?，F(xiàn)階段，新輔助化療聯(lián)合根治性膀胱切除術(shù)是目前治療MIBC的標(biāo)準(zhǔn)方案，然而部分無法接受手術(shù)的患者只能采用化療、放療等方法，在治療過程中會(huì)出現(xiàn)較大的不良反應(yīng)[4]。經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)聯(lián)合術(shù)后膀胱灌注化療或免疫治療是NMIBC的常規(guī)治療方案之一，但是治療效果有限，具有很高的復(fù)發(fā)率[5]。因此，有必要尋找具有更好療效且不良反應(yīng)較小的治療膀胱癌的潛在藥物。

研究發(fā)現(xiàn)，中藥在抗腫瘤方面具有多靶點(diǎn)、不良反應(yīng)小、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)[6]。藤黃是藤黃科植物藤黃（GarciniahanburyiHook.F.）分泌出的樹脂，具有治療癰疽、損傷出血、牙疳蛀齒等作用[7]。藤黃酸（gambogic acid，GA）是從藤黃中提取的主要化合物之一，具有抗氧化、抗炎等多種功能。研究發(fā)現(xiàn)，GA可抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力，并促進(jìn)其凋亡[8]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是建立在藥物-基因-疾病的多層次網(wǎng)絡(luò)基礎(chǔ)上的新興學(xué)科，可以從整體上預(yù)測藥物的作用靶點(diǎn)[9]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選GA抑制膀胱癌的潛在作用靶點(diǎn)，通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，探討GA抑制膀胱癌的作用及可能機(jī)制，為篩選出膀胱癌的潛在輔助治療藥物提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 數(shù)據(jù)庫與軟件

PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫，PharmMapper（http：//www.lilabecust.cn/pharmmapper/）數(shù)據(jù)庫，UniProt（https：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫，GeneCards（https：//www.genecards.org）數(shù)據(jù)庫，STRING（https：//cn.string-db.org/），David（https：//david.ncifcrf.gov）數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)分析軟件Cytoscape 3.9.1，在線網(wǎng)站Venny 2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），在線網(wǎng)站微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn）。

1.2 材料

人膀胱癌UM-UC-3細(xì)胞（中科院上海細(xì)胞庫），DMEM培養(yǎng)基（貨號(hào)：C11995500BT）、胰蛋白酶（貨號(hào)：25200072）（美國 Gibco 公司），藤黃酸（成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：PCS0866），Annexin V-FITC凋亡分析試劑盒、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），胎牛血清（貨號(hào)：Z7185FBS-500）、ECL-Western blot化學(xué)發(fā)光液（貨號(hào)：310208）（美國 Zeta Life 公司），PI3 Kinase（PI3K）兔多克隆抗體、AKT 鼠單克隆抗體、Phospho-AKT（p-AKT）鼠單克隆抗體（美國Proteintech公司），Phospho-PI3 Kinase（p-PI3K）兔多克隆抗體（美國GeneTex公司），Cell counting Kit-8試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所），Transwell小室（美國Corning公司），基質(zhì)膠（廣州市沃德生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 獲取GA的作用靶點(diǎn)

在PubChem數(shù)據(jù)庫以“gambogic acid”為關(guān)鍵詞獲取GA 的3D結(jié)構(gòu)式的sdf文件，將文件上傳至 PharmMapper 數(shù)據(jù)庫，得到GA作用靶點(diǎn)，再將靶點(diǎn)上傳至 UniProt 數(shù)據(jù)庫，通過ID mapping匹配靶點(diǎn)的基因名稱。

2.2 獲取膀胱癌的靶基因

以 “bladder cancer”為關(guān)鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索膀胱癌的相關(guān)靶基因。

2.3 獲取GA抑制膀胱癌的潛在靶基因

通過在線網(wǎng)站 Venny 2.1.0，取前兩步獲取的GA作用靶點(diǎn)和膀胱癌相關(guān)靶基因的交集，得到GA抑制膀胱癌的潛在靶基因。

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將GA抑制膀胱癌的潛在靶基因上傳至 STRING數(shù)據(jù)庫，設(shè)置物種為“Homo sapiens”，最低互動(dòng)分?jǐn)?shù)要求＞0.400，隱藏網(wǎng)絡(luò)中斷開的節(jié)點(diǎn)，并將tsv數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1分析，通過Betweeness Centrality算法得到潛在靶基因的中介中心性。

2.5 GO和KEGG分析

將得到的中介中心性最高的20個(gè)潛在靶基因上傳至 DAVID 數(shù)據(jù)庫，限制物種為“Homo sapiens”，選擇GO 生物過程（BP）、細(xì)胞組分（CC）、分子功能（MF），KEGG 通路進(jìn)行分析，將所得結(jié)果通過在線網(wǎng)站微生信進(jìn)行可視化處理。

2.6 GA溶液的制備

將GA粉末配制成1000 μmol·L－1的GA水溶液，避光儲(chǔ)存于－20℃冰箱，實(shí)驗(yàn)時(shí)稀釋成實(shí)驗(yàn)所需濃度。

2.7 細(xì)胞培養(yǎng)和分組

將UM-UC-3細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，使用DMEM完全培養(yǎng)基（10%濃度胎牛血清），置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至80%以上時(shí)傳代。實(shí)驗(yàn)時(shí)按照GA藥物濃度（0、40、80、160 μmol·L－1）分為4組，0 μmol·L－1組為對照組。

2.8 CCK-8實(shí)驗(yàn)

取對數(shù)生長期UM-UC-3細(xì)胞，接種于96孔板，每孔3×103個(gè)細(xì)胞，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后棄舊培養(yǎng)基，分別加入含有不同濃度GA的培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，取出96孔板，每孔加入10 μL CCK-8 試劑，避光孵育2 h后檢測各孔在 450 nm 波長處的光密度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。增殖抑制率（%）＝（對照組OD值－實(shí)驗(yàn)組OD值）/對照組OD值×100%。

2.9 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)

取對數(shù)生長期UM-UC-3細(xì)胞，以每孔1×103個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，24 h后棄舊培養(yǎng)基，分別加入含有不同濃度GA的培養(yǎng)基，10 d后棄培養(yǎng)基，用PBS清洗，4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染液染色，沖洗、晾干后拍照，計(jì)算克隆形成數(shù)目。

2.10 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

取對數(shù)生長期UM-UC-3細(xì)胞，接種于6孔板，待細(xì)胞生長濃度超過90%后用200 μL規(guī)格的移液槍頭劃痕，棄舊培養(yǎng)基，分別加入含有不同濃度GA的培養(yǎng)基，顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野拍照，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取出，在相同位置拍照，用Image J軟件測量劃痕面積，計(jì)算劃痕愈合率。劃痕愈合率（%）＝（0 h劃痕面積－24 h劃痕面積）/0 h劃痕面積×100%。

2.11 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)

取對數(shù)生長期UM-UC-3細(xì)胞，接種于6孔板，待細(xì)胞完全貼壁后棄舊培養(yǎng)基，分別加入含有不同濃度GA的培養(yǎng)基，24 h后棄培養(yǎng)基，胰蛋白酶消化后用不含血清的DMEM培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度，取200 μL細(xì)胞懸液（含4×104個(gè)細(xì)胞）加入上室，下室加入600 μL DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取出小室，4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染液染色，沖洗、晾干后隨機(jī)選取3個(gè)視野拍照，計(jì)算細(xì)胞遷移數(shù)。

2.12 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

用無血清DMEM培養(yǎng)基按8∶1的比例稀釋基質(zhì)膠，取50 μL稀釋后的基質(zhì)膠鋪于Transwell小室并放入培養(yǎng)箱，待基質(zhì)膠凝固后取出，其余步驟同“2.1.1”項(xiàng)下Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)。

2.13 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

取對數(shù)生長期UM-UC-3細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞完全貼壁后棄舊培養(yǎng)基，分別加入含有不同濃度GA的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取出，收集培養(yǎng)基和貼壁細(xì)胞，重懸，取1×106個(gè)細(xì)胞，PBS清洗，離心后棄PBS，使用195 μL Annexin V-FITC結(jié)合緩沖液制成細(xì)胞懸液并移入流式管，分別加入5 μL Annexin V和10 μL PI，避光孵育20 min，使用流式細(xì)胞儀分析。

2.14 Western blot 實(shí)驗(yàn)

取對數(shù)生長期UM-UC-3細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，分別加入含有不同濃度GA的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)基，PBS清洗，提取總蛋白，BCA法測蛋白濃度，加熱變性，置于－20℃冰箱保存。SDSPAGE凝膠配制試劑盒配置凝膠，每孔上樣30 μg，經(jīng)電泳、電轉(zhuǎn)、封閉、切膜后加入對應(yīng)一抗（GAPDH 1∶10 000，F(xiàn)oxO1 1∶2000，AKT 1∶2000，p-AKT 1∶2000，PI3K 1∶500，p-PI3K 1∶500），置于4℃冰箱孵育過夜。次日取出條帶，洗膜3次后分別加入對應(yīng)二抗，孵育1 h，洗膜3次，化學(xué)發(fā)光法曝光成像，Image J軟件統(tǒng)計(jì)分析蛋白相對表達(dá)水平。

2.15 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用 SPSS 26.0和GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 GA抑制膀胱癌的潛在靶點(diǎn)

通過PubChem獲得GA的3D結(jié)構(gòu)式（見圖1），通過PharmMapper數(shù)據(jù)庫和UniProt數(shù)據(jù)庫獲得有效靶點(diǎn)219個(gè)；通過GeneCards數(shù)據(jù)庫獲取膀胱癌相關(guān)基因11 618個(gè)。將兩者上傳至Venny 2.1.0，取交集，得到GA抑制膀胱癌的潛在靶點(diǎn)57個(gè)。

圖1 藤黃酸的3D結(jié)構(gòu)式Fig 1 3D structural formula of gambogic acid

3.2 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和核心靶點(diǎn)分析

通過使用STRING數(shù)據(jù)庫，得到GA抑制膀胱癌潛在靶點(diǎn)的蛋白互作圖（見圖2），其中節(jié)點(diǎn)數(shù)量55個(gè)，邊數(shù)60條，平均節(jié)點(diǎn)度2.18，平均局部聚類系數(shù)為0.416，蛋白互作富集P值為0.007 48。Betweeness Centrality算法得到中介中心性最高的20個(gè)靶點(diǎn)，見表1。

表1 藤黃酸抑制膀胱癌的潛在靶點(diǎn)(前20)Tab 1 Potential targets of inhibition of bladder cancer induced by gambogic acid (Top 20)

圖2 藤黃酸抑制膀胱癌的潛在靶點(diǎn)的蛋白互作圖Fig 2 Protein-protein interaction diagram of the potential targets of inhibition of bladder cancer induced by gambogic acid

3.3 GO和KEGG分析

將中介中心性最高的20個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析，得到GO分析條目66條，其中包括維持中性粒細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)等26個(gè)BP；囊泡膜等17個(gè)CC；參與氧氣轉(zhuǎn)運(yùn)等28個(gè)MF，見圖3；KEGG 通路富集分析顯示GA抑制膀胱癌可能與PI3K/AKT、FoxO1、HIF-1等信號(hào)通路相關(guān)，見圖4。通過查閱文獻(xiàn)得知FoxO1作為FoxO家族的成員可以抑制膀胱癌，故后續(xù)選擇FoxO1進(jìn)行驗(yàn)證。

圖3 藤黃酸抑制膀胱癌的20個(gè)潛在靶基因的GO富集分析Fig 3 GO enrichment analysis of 20 potential target genes which inhibit bladder cancer by gambogic acid

圖4 藤黃酸抑制膀胱癌的20個(gè)潛在靶基因的KEGG通路富集分析Fig 4 KEGG pathway enrichment analysis of 20 potential target genes which inhibit bladder cancer by gambogic acid

3.4 GA抑制UM-UC-3細(xì)胞的增殖能力

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GA處理24 h后，與對照組相比，各實(shí)驗(yàn)組UM-UC-3細(xì)胞的增殖均受到抑制，見表2；細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，各實(shí)驗(yàn)組的克隆形成數(shù)目均降低，見圖5。提示GA可抑制UM-UC-3細(xì)胞的增殖能力。

表2 藤黃酸對UM-UC-3細(xì)胞增殖能力的影響(±s，n＝3)Tab 2 Effect of gambogic acid on the proliferation ability of UM-UC-3 cells (±s，n＝3)

表2 藤黃酸對UM-UC-3細(xì)胞增殖能力的影響(±s，n＝3)Tab 2 Effect of gambogic acid on the proliferation ability of UM-UC-3 cells (±s，n＝3)

注：與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。Note：Compared with the control group，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001.

組別藥物作用時(shí)間OD值增殖抑制率/%對照組GA 40 μmol·L－1組GA 80 μmol·L－1組GA 160 μmol·L－1組24 h1.64±0.11－24 h1.43±0.08*13.79±1.23 24 h1.30±0.12**21.52±2.79 24 h1.08±0.05***36.92±3.40對照組GA 40 μmol·L－1組GA 80 μmol·L－1組GA 160 μmol·L－1組48 h3.46±0.02－48 h2.59±0.04***22.67±3.52 48 h2.11±0.10***37.01±2.41 48 h1.42±0.18***55.05±0.94 72 h4.22±0.08－72 h2.59±0.05***38.54±0.61 72 h1.98±0.05***53.09±2.12 72 h1.44±0.01***65.76±0.47對照組GA 40 μmol·L－1組GA 80 μmol·L－1組GA 160 μmol·L－1組

圖5 藤黃酸對UM-UC-3細(xì)胞克隆形成能力的影響Fig 5 Effect of gambogic acid on the colony formation of UM-UC-3 cells

3.5 GA抑制UM-UC-3細(xì)胞的遷移和侵襲能力

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GA處理24 h后，與對照組相比，各實(shí)驗(yàn)組UM-UC-3細(xì)胞的劃痕愈合面積降低，見圖6；Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GA處理24 h后，與對照組相比，各實(shí)驗(yàn)組UMUC-3細(xì)胞的遷移和侵襲數(shù)均降低，見圖7。提示GA抑制UM-UC-3細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

圖6 藤黃酸對UM-UC-3細(xì)胞遷移能力的影響（×200）Fig 6 Effect of gambogic acid on the migration of UM-UC-3 cells（×200）

圖7 藤黃酸對UM-UC-3細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響（×200）Fig 7 Effect of gambogic acid on the migration and invasion ability of UM-UC-3 cells（×200）

3.6 GA促進(jìn)UM-UC-3細(xì)胞的凋亡

細(xì)胞凋亡檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GA處理24 h后，與對照組相比，各實(shí)驗(yàn)組UM-UC-3細(xì)胞的凋亡率均增加，見圖8。提示GA可促進(jìn)UM-UC-3細(xì)胞的凋亡。

圖8 藤黃酸對UM-UC-3細(xì)胞凋亡的影響Fig 8 Effect of gambogic acid on the apoptosis of UM-UC-3 cells

3.7 GA調(diào)控UM-UC-3細(xì)胞PI3K/AKT/FoxO1信號(hào)通路的表達(dá)

Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GA處理24 h后，與對照組相比，各實(shí)驗(yàn)組UM-UC-3細(xì)胞的AKT蛋白表達(dá)水平未見變化，PI3K、p-PI3K均下調(diào)，F(xiàn)oxO1表達(dá)量上調(diào)；與對照組相比，GA 80、160 μmol·L－1組 UM-UC-3細(xì)胞的p-AKT表達(dá)量下調(diào)，見圖9。提示GA可以下調(diào)PI3K、p-PI3K、p-AKT的表達(dá)，上調(diào)FoxO1的表達(dá)。

圖9 藤黃酸對UM-UC-3細(xì)胞PI3K/AKT/FoxO1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig 9 Effect of gambogic acid on the expression of PI3K/AKT/FoxO1 signaling pathway-related proteins in UM-UC-3 cells

4 討論

研究表明，中藥可以直接抑制腫瘤的進(jìn)展，也能減少化療、放療引起的不良反應(yīng)，目前已經(jīng)被廣泛運(yùn)用于腫瘤的輔助治療上，具有一定的療效[10]。GA是近年的研究熱點(diǎn)之一，有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)GA具有抗腫瘤作用。例如GA以劑量依賴的方式抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖能力，并誘導(dǎo)其凋亡[11]。此外，GA可以抑制結(jié)腸癌HCT116和CT26細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并引發(fā)抗腫瘤免疫反應(yīng)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，GA處理后UM-UC-3細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力均下降，提示GA可以抑制UM-UC-3細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，GA處理后UM-UC-3細(xì)胞的凋亡率高于對照組，提示GA可以促進(jìn)UM-UC-3細(xì)胞的凋亡。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，篩選出57個(gè)GA抑制膀胱癌的潛在靶點(diǎn)，其中EP300和NOS2是中介中心性最高的兩個(gè)靶點(diǎn)。研究表明，EP300在膀胱癌中易發(fā)生突變，引起抗腫瘤免疫反應(yīng)[13]。NOS2已被證明在多種癌癥中高表達(dá)，并且可作為癌癥預(yù)后的不良預(yù)測因子[14]。KEGG通路富集分析顯示GA抑制膀胱癌與PI3K/AKT、HIF-1和FoxO1信號(hào)通路具有較高相關(guān)性。HIF-1是一個(gè)在生物體代謝過程中起關(guān)鍵作用的調(diào)節(jié)因子，在多種良性或惡性腫瘤的表達(dá)均上調(diào)[15]。FoxO是一個(gè)可調(diào)節(jié)多種生物過程的轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞的衰老、凋亡、分化、DNA損傷修復(fù)等方面都能發(fā)揮功能，并且具有抑癌作用[16]。PI3K/AKT信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)最重要的信號(hào)通路之一，參與多種細(xì)胞功能；但PI3K/AKT信號(hào)通路在癌癥的發(fā)展過程中往往會(huì)過度激活，促進(jìn)癌癥的發(fā)展[17]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO轉(zhuǎn)錄因子在多種癌癥的發(fā)展過程中會(huì)作為PI3K/AKT信號(hào)通路的下游靶點(diǎn)而受到抑制[18]。例如PI3K/AKT信號(hào)通路通過抑制FoxO1的磷酸化，調(diào)控hnRNP-F蛋白的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)膀胱癌的增殖[19]。因此，本研究選擇PI3K/AKT/FoxO1通路，通過Western blot進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示GA可以下調(diào)PI3K、p-PI3K、p-AKT的表達(dá)，并上調(diào)FoxO1的表達(dá)，所以推測GA抑制膀胱癌的作用可能和PI3K/AKT/FoxO1信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法，探討了GA抑制膀胱癌的作用及可能機(jī)制。研究表明，GA可以抑制膀胱癌UM-UC-3細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力，并促進(jìn)其凋亡；其機(jī)制可能與調(diào)控PI3K/AKT/FoxO1信號(hào)通路有關(guān)。但本研究存在一定的不足之處，研究機(jī)制不夠深入，后續(xù)需通過挽救實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。