朱雅欣，伍國(guó)強(qiáng)，魏 明

（蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院, 甘肅 蘭州 730050）

豆科牧草因其蛋白質(zhì)含量高、適口性好、能與根瘤菌共生、生物固氮等特點(diǎn)，在我國(guó)北方干旱、半干旱地區(qū)被廣泛種植，成為當(dāng)?shù)刂鲗?dǎo)產(chǎn)業(yè)之一。優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗逆性強(qiáng)的牧草新品種是我國(guó)畜牧業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)，也是改善我國(guó)退化草地的需要，關(guān)系到國(guó)家的糧食安全和生態(tài)安全[1]。然而，我國(guó)畜牧業(yè)集中的西北地區(qū)氣候環(huán)境惡劣、土地貧瘠，牧草生長(zhǎng)面臨著嚴(yán)重逆境脅迫。以病原體感染和昆蟲(chóng)侵害導(dǎo)致的宿主植株生物量減少甚至死亡及食草動(dòng)物過(guò)度啃食導(dǎo)致的植物生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、植被退化的生物脅迫和干旱、鹽堿、冷害、紫外線(xiàn)、重金屬毒害等非生物脅迫為主[2]，其中干旱、鹽堿、極端溫度是影響植物分布、限制農(nóng)作物產(chǎn)量和威脅糧食安全的主要因素。因此，有必要培育抗逆性強(qiáng)的豆科牧草以滿(mǎn)足我國(guó)畜牧業(yè)不斷增長(zhǎng)的高品質(zhì)飼草的需求[3]。

傳統(tǒng)育種方法周期長(zhǎng)、效率低，難以獲得高品質(zhì)牧草。采用多種方法修改基因組DNA 序列的基因工程技術(shù)可解決這一問(wèn)題[4]。隨著基因工程的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)大大縮短了傳統(tǒng)育種的周期，并使人們能夠按照需求將特定基因在不同植物中表達(dá)，為豆科牧草的抗逆性遺傳改良提供新思路。例如，苜蓿(Medicago)和大豆(Glycine max)突變文庫(kù)的構(gòu)建和基于CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的高效基因組編輯方案的建立為豆科牧草的研究和分子育種提供了關(guān)鍵基礎(chǔ)[5-6]。隨著基因工程技術(shù)的研究不斷深入，除了作為飼草，牧草相關(guān)產(chǎn)品在環(huán)保和食品領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用，包括作為景觀植物、參與土壤修復(fù)、功能性食品研發(fā)等[7]。因此，利用基因工程技術(shù)改良豆科牧草的抗逆性具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 豆科牧草轉(zhuǎn)基因技術(shù)

1.1 豆科牧草再生體系

優(yōu)良基因遺傳改良作物的前提是構(gòu)建高效、成熟的組織培養(yǎng)和植株再生體系。組織培養(yǎng)是利用植物細(xì)胞的“全能性”特點(diǎn)，將分離出的植物組織、細(xì)胞、原生質(zhì)體等置于適宜條件下，誘發(fā)其形成愈傷組織，并進(jìn)而獲得完整植株[8]。其主要包括選取外植體、選擇培養(yǎng)基、確定植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類(lèi)及濃度等關(guān)鍵技術(shù)和環(huán)節(jié)。一般來(lái)說(shuō)，可用于誘導(dǎo)愈傷組織的外植體有真葉、葉柄、子葉、子葉節(jié)、下胚軸和根等；不同物種間甚至同一物種不同品種間，出愈率高、愈傷生長(zhǎng)狀況良好的外植體材料也不盡相同[9-12]。康紅霞等[13]研究發(fā)現(xiàn)，豆科“牧草皇后”紅豆草(Onobrychis viciaefolia)的上胚軸、真葉和下胚軸均可誘導(dǎo)形成愈傷組織，其中下胚軸愈傷生長(zhǎng)松散、芽點(diǎn)多，而真葉形成的愈傷出芽快、玻璃化率低。另外，不同物種間植株再生體系周期差別不大，需要60～70 d。激素在整個(gè)再生過(guò)程中扮演著重要角色，可在MS、SH、B5 等基本培養(yǎng)基上有選擇地添加生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素，探索合適的激素種類(lèi)、配比和濃度。常用的生長(zhǎng)素有2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid, 2,4-D)、 萘 乙 酸(naphthlcetic acid, NAA)、吲哚乙酸(3-indoleacetic acid,IAA)等，細(xì)胞分裂素有6-糠氨基嘌呤(kinetin, KT)、玉米素(zeatin, ZT)、6-芐氨基嘌呤[N-(phenylmethyl)-9Hpurin-6-amine, 6-BA]、異戊烯腺嘌呤(z-ip)等[14-15](表1)。

表1 不同豆科牧草的再生體系Table 1 Regeneration systems of different legume forages

1.2 豆科牧草遺傳轉(zhuǎn)化方法

遺傳轉(zhuǎn)化是植物科學(xué)領(lǐng)域功能基因組學(xué)研究和分子育種的關(guān)鍵技術(shù)，可在植物特殊的發(fā)育階段或成熟的植物組織培養(yǎng)體系基礎(chǔ)上利用分子生物學(xué)工具將重組DNA 導(dǎo)入生物體[16](表2)。開(kāi)發(fā)安全、高效、新穎的遺傳轉(zhuǎn)化方法已成為基因工程、分子生物學(xué)和遺傳育種領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。目前常用的遺傳轉(zhuǎn)化方法有DNA 直接導(dǎo)入法和農(nóng)桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)法。

表2 豆科牧草遺傳轉(zhuǎn)化方法Table 2 Methods for the genetic transformation of legume forages

1.2.1 直 接導(dǎo)入法

外源基因直接導(dǎo)入法是利用基因槍、顯微注射、電激等方式(表2)，把外源目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，繼而得到轉(zhuǎn)基因植株的方法。Pereira 和Erickson 等[22]采用基因槍法把nptⅡ?qū)胲俎?，獲得了7 株陽(yáng)性植株。粒子槍轟擊法在鷹嘴豆(Cicer arietinum)高頻轉(zhuǎn)化研究中，金微載體因惰性對(duì)細(xì)胞毒性較小且比鎢載體有更高的轉(zhuǎn)化效率?；驑尫ㄞD(zhuǎn)化效率與農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法相比仍需優(yōu)化，且外源基因?qū)爰?xì)胞后存在沉默且拷貝數(shù)不穩(wěn)定的問(wèn)題。顯微注射法是把基因包裹在重金屬粒子上，脫水后將其高速推進(jìn)細(xì)胞內(nèi)；具有物種獨(dú)立性、操作簡(jiǎn)單、基因傳遞量大等優(yōu)點(diǎn)[18]。電激法在電場(chǎng)脈沖作用下，基因通過(guò)瞬時(shí)氣孔轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中；具有快捷、經(jīng)濟(jì)、效率高等特點(diǎn)[19]。DNA 直接轉(zhuǎn)化法早期主要用于單子葉植物以及部分不適合用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的植物的遺傳轉(zhuǎn)化，該方法逐漸被農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法取代[23]。

1.2.2 農(nóng) 桿菌介導(dǎo)法

Horsch 等[24]在植物組織培養(yǎng)技術(shù)的條件下創(chuàng)造了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。實(shí)驗(yàn)室常用農(nóng)桿菌菌株有發(fā)根農(nóng)桿菌(A.rhizogenes)和根癌農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)，當(dāng)農(nóng)桿菌侵染外植體傷口時(shí)，在植物傷口分泌的小分子酚類(lèi)化合物的誘導(dǎo)下Ti 質(zhì)粒產(chǎn)生的T-DNA 單鏈分子可進(jìn)入并整合到植物細(xì)胞染色體上。Deak等[25]首次將該方法用于紫花苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化研究并得到首株轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿植株。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法具有效率高、成本低、轉(zhuǎn)化穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)(表2)。因此，在轉(zhuǎn)基因牧草的研究中得到了廣泛應(yīng)用。植物逆境生理與基因工程課題組前期也利用該方法，將甜菜(Beta vulgaris)蔗糖非發(fā)酵-1-相關(guān)蛋白激酶 2(sucrose non-fermenting-1-related protein kinase 2,SnRK2)基因轉(zhuǎn)入紅豆草并獲得陽(yáng)性植株，為培育紅豆草新品種(系)提供新種質(zhì)材料。

另外，真空滲透、超聲輔助和熱處理等手段也可提高農(nóng)桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化效率[26-27]。功能性肽聚合物包埋碳納米管載體可克服分子傳遞過(guò)程中細(xì)胞壁屏障對(duì)生物分子的阻礙作用[28]。質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)則解決了部分植物核基因組不易整合目的基因的問(wèn)題[29]。外源添加促誘導(dǎo)因子如氧化鐵納米顆粒(iron oxide nanoparticles, IONPs)可提高遺傳轉(zhuǎn)化效率[30]。納米材料具有物種獨(dú)立性、操作簡(jiǎn)單、生物相容性、裝載力高、轉(zhuǎn)化效率高等優(yōu)勢(shì)[16]。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在植物遺傳轉(zhuǎn)化上的應(yīng)用將不斷擴(kuò)大。

2 豆科牧草抗逆基因工程

2.1 豆科牧草抗生物逆境基因工程

病蟲(chóng)害是牧草生產(chǎn)所面臨的主要生物脅迫，可直接導(dǎo)致牧草的減產(chǎn)甚至死亡。牧草在栽培過(guò)程中主要受到葉點(diǎn)霉葉斑病(Phyllosticta)、根腐病(Fusariumsolani)、棉鈴蟲(chóng)(Heliothis armigera)、蚜蟲(chóng)(Aphidoidea)等病蟲(chóng)害的影響。在儲(chǔ)存條件下，馬蹄金甲蟲(chóng)(Coleoptera)也會(huì)造成收獲的農(nóng)產(chǎn)品大量損失。為了防治害蟲(chóng)，人們不得不采用化學(xué)法來(lái)確保牧草產(chǎn)量，但化學(xué)農(nóng)藥對(duì)生態(tài)環(huán)境以及昆蟲(chóng)種群內(nèi)抗性演變的影響卻是不可避免的[31]。在使用抗菌劑后，細(xì)菌蛋白質(zhì)的改變、酶的降解以及膜對(duì)抗菌劑通透性的改變等會(huì)使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。

為抵御生物脅迫，植物在進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生了特定抗性(resistance, R)蛋白。在感染宿主過(guò)程中，病原體產(chǎn)生的效應(yīng)分子可阻礙植物細(xì)胞表面模式識(shí)別受體(pattern-recognition receptors, PRRs)識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMP)以抑制植物抗性[32]，此時(shí)R 蛋白可為植物提供針對(duì)特定病原體效應(yīng)物的保護(hù)。因此，編碼R 蛋白的基因被廣泛用于植物對(duì)特定病原體抗性的研究中[33-34]。如，蒺藜苜蓿(M.truncatula)RCT1的表達(dá)使三葉草(Frifolium)獲得了對(duì)炭疽病(Colletotrichum trifolii)的抗性[35]。但由于病原體進(jìn)化得相當(dāng)快，這種由一個(gè)基因控制，簡(jiǎn)單實(shí)現(xiàn)特定抗性的方法很難賦予植物穩(wěn)定的長(zhǎng)期抗性。因此，聚合水稻(Oryza sativa)R基 因 和 數(shù) 量 性 狀 位 點(diǎn)(quantitative trait loci,QTL)同時(shí)發(fā)揮作用增強(qiáng)豆科牧草中R 蛋白耐受性和抗性的研究[36]為豆科牧草R 蛋白的應(yīng)用提供新思路。除此之外，培育抗病豆科牧草還可從蛋白酶、α-淀粉酶抑制劑、凝集素、幾丁質(zhì)酶和多酚氧化酶等五大類(lèi)植物防御肽入手[37]。

2.1.1 生 物毒素

植物在自然界長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，產(chǎn)生各種生物毒素，以抵御高等動(dòng)物或疾病的侵襲，使自己免受傷害。其中，抗菌肽(antimicrobial peptides, APM)作為植物先天免疫系統(tǒng)中的關(guān)鍵組成部分，是植物為對(duì)抗病原體、適應(yīng)陸地生活而進(jìn)化的。APMs 為廣譜抑菌劑，可調(diào)節(jié)細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物、植物、昆蟲(chóng)和動(dòng)物等各種生物的免疫系統(tǒng)，且?guī)缀鯚o(wú)毒副作用[38]。Mustafa 等[39]分析了10 種AMP 與不同多藥耐藥菌株的結(jié)合模式，發(fā)現(xiàn)蛇皮肽(snakin-1, SN1)抑菌效果最佳。過(guò)量表達(dá)紫花苜蓿MsSN1的轉(zhuǎn)基因植株對(duì)引起炭疽病的炭疽菌和引起葉斑病的莖點(diǎn)霉均有明顯的抗性，受感染的葉片數(shù)顯著低于野生型植株[40]。此外，過(guò)量表達(dá)異黃酮甲基轉(zhuǎn)移酶(isoflavone O-methyltransferase,IOMT)基因使得苜蓿受到苜蓿莖點(diǎn)霉侵染后，葉片中抗毒素積累量增加，對(duì)該病原體的抗性顯著增強(qiáng)[41]。苜蓿遭受薊馬(Thrips alliorum)危害后，植株體內(nèi)類(lèi)黃酮和異黃酮顯著富集[42]，表明過(guò)量表達(dá)IOMT有望用于薊馬防治。研究表明，外源基因同樣可賦予豆科牧草抗生物脅迫的能力。在紫花苜蓿中異源表達(dá)花生(Arachis hypogaea) 白藜蘆醇合酶(resveratrol synthase,RS)基因可使轉(zhuǎn)基因植株積累白藜蘆醇衍生物(反式白藜蘆醇)，并對(duì)真菌莖點(diǎn)霉的抗性顯著增強(qiáng)，且無(wú)任何負(fù)面形態(tài)學(xué)影響[43]。這些結(jié)果表明，生物毒素的研究為提高豆科牧草抗生物脅迫能力奠定理論基礎(chǔ)。

2.1.2 酶類(lèi)

植物細(xì)胞分泌的幾丁質(zhì)酶參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育，當(dāng)植物遭遇真菌感染時(shí)，則可消化真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)，是生物防治病害的手段之一[44-45]。Tesfaye 等[46]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因苜蓿植株地上部和根部分泌物中的幾丁質(zhì)酶不僅保留對(duì)乙二醇幾丁質(zhì)的裂解活性，而且還顯著抑制苜蓿莖點(diǎn)霉和刺盤(pán)孢菌(Sclerotinia sclerotiorum)兩種真菌病原體的孢子萌發(fā)。溶菌酶本身是一種天然無(wú)毒性卻能夠使目標(biāo)微生物細(xì)胞壁溶解而使其喪失活性的蛋白質(zhì)，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌都有效[47]。對(duì)含有厚肽聚糖的革蘭氏陽(yáng)性菌，溶菌酶主要通過(guò)水解肽聚糖層中存在的N-乙酰壁酸和N-乙酰葡萄糖胺單元之間的β 鍵來(lái)使細(xì)菌失活[48]；對(duì)于革蘭氏陰性菌，通常是存在金屬離子螯合劑的情況下通過(guò)破壞外膜的穩(wěn)定性達(dá)到殺菌目的[49]。張靜[12]采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將LYZ-GFP雙元基因?qū)? 個(gè)苜蓿品種，并獲得了含有溶菌酶基因的轉(zhuǎn)基因植株。這些結(jié)果表明，過(guò)量表達(dá)幾丁質(zhì)酶、溶菌酶等酶類(lèi)編碼基因可顯著增強(qiáng)豆科牧草的抗病性。

2.1.3 酶 抑制劑

植物分泌酶抑制劑如單寧，抑制昆蟲(chóng)生長(zhǎng)所需的酶的活性。與抗蟲(chóng)密切相關(guān)的縮合單寧能與昆蟲(chóng)體內(nèi)的消化酶結(jié)合并沉淀蛋白質(zhì)，抑制消化酶活性，賦予植物抵御蟲(chóng)害的能力[50]。董文科等[51]將紅豆草OvBAN/bar轉(zhuǎn)入紫花苜蓿中，盡管轉(zhuǎn)基因株系拷貝數(shù)不同，但與野生型相比均有較高的花青素還原酶活性及縮合單寧含量，對(duì)蚜蟲(chóng)的抑制率高達(dá)78%～93%。由此表明，提高酶抑制劑含量可顯著增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲(chóng)性。

另外，豆科牧草害蟲(chóng)之一的棉鈴蟲(chóng)對(duì)蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)編碼的δ-內(nèi)毒素敏感。從菜豆(Phaseolus vulgaris)中分離出來(lái)的α-淀粉酶抑制劑基因αAI1，能有效控制布魯氏菌[52]。αAI1可抑制綠豆象(Callosobruchus chinensis)和四紋豆象(Callosobruchus maculatus)腸道中淀粉酶活性，攝入該蛋白質(zhì)會(huì)導(dǎo)致布魯氏菌的緩慢生長(zhǎng)和死亡，這在轉(zhuǎn)基因鷹嘴豆進(jìn)行的昆蟲(chóng)生物測(cè)試中得以印證[53]。過(guò)量表達(dá)CryIC的轉(zhuǎn)基因苜蓿對(duì)灰翅夜蛾(Spodoptera litura)和小菜蛾(Plutella xylostella)的抗性顯著增強(qiáng)[54-55]。另外，將Cry1Ac轉(zhuǎn)入鷹嘴豆后，棉鈴蟲(chóng)和灰翅夜蛾對(duì)種子的侵害降低至7%[22,56]。然而，只表達(dá)一個(gè)cry的轉(zhuǎn)基因作物可能會(huì)導(dǎo)致抗性棉鈴蟲(chóng)種群的進(jìn)化。篩選表達(dá)更高毒性蛋白的菌株[57]，改進(jìn)Bt 蛋白表達(dá)方式[58]，培育不同cry突變體菌株[59]，可為α-淀粉酶抑制劑在豆科牧草抗蟲(chóng)害的研究提供更多思路。另外，兼?zhèn)錃⒕蜌⑾x(chóng)特性的CLP基因通過(guò)抑制真菌木聚糖酶抑制真菌生長(zhǎng)[60]，也已用于轉(zhuǎn)基因植物開(kāi)發(fā)[61]。

2.1.4 凝 集素

面對(duì)生物安全問(wèn)題，人們賦予毒性水平低的凝集素較高期望。凝集素是不具有酶活性的蛋白質(zhì)，由一個(gè)或多個(gè)凝集素結(jié)構(gòu)域組成，具有特異性識(shí)別并可逆結(jié)合碳水化合物結(jié)構(gòu)，且不改變碳水化合物組成部分的能力[62]。豆科植物凝集素結(jié)構(gòu)域通常含有Mn2+、Ca2+等金屬離子，是唯一需要金屬離子才能發(fā)揮活性的凝集素結(jié)構(gòu)域[63]。凝集素具有不同的分子結(jié)構(gòu)、生化和生物物理特性，因而也具有不同的生物學(xué)功能，但結(jié)構(gòu)域與其特異性之間沒(méi)有明確的相關(guān)性[64]。在植物抵抗生物脅迫時(shí)，凝集素的凝集活性與識(shí)別紅細(xì)胞表面的碳水化合物結(jié)構(gòu)有關(guān)[65]。豆蚜(Aphis craccivora)是影響鷹嘴豆生長(zhǎng)的害蟲(chóng)之一，它以韌皮部為主要入侵點(diǎn)，吸食植株體內(nèi)汁液。大蒜(Allium sativum)凝集素基因遺傳改良后的鷹嘴豆在韌皮部特異性啟動(dòng)子rolC的控制下，可在取食部位特異性地靶向毒素，使豆蚜存活率和繁殖力分別下降到11%～26%和22%～42%[66]。利用位點(diǎn)突變技術(shù)，特異性地改變凝集素構(gòu)象還可提高凝集素毒性，進(jìn)一步控制豆科牧草病蟲(chóng)害[67]，也為豆科牧草抗蟲(chóng)性遺傳改良提供理論支撐。

2.2 豆科牧草抗非生物逆境基因工程

干旱、寒冷、鹽堿等是牧草生長(zhǎng)面臨的主要環(huán)境因素[68-69]，也是人們培育優(yōu)良牧草所面臨的重要問(wèn)題。干旱脅迫可引起滲透脅迫初級(jí)信號(hào)，鹽脅迫可同時(shí)給植物帶來(lái)滲透脅迫和離子毒害雙重壓力。干旱和鹽脅迫都能引發(fā)氧化脅迫、脂膜破壞、蛋白質(zhì)及核酸變化等次級(jí)信號(hào)，從而引起代謝紊亂以至影響植株生長(zhǎng)發(fā)育[70]。

2.2.1 抗 旱基因工程

大量研究表明，過(guò)量表達(dá)抗旱基因可顯著提高豆科牧草的抗旱性(表3)。將霸王(Zygophyllum xanthoxylon)ZxABCG11轉(zhuǎn)入紫花苜蓿后，發(fā)達(dá)的角質(zhì)層結(jié)構(gòu)可減少植物表皮的蒸騰作用從而提高苜蓿的抗旱能力[71]。ABP9通過(guò)正向調(diào)節(jié)脫落酸(abscisic acid, ABA)信號(hào)來(lái)增強(qiáng)植物對(duì)多種脅迫的耐受性[72]。過(guò)量表達(dá)玉米(Zea mays)ZmABP9可使轉(zhuǎn)基因苜蓿的耐旱性顯著增強(qiáng)[73]。此外，過(guò)量表達(dá)擬南芥(Arabidopsis thaliana)AtDREB1A可降低轉(zhuǎn)基因鷹嘴豆在干旱脅迫下的蒸騰作用，增加生物量向地上部的分配，改變生根模式[74]。這些結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄因子對(duì)豆科牧草表皮蒸騰作用的調(diào)節(jié)在植物抵御干旱脅迫過(guò)程中非常重要。

表3 豆科牧草抗逆基因工程研究Table 3 Studies on resistance gene engineering of legume forages

4CL 是木質(zhì)素生物合成途徑中參與苯丙烷代謝的關(guān)鍵酶[75]。RVE7 作為一種MYB 轉(zhuǎn)錄因子，正向調(diào)控生物鐘的下游過(guò)程，如下胚軸生長(zhǎng)和開(kāi)花[76]。Badhan 等[77]利用CRISPR/Cas9 技術(shù)敲除鷹嘴豆原生質(zhì)體中的4CL和RVE7基因，首次證明CRISPR/Cas9可在鷹嘴豆原生質(zhì)體中實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)基因組編輯。Singer 等[78]利用CRISPR/Cas9 誘導(dǎo)苜蓿鱗片啟動(dòng)子結(jié)合蛋白樣8 (MsSPL8)基因突變，在4 個(gè)MsSPL8等位基因中得到多達(dá)3 個(gè)的目標(biāo)位點(diǎn)產(chǎn)生插入、缺失的基因突變，表現(xiàn)出葉片變小和開(kāi)花提早等表型變化。等位基因突變劑量可以引起苜蓿的表型梯度，具有最多MsSPL8等位基因突變的植物在節(jié)間長(zhǎng)度、株高、地上部和根系生物量以及根系長(zhǎng)度方面具有顯著減少。這些研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示豆科牧草耐旱機(jī)理提供理論依據(jù)。

2.2.2 耐 鹽堿基因工程

土壤鹽濃度過(guò)高情況下，植物被動(dòng)地吸收大量的Na+，從而使植物體內(nèi)Na+/K+穩(wěn)態(tài)失衡，進(jìn)而對(duì)植物產(chǎn)生滲透脅迫和離子毒害[79]。高鹽通常會(huì)觸發(fā)細(xì)胞 內(nèi)Ca2+、活 性 氧(reactive oxygen species, ROS)、ABA 和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)信號(hào)途徑[80-82]。被激活的信號(hào)分子調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子影響植物轉(zhuǎn)錄組[83]，使植物迅速積累甜菜堿、多元醇、糖和氨基酸等小分子的水溶性化合物，以降低ROS 毒害、維護(hù)細(xì)胞膜完整[84]。Na+區(qū)域化是由液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白實(shí)現(xiàn)，由液泡膜H+-ATP 酶(V-H+-ATP 酶)和H+-焦磷酸酶(H+-PPase)為其提供質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力。鹽生植物堿蓬(Suaeda corniculata)編碼V-H+-ATP 酶亞基的基因在紫花苜蓿中異源表達(dá)可以提高轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性[85]。霸王ZxNHX1-PcCLCg轉(zhuǎn)入紫花苜蓿后，轉(zhuǎn)基因植株積累更多的Na+、Cl-，增強(qiáng)鹽脅迫下自身的滲透調(diào)節(jié)能力且耐土壤貧瘠、長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)良、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)高[86]。過(guò)量表達(dá)堿茅(Puccinellia distans)NHX-CAX的轉(zhuǎn)基因苜蓿也呈現(xiàn)出類(lèi)似的結(jié)果[87]。另外，過(guò)量表達(dá)甜菜液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因BvNHX的轉(zhuǎn)基因紅豆草，能夠?qū)⒓?xì)胞質(zhì)中過(guò)多的Na+轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡中，明顯增強(qiáng)紅豆草的耐鹽性[88]。此外，細(xì)胞質(zhì)中過(guò)量的Na+外排也可提高植株耐鹽性。麻冬梅和秦楚[89]通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)將擬南芥AtSOS1轉(zhuǎn)入紫花苜蓿，轉(zhuǎn)基因植株通過(guò)SOS1 途徑促進(jìn)植物細(xì)胞內(nèi)的Na+外排，從而減輕鹽堿脅迫對(duì)植株的傷害。保護(hù)蛋白可使植物細(xì)胞免受應(yīng)激損傷，從而提高植株耐鹽性。在紫花苜蓿轉(zhuǎn)入水稻金屬硫蛋白基因rgMT后，當(dāng)rgMT穩(wěn)定表達(dá)時(shí)，顯著提高苜蓿的耐鹽性[90]。雖然脫水蛋白(dehydrin protein, DHN)保護(hù)細(xì)胞免受應(yīng)激誘導(dǎo)脫水損傷的確切作用機(jī)制仍不清楚，但表達(dá)無(wú)芒隱子草(Cleistogenes songorica)CsDHN和CsLEA的轉(zhuǎn)基因苜蓿對(duì)鹽脅迫的耐受性有所提高[91]。將甜菜絲氨酸蛋白酶抑制劑基因BvSTI導(dǎo)入百脈根(Lotus corniculatus)根后，轉(zhuǎn)基因植株對(duì)鹽脅迫的耐受性顯著強(qiáng)于野生型和其他BvSTI表達(dá)較少的株系(表3)[92]。植物逆境生理與基因工程課題組前期研究表明，SnRK2受鹽脅迫的誘導(dǎo)，為解析該基因在植物非生物脅迫響應(yīng)中的作用提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)豐富豆科牧草抗逆遺傳改良基因資源[93]。以上結(jié)果表明，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、保護(hù)蛋白及蛋白激酶對(duì)提高豆科牧草耐鹽性起著關(guān)鍵作用。

過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子是培育抗逆作物的手段之一。編碼AP2/EREBP、bHLH、bZIP、HD-ZIP、NAC、ZF、MYB和WRKY家族等蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄因子已在多種植物中表達(dá)，它們?cè)谥参镯憫?yīng)非生物脅迫中發(fā)揮著重要作用[94-95]。苜蓿屬植物也是如此，轉(zhuǎn)基因植物的許多不同生理反應(yīng)都發(fā)生了改變，包括滲透保護(hù)劑含量的增加和脅迫條件下ROS 的減少，根系生長(zhǎng)的改善，以及角質(zhì)層的增厚或者角質(zhì)層蠟質(zhì)含量的提高。ABI3/VP1 (RAV)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)和抗逆性方面發(fā)揮著重要作用，MtRAV3的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因截形苜蓿對(duì)鹽脅迫的耐受性，并誘導(dǎo)逆境相關(guān)基因的表達(dá)[96]。MsMYB2L在苜蓿幼苗中的轉(zhuǎn)錄受到鹽和ABA 的誘導(dǎo)，該基因的過(guò)量表達(dá)使轉(zhuǎn)基因植株的脯氨酸和可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成增強(qiáng)，脂質(zhì)過(guò)氧化程度降低(表3)。因此，MsMYB2L可作為一個(gè)用于調(diào)控紫花苜蓿耐鹽性的潛在候選基因[97]。Q 型C2H2 鋅指蛋白(C2H2-ZFP)轉(zhuǎn)錄因子與許多植物生長(zhǎng)發(fā)育和環(huán)境脅迫反應(yīng)有關(guān)。以上結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄因子的異源表達(dá)或過(guò)量表達(dá)可提高轉(zhuǎn)基因豆科牧草的耐鹽能力。

除了轉(zhuǎn)錄因子之外，非生物脅迫還可介導(dǎo)調(diào)節(jié)下游基因表達(dá)，如基因甲基化狀態(tài)的改變或核小體組蛋白的修飾[98]。轉(zhuǎn)錄后和翻譯后的調(diào)節(jié)機(jī)制也通過(guò)選擇性剪接、應(yīng)激反應(yīng)性miRNA 以及蛋白質(zhì)磷酸化、蘇甲?；头核鼗痆99-101]等在非生物應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究表明，miR169、miR408 和miR319 的過(guò)量表達(dá)顯著增強(qiáng)各種植物對(duì)非生物脅迫耐受性[102-104]。最近的研究表明，miR156 的過(guò)量表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿對(duì)鹽堿脅迫的耐受性[105-106]。LcERF056參與調(diào)控多種代謝途徑的下游基因，LcERF056的過(guò)量表達(dá)賦予轉(zhuǎn)基因擬南芥和百脈根植株更強(qiáng)的耐鹽性[107]。

滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)不僅維持細(xì)胞的滲透壓，而且還保護(hù)細(xì)胞內(nèi)酶活性并維持細(xì)胞膜穩(wěn)定性以降低鹽堿脅迫對(duì)植物的傷害。半胱氨酸合成酶(cysteine synthase, CSase)家族參與植物生長(zhǎng)發(fā)育和非生物脅迫抗性，過(guò)量表達(dá)苜蓿MsCSase的轉(zhuǎn)基因株系在堿脅迫下其脯氨酸、可溶性糖和半胱氨酸含量增加，谷胱甘肽、H2O2、O2·-含量減少，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和過(guò)氧化物酶(peroxidase,POD)活性降低，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因(CSase下游基因)相對(duì)表達(dá)量顯著高于野生型[108]?？梢?jiàn)CSase 通過(guò)調(diào)節(jié)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和提高抗氧化能力以增強(qiáng)植株的耐堿性。這些結(jié)果為苜蓿CSase家族的研究和豐富豆科牧草耐堿性基因資源提供了參考。

2.2.3 耐 寒基因工程

冷脅迫限制植物生長(zhǎng)發(fā)育和作物的產(chǎn)量，并影響光合作用、代謝、調(diào)節(jié)和修復(fù)等一系列關(guān)鍵途徑[109]。低溫會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜硬化使蛋白質(zhì)復(fù)合物不穩(wěn)定并損害光合成；冷凍(≤ 0 ℃)脅迫促進(jìn)植物組織外質(zhì)體中冰晶的形成，積累的冰晶可物理破壞細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞嚴(yán)重脫水，從而對(duì)植物造成更嚴(yán)重的損害[110]。寒冷脅迫同樣會(huì)影響牧草的產(chǎn)量和品質(zhì)，研究表明低溫除了影響牧草的形態(tài)，還會(huì)導(dǎo)致其減產(chǎn)，因此植物會(huì)改變脂膜成分或積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)以應(yīng)對(duì)寒冷脅迫[111]。擬南芥AtCBF1導(dǎo)入紫花苜蓿后，轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)寒冷處理后葉片長(zhǎng)度縮短，但生長(zhǎng)速度、產(chǎn)量以及蛋白質(zhì)含量較野生型均有所提高(表3)[112]。由此表明，冷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子也可提高紫花苜蓿的抗寒能力。

2.2.4 抗重金屬離子基因工程

土壤中的重金屬對(duì)作物產(chǎn)量和食品安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅[113]。選育吸收富集金屬離子的牧草品種用作土壤環(huán)境改良，而對(duì)金屬離子吸收較差的品種可用作牧草栽培。García 等[114]將烏頭葉豇豆屬(Vigna aconitifolia)的Δ1-吡咯啉-5-羧酸合酶基因(VaP5CS)轉(zhuǎn)入截形苜蓿中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株的脯氨酸含量比野生型不僅提高對(duì)鎘(cadmium, Cd)的耐性，而且還通過(guò)固根提高了Cd 的植物穩(wěn)定性。由促代謝、植物螯合素生物合成相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)可知，抗氧化機(jī)制和NADPH 循環(huán)參與應(yīng)對(duì)Cd 脅迫。表明轉(zhuǎn)基因株系中的Cd 反應(yīng)機(jī)制可能被組成性激活。鎘耐受性的增加并不完全是由于脯氨酸的積累，還和脯氨酸代謝、植物螯合素(phytochelatins, PCs)生物合成、抗氧化機(jī)制和NADPH 循環(huán)相關(guān)的幾個(gè)重要基因的上調(diào)有關(guān)。過(guò)量表達(dá)紫花苜蓿MsWRKY19顯著提高轉(zhuǎn)基因植株對(duì)Cd 的耐受性，且MYB過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株耐鋁脅迫能力也顯著增強(qiáng)[115-116]。

外源添加促防御因子也可有效達(dá)到減少重金屬離子吸收。碳點(diǎn)(C-dots)具有非凡的性質(zhì)，是近年來(lái)新興的研究領(lǐng)域。Chandrakar 等[117]通過(guò)分析鷹嘴豆的生理、生化和分子特性，評(píng)估C-dots 在降低砷(arsenic, As)毒性的有效性。結(jié)果表明，As 在很大程度上降低了鷹嘴豆的發(fā)芽率、生長(zhǎng)、生物量和細(xì)胞膜穩(wěn)定性。As 被生長(zhǎng)中的種子吸收，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。ROS、應(yīng)激標(biāo)記物(丙二醛)、防御酶(谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和吡咯啉-5-羧酸合成酶)活性和非酶抗氧化物(脯氨酸和谷胱甘肽)含量在As 脅迫下增加。As 處理導(dǎo)致鷹嘴豆中NADPH 氧化酶和防御相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)。外源施用C-dots 改善了鷹嘴豆的萌發(fā)和生長(zhǎng)，增強(qiáng)了防御相關(guān)基因的表達(dá)，提高了脯氨酸和谷胱甘肽的含量，從而導(dǎo)致ROS 和丙二醛水平顯著降低。這些結(jié)果表明，C-dots 可能通過(guò)減少As 的吸收，誘導(dǎo)酶和非酶抗氧化系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá)，從而降低As 對(duì)生物量的毒性影響。

3 展望

我國(guó)豆科牧草生產(chǎn)遭受干旱、鹽漬化、低溫、重金屬等逆境脅迫，利用基因工程技術(shù)改良其抗逆性是有效手段之一。盡管目前豆科牧草抗逆基因工程研究已經(jīng)取得了一定進(jìn)展，但還存在諸多問(wèn)題。如，基因轉(zhuǎn)化效率低、重復(fù)性差、隨機(jī)性大，如何構(gòu)建豆科牧草高頻再生的遺傳轉(zhuǎn)化體系仍然是亟待解決的難題；優(yōu)異多基因聚合改良豆科牧草品質(zhì)和抗性研究相對(duì)薄弱；轉(zhuǎn)基因豆科牧草大多停留在試驗(yàn)階段，進(jìn)入生產(chǎn)應(yīng)用前的安全性評(píng)價(jià)還需加強(qiáng)和重視。鑒于此，今后我國(guó)豆科牧草抗逆基因工程研究應(yīng)該集中在以下幾個(gè)方面：1) 采用基因組測(cè)序新技術(shù)融合生物信息學(xué)方法，對(duì)我國(guó)主要豆科牧草品種進(jìn)行基因組測(cè)序，為培育自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)牧草新品種奠定基礎(chǔ)。2) 充分利用基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組和代謝組等組學(xué)手段，追蹤豆科牧草相關(guān)物種間基因的關(guān)聯(lián)性，挖掘候選優(yōu)異抗逆基因，豐富豆科牧草基因資源。3) 在高頻再生的遺傳轉(zhuǎn)化體系基礎(chǔ)之上，建立高效基因編輯體系，加快豆科牧草基因功能的研究。4) 加強(qiáng)與國(guó)際轉(zhuǎn)基因作物管理機(jī)構(gòu)的合作，建立和完善我國(guó)轉(zhuǎn)基因牧草的安全性評(píng)價(jià)和監(jiān)管體系，促進(jìn)轉(zhuǎn)基因牧草研發(fā)和商業(yè)化發(fā)展。這些研究將有助于我國(guó)飼草產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量、可持續(xù)發(fā)展，促進(jìn)農(nóng)牧民增收、助力鄉(xiāng)村振興。