劉小霞 王杰 侯東霞 郭志遠(yuǎn) 王鑫 王曉華 賈躍旗

染色體非整倍體是指染色體數(shù)目非整體性的增加或減少,而呈個(gè)別染色體數(shù)目的變化[1]。常見的胎兒染色體非整倍體有21-三體、18-三體、13-三體和性染色體非整倍體,其余的可定義為罕見常染色體非整倍體(rare autosomal aneuploidies, RAAs)[2-3]。染色體非整倍體對(duì)胎兒發(fā)育有不良影響,包括流產(chǎn)、胎兒結(jié)構(gòu)異常及神經(jīng)發(fā)育延遲[4],不同的染色體數(shù)目異變對(duì)胎兒發(fā)育的影響可能不同。目前對(duì)常見的染色體非整倍體如21-三體、18-三體和13-三體的研究比較多[5],但對(duì)RAAs的研究比較少。本研究回顧近三年來(lái)在內(nèi)蒙古自治區(qū)婦幼保健院就診且確診為RAAs的病例,分析了RAAs對(duì)胎兒發(fā)育的影響,為RAAs孕婦的遺傳咨詢提供理論依據(jù)并提升孕婦對(duì)RAAs的認(rèn)知。

對(duì)象與方法

1.研究對(duì)象:收集2018年8月至2021年9月于內(nèi)蒙古自治區(qū)婦幼保健院進(jìn)行染色體微陣列(chromosomal microarray analysis,CMA)、熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)或羊水染色體核型分析確診為RAAs的患者共193例,其中經(jīng)CMA發(fā)現(xiàn)126例,樣本類型分別為絨毛和羊水;FISH發(fā)現(xiàn)65例,樣本類型為絨毛;染色體核型分析發(fā)現(xiàn)2例,樣本類型為羊水。

分別按以下項(xiàng)目分組研究胎兒存活孕周、孕婦妊娠結(jié)局與RAAs的關(guān)系。孕期:按末次月經(jīng)或B超計(jì)算得到孕周,其孕早期為孕周<13周,孕中期為懷孕13～28周,晚期為孕周>28周[6];妊娠結(jié)局分為流產(chǎn)和非流產(chǎn)。流產(chǎn)根據(jù)自然流產(chǎn)發(fā)展的不同階段分為先兆流產(chǎn)、難免流產(chǎn)、不全流產(chǎn)和完全流產(chǎn);稽留流產(chǎn)、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)和流產(chǎn)合并感染是三種特殊類型的自然流產(chǎn),診斷標(biāo)準(zhǔn)參照謝辛主編的第九版《婦產(chǎn)科學(xué)》[7];非流產(chǎn)組包括引產(chǎn)和成功分娩。

RAAs納入標(biāo)準(zhǔn):經(jīng)CMA/FISH/羊水染色體核型分析確診為RAAs的患者;排除標(biāo)準(zhǔn):本人近期接受過移植手術(shù)、異體輸血、異體細(xì)胞治療或檢測(cè)失敗者;臨床信息不全或拒絕隨訪的患者。

2. 方法:

(1)標(biāo)本采集。羊水標(biāo)本:一次性抽取羊水量25～35 mL用于CMA和染色體核型分析。采集時(shí)為防止母源污染,棄去最初的1～2 mL并更換注射器。標(biāo)本要求新鮮、清亮無(wú)渾濁、無(wú)胎糞、無(wú)凝塊且無(wú)母血污染(血性羊水),可疑母源污染的標(biāo)本需進(jìn)行羊水細(xì)胞培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁后,除去懸浮紅細(xì)胞,使用細(xì)胞刮或胰酶消化后取貼壁羊水細(xì)胞,經(jīng)生理鹽水沖洗后,再用于全基因組DNA提取;絨毛標(biāo)本:采集20 mg左右用于CMA和FISH,經(jīng)生理鹽水充分洗滌后,于顯微鏡下分離蛻膜和血凝塊。

(2)染色體微陣列技術(shù)。使用 Promega公司(美國(guó))DNA 提取試劑盒對(duì)絨毛組織/胎盤組織/羊水細(xì)胞進(jìn)行全基因組DNA提取。再應(yīng)用Thermo fisher公司(美國(guó))CytoScanTM 750K芯片進(jìn)行檢測(cè),標(biāo)本依次進(jìn)行酶切、連接、PCR、純化、片段化、標(biāo)記、雜交洗滌、掃描和分析等,檢測(cè)染色體數(shù)目異常。CMA檢測(cè)提示母體細(xì)胞污染超過30%的樣本被排除在外[8]。

(3)熒光原位雜交技術(shù)。取經(jīng)染色體制備過程處理的羊水細(xì)胞/絨毛組織滴片,標(biāo)本依次進(jìn)行烤片、洗滌、消化、脫水、加探針,76攝氏度變性7 min后迅速置于37攝氏度水浴箱中,取出后雜交,DAPI染色,封片,在熒光顯微鏡下閱片,隨機(jī)計(jì)數(shù)50個(gè)強(qiáng)信號(hào)且無(wú)重疊的雜交細(xì)胞。結(jié)果判讀:鏡下閱片若大于 90% 的核型顯示非整倍體信號(hào)則判斷為異常。若10%～60%的核型顯示非整倍體信號(hào)則判斷為嵌合體。如果無(wú)法判斷則擴(kuò)大計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。

(4)羊水染色體核型分析。使用羊膜腔穿刺術(shù)抽取羊水20 mL,離心后接種于常規(guī)培養(yǎng)基,收獲細(xì)胞,制片,G顯染。鏡下計(jì)數(shù)25個(gè)分裂相,至少分析5個(gè)分裂相,如異常則增加分裂相分析數(shù)目。根據(jù)國(guó)際人類染色體命名的國(guó)際體制(ISCN2016)標(biāo)準(zhǔn)確定染色體核型[9]。

(5)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。使用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,計(jì)數(shù)資料用例數(shù)(n)或百分比(%)表示,組間比較使用Fisher確切概率法,以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.完全型RAAs與嵌合型RAAs妊娠結(jié)局比較分析:193例RAAs胎兒中,190例結(jié)局為流產(chǎn),其中一般流產(chǎn)2例,稽留流產(chǎn)188例;3例未發(fā)生流產(chǎn),其中2例引產(chǎn),1例成功分娩。統(tǒng)計(jì)不同RAAs分娩情況,分析孕婦妊娠結(jié)局,結(jié)果顯示,RAAs一般流產(chǎn)發(fā)生率低于稽留流產(chǎn),分別為1.0%和97.4%。其中完全型RAAs與嵌合型RAAs一般流產(chǎn)發(fā)生率分別為0.6%和3.3%,稽留流產(chǎn)發(fā)生率分別為99.4%和86.7%。兩組一般流產(chǎn)發(fā)生率無(wú)顯著性差異(P>0.05),稽留流產(chǎn)發(fā)生率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,完全型RAAs稽留流產(chǎn)發(fā)生率高于嵌合型RAAs。僅有3例嵌合型RAAs未發(fā)生流產(chǎn),染色體嵌合比例分別為2號(hào)三體嵌合44%、16號(hào)三體嵌合38%和20號(hào)三體嵌合25%。見表1。

表1 RAAs胚胎/胎兒流產(chǎn)情況 [例(%)]

2.RAAs分布情況:共收集193例RAAs胎兒,其中完全型RAAs占比84.5%(163/193),嵌合型RAAs占比15.5%(30/193),均為三體或三體嵌合體,未發(fā)現(xiàn)單體。本次收集的病例中,RAAs涉及16條染色體,包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、15、16、20、22號(hào)染色體。其中,最常見的是16號(hào)染色體,異常檢出率為43.0%(83/193);其次是22號(hào)和15號(hào)染色體,異常檢出率為24.4%(47/193)和9.3%(18/193)。雙重三體檢出率為3.6%(8/193),分別是5號(hào)合并21號(hào)(1/8)、18號(hào)合并20號(hào)(1/8)、16號(hào)合并22號(hào)(2/8)、16號(hào)合并21號(hào)(1/8)、9號(hào)合并22號(hào)(1/8)、16號(hào)合并X(1/8)和20號(hào)合并Y(1/8)。未發(fā)現(xiàn)1、17、19號(hào)RAAs,詳見圖1。

圖1 不同RAAs異常發(fā)生頻次

3.RAAs胚胎/胎兒的流產(chǎn)孕周分析:通過統(tǒng)計(jì)不同RAAs流產(chǎn)時(shí)的孕周情況,分析胚胎/胎兒發(fā)育的孕周跨度。結(jié)果顯示,所涉及16條RAAs均可在孕早期發(fā)生流產(chǎn),16號(hào)染色體發(fā)生流產(chǎn)的孕周最早,為第6周;其次是3號(hào)與15號(hào)染色體,最早流產(chǎn)孕周為7周,其余多數(shù)染色體(13/16)發(fā)生流產(chǎn)的最早孕周為8～9周,在完全型RAAs中,4、14、15和16號(hào)染色體可發(fā)育到中孕期的13～14周,9號(hào)和22號(hào)染色體可發(fā)育到更晚,最大為18周。在嵌合型RAAs中,多數(shù)RAAs(7/10)胎兒不能發(fā)育到孕中期,在孕早期即流產(chǎn),可發(fā)育到的最大孕周為10周,部分(3/10)嵌合型RAAs可發(fā)育到較大孕周,16號(hào)和20號(hào)染色體可發(fā)育到19周,2號(hào)染色體發(fā)育到37周+。詳見表2。

表2 完全型RAAs與嵌合型RAAs胚胎/胎兒發(fā)育孕周分布情況

討論

染色體異常是遺傳病常見的病因之一,其中數(shù)目異常發(fā)生率最高,約占染色體異常的90%[10-11],多數(shù)數(shù)目異?？赡軙?huì)導(dǎo)致胎死宮內(nèi)、胎兒生長(zhǎng)受限、流產(chǎn)、影響胎兒發(fā)育、智力、行為和生長(zhǎng)發(fā)育落后等疾病。研究顯示,流產(chǎn)中染色體異常占50～70%[12-14],其中RAAs可占60%以上[14]。流產(chǎn)在自然妊娠中的發(fā)生率約為10%～15%[16]。在本研究中,RAAs胚胎/胎兒一般流產(chǎn)和稽留流產(chǎn)發(fā)生率分別為1.0%和97.4%。完全型RAAs與嵌合型RAAs一般流產(chǎn)發(fā)生率無(wú)顯著性差異,兩者稽留流產(chǎn)發(fā)生率有顯著性差異,完全型RAAs稽留流產(chǎn)發(fā)生率高于嵌合型RAAs?；袅鳟a(chǎn)又稱胚胎停育,指胚胎或胎兒死亡后滯留宮腔內(nèi)未及時(shí)自然排出[17],可能會(huì)引起彌散性血管內(nèi)凝血(disseminated intravascular coagulation,DIC),多次發(fā)生可發(fā)展為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion,RSA),嚴(yán)重影響孕婦的身心健康[18]。因此,對(duì)胎兒為RAAs的婦女,應(yīng)考慮稽留流產(chǎn)的可能,尤其對(duì)胎兒為完全型RAAs的婦女,應(yīng)給予高度關(guān)注。此外,本研究未發(fā)現(xiàn)RAAs胚胎或胎兒存在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)和流產(chǎn)合并感染結(jié)局。Carlo等[19-20]報(bào)道復(fù)發(fā)性流產(chǎn)婦女比正常懷孕婦女更容易發(fā)生染色體異常,且兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;鐘漢威等[21]報(bào)道流產(chǎn)合并感染主要與生殖道感染、不潔性生活和人工流產(chǎn)密切相關(guān),推測(cè)本研究病例中未發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)結(jié)局的原因可能是樣本量少,而流產(chǎn)合并感染的可能原因是其發(fā)病機(jī)制與染色體異常關(guān)系不大,這兩組特殊類型流產(chǎn)與RAAs之間的關(guān)系還需要更大樣本量的研究來(lái)證明。

所有型別的染色體核型異常都可能引起流產(chǎn)[18,22-23]。本文統(tǒng)計(jì)的RAAs涉及的染色體包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、15、16、20、22號(hào)染色體等16條,未見1、17、19號(hào)染色體非整倍體,這種差異可能是由于樣本量較少所致。其中發(fā)生頻次較高的依次為16號(hào)(43.0%)、22號(hào)(24.4%)和15號(hào)(9.3%)染色體異常,與先前研究報(bào)道基本一致[15, 18]。這種差異可能與染色體中的基因數(shù)量有關(guān)[24],高發(fā)的RAAs如16、22、15號(hào)染色體上含有800～1 600個(gè)基因,要少于其他RAAs(約含有1 600～5 000個(gè)基因),可能存在一個(gè)閾值效應(yīng)決定敏感基因的功能及表達(dá)。

不同RAAs對(duì)胎兒發(fā)育的影響可能不同,有國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者表明1～22號(hào)常染色體非整倍體均會(huì)導(dǎo)致孕婦在孕早期發(fā)生流產(chǎn)[14, 25]。本文對(duì)涉及的16條常染色體非整倍體胚胎/胎兒發(fā)育的孕周做了分析,各RAAs普遍在8～12周內(nèi)發(fā)生流產(chǎn),與以往研究一致。多數(shù)RAAs能發(fā)育到的最大孕周不超過早孕期,少數(shù)僅可發(fā)育到中孕期。部分嵌合體可發(fā)育到較大孕周。其中,有1例16號(hào)三體嵌合38%和1例20號(hào)三體嵌合25%的胎兒發(fā)育到19周時(shí),兩位孕婦要求終止妊娠。另有1例羊水中2號(hào)三體嵌合44%的胎兒,排除了單親二體(UPD)且無(wú)超聲異常,孕婦經(jīng)產(chǎn)前門診咨詢后,繼續(xù)妊娠至足月分娩,隨訪新生兒3年余,未見發(fā)育異常。三體自救是一種可能的解釋,比如內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的一些三體細(xì)胞隨機(jī)丟失一條染色體變成二體細(xì)胞,機(jī)體對(duì)二體細(xì)胞進(jìn)行有效選擇,三體細(xì)胞存在于胎盤中,導(dǎo)致胎盤,羊水和胎兒之間存在細(xì)胞遺傳學(xué)差異[26]。因此,本研究推測(cè)胎兒細(xì)胞核型有可能為正常二倍體,而羊水細(xì)胞為2號(hào)三體嵌合體,胎盤為2號(hào)三體或三體嵌合體。此外,有研究表明低比例嵌合與良性的胎兒發(fā)育有關(guān),Chen等[27]和Tang等[28]分別報(bào)道1例羊水中2號(hào)三體嵌合3%和4%的病例,臍血核型和孕期超聲均正常,生后隨訪發(fā)育正常,但是目前尚未有指南或共識(shí)指出嵌合比例低于多少,胎兒妊娠結(jié)局良好。這一結(jié)果提示,對(duì)于產(chǎn)前診斷為嵌合型RAAs的孕婦,需進(jìn)行詳細(xì)的產(chǎn)前咨詢,密切監(jiān)測(cè)孕婦超聲和孕期情況,必要時(shí)對(duì)夫妻雙方行染色體檢測(cè)。妊娠終止后建議對(duì)胚胎/胎兒/新生兒及胎盤行細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè),進(jìn)一步明確RAAs嵌合部位與比例,對(duì)新生兒提供正確的臨床指導(dǎo)或干預(yù),并為流產(chǎn)/引產(chǎn)患者健康孕育下一胎提供理論依據(jù)。

綜上,本文從罕見常染色體非整倍體的角度分析了其對(duì)胚胎/胎兒發(fā)育的影響, 絕大多數(shù)RAAs與稽留流產(chǎn)相關(guān),且多數(shù)流產(chǎn)發(fā)生于早孕期,少數(shù)胎兒能發(fā)育到中孕期。嵌合型RAAs可發(fā)育到的孕周與胚胎的嵌合部位和比例有關(guān),嵌合比例較低或胚胎染色體在早期發(fā)生自救,胎兒可以正常發(fā)育至足月出生。本文提示臨床實(shí)踐中應(yīng)重視RAAs,RAAs是流產(chǎn)的重要原因,有必要提高臨床醫(yī)生及廣大孕婦群體對(duì)此的認(rèn)知。