張彬彬 綜述 王雁 審校

南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院 天津市眼科醫(yī)院 天津市眼科學(xué)與視覺科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津市眼科研究所,天津 300020

角膜與淚膜一起形成眼部外屏障并保護(hù)眼部不受外界環(huán)境和病原體侵?jǐn)_,同時(shí)角膜也是眼部重要的屈光介質(zhì)。角膜化學(xué)/熱燒傷、單純皰疹性角膜炎、大泡性角膜病變、角膜潰瘍和Fuchs角膜內(nèi)皮營(yíng)養(yǎng)不良等角膜創(chuàng)傷和疾病都會(huì)影響角膜透明度,甚至造成視力喪失,是主要的致盲眼病。每年新報(bào)道的角膜盲病例超過150萬(wàn)例[1],但由于供體組織短缺和移植手術(shù)費(fèi)用高昂,可通過角膜移植治療的不到5%[2]。穿透角膜移植術(shù)、前板層角膜移植術(shù)、角膜內(nèi)皮移植術(shù)等手術(shù)是治療角膜盲的主要方式。因角膜移植供體缺乏,研究者試圖通過組織工程學(xué)的方法構(gòu)建人工角膜,如人造角膜假體、動(dòng)物脫細(xì)胞的角膜組織(例如豬角膜)和人羊膜等。用于制造人工角膜的生物材料必須具有與天然角膜相似的物理、生化、生理、生物學(xué)特性。水凝膠由于其獨(dú)特的生物學(xué)特性現(xiàn)已成功應(yīng)用于基于水凝膠的角膜接觸鏡、抗青光眼藥物的輸送、緩釋型抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子藥物的輸送、玻璃體填充替代物等[3-7]。本文就水凝膠結(jié)合3D打印在人工角膜制備方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 水凝膠概念

水凝膠為高度水合的聚合物材料(按質(zhì)量計(jì)>30%的水),其通過聚合物鏈之間的物理和化學(xué)交聯(lián)來(lái)保持結(jié)構(gòu)完整性,通常分為化學(xué)和物理凝膠?；瘜W(xué)凝膠是指在支鏈之間通過邁克爾加成反應(yīng)[9]、酶促反應(yīng)等形成始終緊密相連的凝膠網(wǎng)絡(luò),是永久和不可逆的。物理凝膠的形成是可逆的,是離子間相互作用、高分子鏈纏繞、氫鍵/或疏水作用力相互作用的結(jié)果[10-11]。水凝膠的形成包括2個(gè)關(guān)鍵步驟:(1)將細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)材料溶于蛋白質(zhì)單體組分中;(2)由溫度或酸堿控制的中和作用,以誘導(dǎo)單體分子內(nèi)鍵的自發(fā)重組,形成均勻的凝膠[12]。水凝膠具有理化性質(zhì)可控、生物相容性好等特點(diǎn)。

2 水凝膠的來(lái)源

水凝膠來(lái)源廣泛,可以由天然的材料,如瓊脂糖和膠原蛋白組成,也可以由合成聚合物,如聚乙二醇、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,PVA)組成。

2.1 透明質(zhì)酸

透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,HA)也稱為透明質(zhì)酸鹽,是ECM的主要成分。這種非硫酸化的糖胺聚糖在細(xì)胞增生、生長(zhǎng)、存活和分化中起關(guān)鍵作用[13]。其物理性質(zhì),如黏度、彈性、硬度、形狀和結(jié)構(gòu)可以通過化學(xué)修飾[14]。HA廣泛分布在皮膚、軟骨和腦等組織中,并且在生長(zhǎng)發(fā)育、傷口愈合和疾病中起著重要作用[15]。Fiorica等[16]首次將HA水凝膠與聚天酰胺衍生物[α,β-poly(N-2-hydroxyethyl) (2-aminoethylcarbamate)-d,l-aspartamide,PHEA-EDA]化學(xué)交聯(lián),作為羊膜的替代品,用于遞送人角膜緣上皮細(xì)胞,其結(jié)果證明了HA/PHEA-EDA水凝膠作為角膜緣干細(xì)胞移植載體支架在角膜損傷治療中的可行性。HA以其生物降解性、生物相容性、無(wú)毒性和非免疫原性等在骨關(guān)節(jié)炎手術(shù)、眼科手術(shù)、整形外科手術(shù)、組織工程和藥物輸送中得到了廣泛應(yīng)用[17]。

2.2 明膠

明膠具有較好的溶解性、低免疫原性的特點(diǎn),包含許多促進(jìn)細(xì)胞附著的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列以及適合細(xì)胞重構(gòu)的基質(zhì)金屬蛋白酶靶序列[18-19];但明膠溶液本身對(duì)溫度敏感,在低溫條件下易自發(fā)形成凝膠,為了增加明膠的穩(wěn)定性和提高抗張能力,需要對(duì)明膠進(jìn)行改良,如添加甲基丙烯酸酐。2000年,Van Den Bulcke等[20]首次報(bào)道了應(yīng)用甲基丙烯酸酐與明膠反應(yīng),修飾明膠的氨基側(cè)鏈,生成甲基丙烯?；髂z(gelatin methacrylate,GELMA),并將GELMA溶于水中,以Irgacure2959為光引發(fā)劑,在紫外線光的照射下發(fā)生交聯(lián)反應(yīng),制備出GELMA水凝膠。GELMA水凝膠因其獨(dú)特的光交聯(lián)特性、可控的力學(xué)性能以及良好的生物相容性,已成為具有廣泛應(yīng)用前景的生物聚合物材料。

2.3 海藻酸鈉

海藻酸鈉是從褐藻中提取的多糖,常用于細(xì)胞包封和組織移植,海藻酸鹽被認(rèn)為是一種生物相容性較好的材料[21],并且可以通過Ba2+、Zn2+或Ca2+進(jìn)行離子交聯(lián),但如何保持交聯(lián)前后形態(tài)的完整性和增強(qiáng)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性是需要考慮的問題,Seok等[22]通過將海藻酸鈉和PVA混合再進(jìn)行凍干處理彌補(bǔ)了這一不足。海藻酸鈉現(xiàn)已應(yīng)用于食品、紡織、印刷和制藥等多種行業(yè)[23]。

2.4 脫細(xì)胞生物水凝膠

哺乳動(dòng)物組織由300多種ECM蛋白和多種ECM修飾酶組成,ECM結(jié)合生長(zhǎng)因子和其他ECM相關(guān)蛋白,介導(dǎo)細(xì)胞之間的相互作用和生化信號(hào)傳遞[24]。水凝膠所具有的三維結(jié)構(gòu)與ECM極為相似,ECM主要由水、纖維蛋白(如膠原蛋白、彈性蛋白、纖連蛋白和層粘連蛋白)和蛋白聚糖(如HA等)組成,是細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境的關(guān)鍵組成部分,并形成一個(gè)復(fù)雜的三維網(wǎng)絡(luò)[25]。

通過不同的脫細(xì)胞方法可以從組織中有效去除細(xì)胞核成分,同時(shí)保留有益于細(xì)胞生長(zhǎng)的成分,如生長(zhǎng)因子、活性蛋白等,因此脫細(xì)胞外基質(zhì)(decellularized extracellular matrix,DECM)以其獨(dú)特的組成和結(jié)構(gòu)為細(xì)胞提供了一個(gè)原生的細(xì)胞微環(huán)境,適宜細(xì)胞生長(zhǎng)[26]。DECM凝膠被認(rèn)為是一種具有潛力的生物材料,既可以單獨(dú)使用,也可以與組織工程或再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的其他生物制劑結(jié)合使用。

3 基于水凝膠用于角膜替代物的探索

人工角膜的合成必須要考慮角膜天然的生物特性,例如生物力學(xué)(黏彈性、應(yīng)力松弛、蠕變和各向異性)、透氧性、透明度以及與宿主細(xì)胞的相容性等。由于角膜結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性,水凝膠人工角膜的設(shè)計(jì)目前多為板層或局灶性修復(fù)植片,如Shirzaei Sani等[27]設(shè)計(jì)了一種基于明膠的黏附生物材料—GelCORE(角膜再生凝膠),該凝膠材料暴露于波長(zhǎng)450～550 nm的可見光后短時(shí)間進(jìn)行光交聯(lián)。光交聯(lián)完成后,可以形成牢固黏附于角膜組織的固體透明水凝膠,既可用于傷口的對(duì)合,又可用于角膜基質(zhì)缺損的快速和長(zhǎng)期修復(fù)。但單獨(dú)使用明膠材料的不足在于無(wú)法提供一個(gè)足夠的支撐力,以及無(wú)法保證在溫度變化的情況下保持明膠的性狀。為克服這一缺點(diǎn),Chen等[28]以膠原蛋白和PVA為原料制作互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)水凝膠,在一定程度上提高了凝膠的機(jī)械能力。為了評(píng)價(jià)水凝膠植入角膜基質(zhì)遠(yuǎn)期的效果,Zheng等[29]以聚乙二醇和聚丙烯酸制備30～40 μm水凝膠薄片植入兔角膜基質(zhì),觀察了最長(zhǎng)16個(gè)月的效果,結(jié)果表明水凝膠薄片保持了較好的透明性,但其他一些并發(fā)癥,如角膜上皮缺損、混濁等有待解決。

研究證明,與聚合物材料相比,以DECM為材料制備的人工角膜具有更高的透明性,更有利于細(xì)胞的增生和生長(zhǎng)[30]。Uyanklar等[31]將牛角膜脫細(xì)胞化制作支架材料,再以GELMA水凝膠重懸牛角膜基質(zhì)細(xì)胞,與脫細(xì)胞支架在不同紫外光強(qiáng)度下交聯(lián),評(píng)估混合角膜支架材料的透明度和再細(xì)胞化的問題,結(jié)果顯示所得混合角膜材料的透明度有了大幅度提高。Wang等[32]利用脫細(xì)胞的豬角膜基質(zhì)制作水凝膠,并以1-環(huán)已基-2-嗎啉乙基碳二亞胺對(duì)甲苯磺酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺為交聯(lián)劑用于兔角膜局灶性淺層缺損的修復(fù),術(shù)后角膜上皮在3 d內(nèi)完全再生,術(shù)后12周角膜上皮和基質(zhì)的厚度恢復(fù),未見明顯炎癥反應(yīng),進(jìn)一步證明了脫細(xì)胞水凝膠作為工程支架用于角膜修復(fù)的安全性和有效性。

4 基于凝膠生物墨水的3D打印人工角膜

3D打印也被稱為增材制造或快速制造,在過去的十余年中,一些關(guān)鍵專利的到期以及技術(shù)進(jìn)步和成本降低,例如消費(fèi)者級(jí)3D打印機(jī)的出現(xiàn)為3D打印的普及提供了技術(shù)支持,推動(dòng)了3D打印在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用[33],該技術(shù)已成功應(yīng)用于骨科、脊柱外科、頜面外科、神經(jīng)外科、心臟外科以及其他學(xué)科相關(guān)科室[34]。3D生物打印的目標(biāo)是制造支架來(lái)修復(fù)或替換受損的組織和器官[35]。目前,3D打印形式主要有噴墨、擠出和立體光刻等。

噴墨式打印分為熱擠壓和電壓式2種類型。在熱噴墨生物印刷中,將一種可包含細(xì)胞的預(yù)聚體溶液(稱為生物墨水)裝入墨盒中,墨盒被放置在由電腦控制的打印頭內(nèi),打印頭內(nèi)的熱量產(chǎn)生的氣泡會(huì)噴射出少量的墨水滴。液滴的大小可隨油墨黏度、脈沖頻率和應(yīng)用溫度梯度的變化而改變[36];壓電噴墨生物墨水的工作原理是在生物墨水的壓電晶體上施加不同的電位,從而產(chǎn)生從噴嘴噴出生物墨水滴所需的壓力。噴墨生物印刷的主要優(yōu)點(diǎn)是其制作速度快和設(shè)備的價(jià)格低廉[37]。

擠壓生物打印是噴墨生物印刷的先進(jìn)版本,使用氣動(dòng)(氣壓)或機(jī)械(螺桿或活塞)系統(tǒng)來(lái)分發(fā)生物墨水。使用氣動(dòng)(氣壓)通過連續(xù)的空氣壓力將墨水從噴嘴或針頭擠壓出來(lái)形成連續(xù)不斷的長(zhǎng)絲,因此可以盡可能保證產(chǎn)品的完整性[38]。

立體光刻基于液態(tài)的光敏樹脂,通過光源(例如紫外光或激光)的選擇性聚合以產(chǎn)生所需的圖案[39]。打印過程中光會(huì)根據(jù)計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)(computer aided design,CAD)模型選擇性地聚合樹脂,新的一層被連續(xù)打印在之前的層上,最后一個(gè)連續(xù)的3D打印對(duì)象被復(fù)制出來(lái)。立體光刻技術(shù)具有打印速度快、精度高等優(yōu)點(diǎn),但每種打印機(jī)各有優(yōu)勢(shì)和不足,需要權(quán)衡考慮。

生物油墨是3D生物打印的重要組成部分,對(duì)3D打印的成功與否至關(guān)重要。生物油墨作為印刷材料必須具有一定的特性,如生物相容性(植入后不會(huì)引起任何免疫或不良反應(yīng))、可打印性(作為打印材料)和堅(jiān)固性(抵抗環(huán)境的物理力量)。但生物墨水的選擇還需要考慮包括黏度、屈服應(yīng)力和動(dòng)態(tài)頻率下的響應(yīng)等一系列因素。水凝膠因其出色的溶脹特性和與組織的相容性而被認(rèn)為是最有希望的墨水材料[40]。

用于3D生物打印的生物墨水中通常添加人組織來(lái)源或動(dòng)物來(lái)源的細(xì)胞,一般選取具有干細(xì)胞活性的細(xì)胞,如角膜緣上皮干細(xì)胞、人類脂肪組織衍生干細(xì)胞或角膜來(lái)源基質(zhì)細(xì)胞等[41-43],以期能夠選擇最佳的打印材料,進(jìn)而提高打印角膜與受體的相容性。3D打印可以從不同的空間維度構(gòu)造立體圖案,角膜的真實(shí)數(shù)據(jù),如角膜曲率、大小,可以通過角膜地形圖等臨床檢查設(shè)備獲取,再通過CAD軟件建模,最后將圖片轉(zhuǎn)化為計(jì)算機(jī)可識(shí)別的G代碼文件,通過3D生物打印機(jī)進(jìn)行打印。為了盡可能地減小打印過程對(duì)細(xì)胞的損傷并提高細(xì)胞的遠(yuǎn)期存活率,通常選用噴墨或擠出式打印方式[44]。

Isaacson等[45]使用雙擠壓3D生物打印機(jī)打印角膜基質(zhì)結(jié)構(gòu),驗(yàn)證了以生物墨水為原料打印角膜基質(zhì)的可行性,還原角膜表面形貌很難由單一的打印機(jī)完成,Zhang等[46]的實(shí)驗(yàn)充分利用了擠出式打印機(jī)和數(shù)字光處理打印機(jī)的各自優(yōu)點(diǎn),以海藻酸鈉和GELMA分別打印了角膜的中央部分和周邊部分,更加準(zhǔn)確地模擬了天然角膜的曲率和厚度。Kilic等[43]以負(fù)載人角膜基質(zhì)細(xì)胞的GELMA水凝膠為材料進(jìn)行3D打印,打印后的角膜替代物具有出色的透明性、足夠的機(jī)械強(qiáng)度和較高的細(xì)胞生存能力,進(jìn)一步證明了GELMA水凝膠與3D打印制備人工角膜的可行性和優(yōu)越性。3D打印的優(yōu)勢(shì)在于批量生產(chǎn)精準(zhǔn)制造,Kutlehria等[47]使用預(yù)先制作的6～12個(gè)角膜模具,利用擠出式打印機(jī)在模具內(nèi)進(jìn)行連續(xù)打印,達(dá)到了高通量制備人工角膜的目的,不僅保證了打印效果,而且節(jié)省了時(shí)間。

5 展望

水凝膠作為一種生物相容性良好的組織材料,已經(jīng)在各個(gè)行業(yè)得到推廣應(yīng)用,尤其在組織工程領(lǐng)域,更是展示出了其作為生物材料潛在的應(yīng)用價(jià)值。人工角膜的制備是一個(gè)精細(xì)的系統(tǒng)工程,既要有穩(wěn)定的支架結(jié)構(gòu),又要兼顧角膜的生理功能,應(yīng)用于臨床還有一段很長(zhǎng)的路要走。但水凝膠與3D生物打印的結(jié)合為人工角膜的制備提供了現(xiàn)實(shí)可能,尤其伴隨著智能材料、4D打印時(shí)代的到來(lái),更是為這一目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)增添了新的動(dòng)力。相信隨著水凝膠材料不斷改進(jìn)和科技的迅猛發(fā)展,其將在組織工程和人工角膜制備領(lǐng)域扮演重要角色,助推人工角膜合成技術(shù)的快速發(fā)展,真正造福于人類。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突