柴薩薩,蔡 昊,劉夏飛,趙 靜,宋敬東,李金松,裴銀輝,李利利,段招軍

A組輪狀病毒(rotavirus A,RVA)是引起全世界嬰幼兒急性重癥胃腸炎和腹瀉的主要病原體,每年相關(guān)的死亡病例達20多萬例,其中多數(shù)發(fā)生在發(fā)展中國家,造成了巨大的社會經(jīng)濟負擔(dān)[1-2]。RVA屬于呼腸病毒目(Reovirales)平滑呼腸病毒科(Sedoreoviridea)輪狀病毒屬,是一種雙鏈RNA病毒,其基因組包含11個節(jié)段,編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1-4,VP6和VP7)和6種非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1-6)[3]。

隨著“反向遺傳學(xué)”系統(tǒng)(reverse genetics system,RGS)的發(fā)展,研究者可在體外改造和拯救病毒,為基因功能研究和病毒拯救提供了強大的平臺[4]。輪狀病毒的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)最初于2006年建立,其依靠輔助病毒的幫助,基于部分質(zhì)粒實現(xiàn)了RVA基因片段的替換[5]。之后經(jīng)歷10多年的不斷探索,完全基于質(zhì)粒的輪狀病毒反向遺傳系統(tǒng)在2017年建立[6]。近幾年,利用反向遺傳技術(shù)美國和日本報道多篇以輪狀病毒作為載體表達外源蛋白的研究,這些研究主要以輪狀病毒NSP1和NSP3片段為改造對象并插入外源基因。NSP1被認為是非必需病毒蛋白,具有拮抗干擾素的作用[7]。且有研究發(fā)現(xiàn),牛輪狀病毒A5-16株的NSP1片段(1 087 bp)ORF區(qū)缺失500 bp,只表達N端50個氨基酸,接種小鼠后仍能誘導(dǎo)腹瀉[8]。這為基于輪狀病毒NSP1截短片段作為載體表達外源基因提供思路。

本研究將A組輪狀病毒SA11株的NSP1片段5′N端223至1 388的核苷酸截短(模擬牛A5-16株的缺失位點),并插入了終止-再啟動元件(P2A)連接的EGFP基因,構(gòu)建質(zhì)粒pT7/SA11-NSP1-EGFP。采用已建立的“12質(zhì)?！陛啝畈《痉聪蜻z傳系統(tǒng)成功拯救具有良好遺傳穩(wěn)定性的重組病毒rSA11/NSP1-EGFP。旨在為進一步開發(fā)基于輪狀病毒載體的聯(lián)合疫苗研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基(Gibco),胎牛血清(FBS)(Gibco),胰蛋白示磷酸肉湯(TPB)(Sigma),非必需氨基酸溶液(NEAA)(Gibco),L-谷氨酰胺(L-Glutamine)(Sigma),青-鏈霉素(PS)(Gibco),胰蛋白酶(含EDTA)(Gibco),潮霉素(InvivoGen),質(zhì)粒DNA大提試劑盒(QIAGEN),Opti-MEM(Gibco),轉(zhuǎn)染試劑Trans IT○R-LT1(Mirusbio),豬九型胰蛋白酶(無EDTA)(Sigma),核酸提取試劑盒(Geneaid),SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(Solarbio),快速銀染試劑盒(碧云天生物技術(shù)),一步法RT-PCR試劑盒(Thermo Fisher)。

1.2 細胞培養(yǎng) 本研究使用的穩(wěn)定表達T7 RNA聚合酶(T7 RNAP)的幼倉鼠腎細胞(BHK/T7-9)由中國疾病預(yù)防控制中心腹瀉室劉夏飛博士贈送,培養(yǎng)條件為77%DMEM+10%FBS+10%TPB+1%NEAA+1%PS+1%L-Glutamine,每隔一代傳代加潮霉素600 μg/mL以去除未表達T7 RNAP的細胞。非洲綠猴腎細胞(MA104)由本實驗室保存,培養(yǎng)條件為89%DMEM+10%FBS+1%PS。培養(yǎng)環(huán)境均為37 ℃,5% CO2的細胞培養(yǎng)箱。

1.3 質(zhì)粒構(gòu)建 本研究使用的編碼SA11-L2基因組的11個T7拯救質(zhì)粒和pCMV/NP868R 輔助質(zhì)粒由中國疾病預(yù)防控制中心腹瀉室劉夏飛博士贈送。

根據(jù)文獻報道構(gòu)建截短NSP1片段中插入EGFP基因的質(zhì)粒pT7/NSP1-EGFP-SA11:將SA11毒株NSP1片段5′端開始的第223～1 388位核苷酸刪除,插入終止-再啟動元件(P2A)連接的EGFP基因(720 bp),由蘇州金唯智生物科技公司合成cDNA序列。合成的cDNA序列替換到原pT7/NSP1-SA11表達質(zhì)粒的RsrII和NcoI位點來構(gòu)建pT7/NSP1-EGFP-SA11質(zhì)粒。構(gòu)建質(zhì)粒的核苷酸序列經(jīng)直接測序證實。

轉(zhuǎn)染所需的12個質(zhì)粒按照質(zhì)粒大提試劑盒QIAGEN EndoFree Plasmid Maxi Kit說明書提取,提取的質(zhì)粒均經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定條帶大小符合超螺旋結(jié)構(gòu),并通過分光光度計測定其純度和濃度,吸光度260/280≈1.9,每個質(zhì)粒濃度均調(diào)整至1 mg/mL。

1.4 BHK/T7-9細胞轉(zhuǎn)染及病毒拯救 采用“12質(zhì)粒系統(tǒng)”進行病毒拯救[9],具體步驟如下:

BHK/T7-9細胞以4×105/孔的密度鋪于六孔板,培養(yǎng)24 h至細胞匯合度達到80%左右進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時,首先將12個質(zhì)粒混合,包括0.8 μg的pT7/NSP1-SA11、pT7/NSP3-SA11、pT7/NSP4-SA11、pT7/VP1-SA11、pT7/VP2-SA11、pT7/VP3-SA11、pT7/VP4-SA11、pT7/VP6-SA11、pT7/VP7-SA11、pCMV/NP868R,和2.4 μg的pT7/NSP2-SA11、pT7/NSP5-SA11,當(dāng)拯救重組病毒rSA11/NSP1-EGFP時,將質(zhì)粒pT7/NSP1-SA11替換成pT7/NSP1-EGFP-SA11。質(zhì)粒混合物中加220 μL的Opti-MEM,用移液槍輕輕混勻,再加入40 μL的TransIT-LT1轉(zhuǎn)染試劑,短暫渦旋混勻,置于室溫下孵育20 min。孵育結(jié)束后,均勻滴入六孔板BHK/T7-9細胞中,輕晃搖勻,置于CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后,換不含胎牛血清的培養(yǎng)基,加重懸的MA104細胞5×104/孔,4 h后每孔加胰蛋白酶至終濃度為0.5 μg/mL,混合培養(yǎng)4 d將細胞凍融3次后,14 000×g離心15 min,上清保存于-80 ℃,傳代接毒備用。

1.5 拯救病毒傳代培養(yǎng) 將MA104細胞以4×105/孔的密度接種于6孔板,培養(yǎng)2 d。細胞匯合成單層后,PBS清洗細胞2次,每孔加2 mL的DMEM,放培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。隨后取離心后的病毒上清600 μL,加胰蛋白酶(15 μg/mL)、CaCl2(800 μg/mL)于37 ℃水浴鍋活化病毒1 h,然后棄去6孔板中DMEM,均勻滴入活化后的上清液。放入培養(yǎng)箱吸附2 h,期間每20 min輕晃板子1次。吸附結(jié)束,棄去上清液,用PBS清洗2次,每孔加2 mL的DMEM(含胰蛋白酶5 μg/mL),繼續(xù)培養(yǎng),并每天觀察細胞病變。按同樣方法盲傳3代來擴增病毒。

1.6 TCID50法測定病毒滴度 將MA104細胞以1×104/孔的密度鋪于96孔板,培養(yǎng)1 d至細胞匯合成單層。取活化后的100 μL病毒上清做10倍稀釋(10-1～10-9),以100 μL/孔分別接種至長滿MA104細胞的96孔板中,對照采用活化處理的DMEM,每個稀釋度和對照均做8個重復(fù),放回培養(yǎng)箱吸附2 h。將病毒稀釋液棄掉,用PBS清洗1次,每孔加150 μL含5 μg/mL胰蛋白酶的DMEM維持液,置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。每天觀察并記錄各稀釋度出現(xiàn)CPE的孔數(shù),然后使用Kaber法計算各病毒的TCID50值。

1.7 電鏡觀察 依照上述方法,將rSA11和rSA11/NSP1-EGFP接種于MA104細胞,MOI值為0.01,接種48 h后,吸取細胞培養(yǎng)液,2 000×g離心10 min,取上清,磷鎢酸負染;細胞刮下收集,低速離心,去上清,加入2.5%等戊二醛固定,然后用1%四氧化鋨固定,水洗3次,乙醇梯度脫水,用環(huán)氧樹脂浸透,70 ℃聚合12 h。使用超薄切片機半手動獲得超薄切片(80 nm),用醋酸鈾酰和檸檬酸鉛染色。最后,使用Tecnai12透射電子顯微鏡(FEI,荷蘭)觀察。

1.8 PAGE電泳分析 使用Virus Nucleic Acid Extraction Kit II(Geneaid,中國臺灣)試劑盒提取病毒核酸。取核酸樣品20 μL加10 μL 2×RNA上樣緩沖液混勻后,在預(yù)制的1.5 mm的聚丙烯酰胺凝膠上(PAGE)電泳(5%濃縮膠和10%下層膠),80V跑30 min以濃縮樣品后,70 V電泳6 h以分離條帶。電泳結(jié)束后,采用銀染試劑盒進行銀染色,觀察RVA的11條基因組并采用凝膠成像儀拍照。

1.9 RT-PCR鑒定 為進行重組病毒NSP1片段的鑒定,本研究設(shè)計了SA11病毒株的NSP1片段的特異性引物,SA11-NSP1-F: 5′-TGGATGCCAGTTCCTGATGC-3′和SA11-NSP1-R:5′-TGCCAGCTAGGCGCTACTCT-3′。首先按上述方法提取病毒核酸,經(jīng)SuperScript II Reverse Transcriptase試劑盒(Invitrogen,美國)進行逆轉(zhuǎn)錄后,采用TAKARA的Premix Taq擴增rSA11/NSP1-EGFP(1 105 bp)與rSA11(1 459 bp)片段。反應(yīng)條件:98 ℃ 15 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,35個循環(huán)。擴增產(chǎn)物送至北京天一輝遠公司測序,比對分析rSA11和rSA11/NSP1-EGFP的NSP1基因片段序列。

1.10 生長動力學(xué)曲線 將拯救病毒按前述方法以MOI值為0.01接種于MA104細胞6孔板中,重組病毒(rSA11/NSP1-EGFP與rSA11)均做3個重復(fù)。在感染MA104細胞后0 h、12 h、24 h、36 h和48 h的時候分別收取培養(yǎng)液上清,14 000×g離心10 min ,上清-80 ℃保存。與此同時,取各時相培養(yǎng)液200 μL提取病毒核酸,參照毛彤瑤等人[10]建立的方法合成RotaA-NSP3的引物和探針,采用AgPath-IDTM One-step RT-PCR Kit試劑盒根據(jù)說明書進行Taqman Real-time PCR對上清中病毒進行定量,反應(yīng)條件為45 ℃ 20 min,1循環(huán);95 ℃ 10 min,1循環(huán);95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,40循環(huán)。計算各時相病毒的基因組拷貝數(shù),繪制細胞內(nèi)病毒RNA生長動力學(xué)曲線。

2 結(jié) 果

2.1 rSA11和rSA11/NSP1-EGFP的拯救 按照“12質(zhì)粒”的輪狀反向遺傳系統(tǒng),轉(zhuǎn)染了12質(zhì)粒的BHK/T7-9細胞與MA104細胞混合培養(yǎng),在培養(yǎng)4 d后,取培養(yǎng)物上清首先采用輪狀病毒膠體金初步檢測,rSA11和rSA11/NSP1-EGFP上清均顯示為輪狀病毒陽性。將凍融離心后的培養(yǎng)物上清接種至MA104細胞進行病毒擴增,在顯微鏡下均觀察到明顯的細胞病變效應(yīng),具有典型的A組輪狀病毒病變特征(圖1A、B),即細胞變圓,胞質(zhì)暗沉,細胞脫落。在對照組細胞中未觀察到細胞病變效應(yīng)(圖1C)。

注:A、D. rSA11感染后細胞病變及熒光觀察;B、E. rSA11/NSP1-EGFP感染后細胞病變及熒光觀察;C、F.對照MA104細胞的細胞形態(tài)及熒光觀察。

2.2 rSA11和rSA11/NSP1-EGFP的鑒定

2.2.1 rSA11和rSA11/NSP1-EGFP的熒光觀察 將rSA11和rSA11/NSP1-EGFP的第3代培養(yǎng)物接種至MA104細胞。在熒光顯微鏡下觀察,只在rSA11/NSP1-EGFP感染的MA104細胞中觀察到明顯的綠色熒光(圖1E),在rSA11感染MA104細胞和對照孔細胞中并未觀察到熒光(圖1D、F)。

2.2.2 rSA11和rSA11/NSP1-EGFP的電鏡觀察 收集接種rSA11和rSA11/NSP1-EGFP的細胞培養(yǎng)上清,處理后,在透射電子顯微鏡下觀察,均可觀察到直徑70 nm左右的球形輪狀病毒粒子,包括實心和空心兩種形態(tài)(圖2)。

注:A.接種rSA11的細胞培養(yǎng)上清;B. 接種rSA11/NSP1-EGFP的細胞培養(yǎng)上清。

2.2.3 rSA11和rSA11/NSP1-EGFP的基因組鑒定 提取病毒核酸,進行了dsRNA基因組PAGE和RT-PCR鑒定。結(jié)果顯示,rSA11/NSP1-EGFP與rSA11的11條基因節(jié)段有10條是一一對應(yīng)的,而其中一條NSP1-EGFP遷移速度快于親本株的NSP1片段(圖3B)。RT-PCR的擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,條帶大小符合預(yù)期結(jié)果(圖3A)。測序結(jié)果也顯示,rSA11的NSP1片段與參考序列一致(1 459 bp),rSA11/NSP1-EGFP的NSP1片段包括完整的EGFP基因序列(1 178 bp)。這些結(jié)果表明我們成功拯救出了rSA11和插入外源基因的rSA11/NSP1-EGFP。

圖3 rSA11和rSA11/NSP1-EGFP基因組的RT-PCR(A)和PAGE(B)鑒定Fig.3 RT-PCR (A) and PAGE (B) identification of rSA11 and rSA11/NSP1 EGFP genomes

2.3 重組病毒的滴度及生長動力學(xué) 為了確定NSP1截短的ORF區(qū)插入EGFP基因是否會影響重組病毒的感染力,取P3代病毒rSA11和rSA11/NSP1-EGFP以MOI為0.01感染MA104細胞,每隔12 h收取細胞培養(yǎng)液,定量不同時間點的RNA載量,繪制生長曲線。測定了48 h收取病毒液的TCID50。定量結(jié)果顯示,rSA11和rSA11/NSP1-EGFP在MA104細胞中復(fù)制良好,并產(chǎn)生明顯的CPE。rSA11和rSA11/NSP1-EGFP均在12 h已開始復(fù)制,在36 h到達復(fù)制平臺期,48 h與36 h的病毒拷貝數(shù)無差異,兩個毒株的復(fù)制動力學(xué)趨勢一致(圖4B)。Real-time PCR 和TCID50結(jié)果顯示,rSA11/NSP1-EGFP的病毒RNA水平和病毒滴度略低于rSA11,P<0.05,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖4A和4B)。

2.4 重組病毒的遺傳穩(wěn)定性 為驗證重組病毒是否可以穩(wěn)定傳代,取P5和P10代重組病毒rSA11/NSP1-EGFP進行dsRNA基因組PAGE分析, rSA11作為對照。結(jié)果顯示P5和P10代病毒rSA11/NSP1-EGFP的NSP1-EGFP片段條帶位置一致,均出現(xiàn)正確遷移(圖5)。結(jié)果表明,將NSP1片段ORF區(qū)截短并插入720 bp的EGFP基因,獲得重組病毒的遺傳穩(wěn)定性在連續(xù)傳代10次后依舊保持基因穩(wěn)定性。

圖5 rSA11/NSP1-EGFP的dsRNA遺傳穩(wěn)定性Fig.5 Genetic stability of dsRNA in rSA11/NSP1 EGFP

3 討 論

A組輪狀病毒仍是全世界嬰幼兒嚴重急性胃腸炎的最重要原因。針對輪狀病毒感染目前尚無特異性藥物,主要采取對癥治療,疫苗接種是預(yù)防RV感染的有效措施。雖然十多年前開始在全球引入了輪狀病毒疫苗接種,如:Rotarix、RotaTeq、Rotavac、ROTASIIL、Rotavin-M1、LLR,但輪狀病毒感染每年仍導(dǎo)致全球20萬人以上死亡,主要是在低收入國家[11]。人用商品化RV疫苗在發(fā)達國家有較高免疫效率,而在低收入國家免疫效率較低,且存在一定的潛在安全問題[12]。因此,對于新生兒、老年人和免疫缺陷的成年人來說開發(fā)安全并高效的抗 RV 的藥物和疫苗都是十分迫切的。

反向遺傳學(xué)是研究宿主-病原體相互作用、病毒蛋白質(zhì)功能和病毒感染生物學(xué)的有力工具,且在新型疫苗設(shè)計方面有很大潛力[13-15]。輪狀病毒反向遺傳學(xué)系統(tǒng)的建立較為滯后,于2017年建立完全基于質(zhì)粒的14質(zhì)粒RVA反向遺傳系統(tǒng)[6]。之后不久,Philip AA等人通過修改其程序為12質(zhì)粒系統(tǒng),進一步提高了病毒拯救效率。該系統(tǒng)通過將11個T7驅(qū)動的編碼RVA基因組的質(zhì)粒和1個編碼非洲豬瘟病毒加帽酶的輔助質(zhì)粒(pCMV/NP868R)借脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到表達T7 RNA聚合酶的BHK/T7-9細胞,重組輪狀病毒可以高效獲得[9]。最新研究表明,僅轉(zhuǎn)染11個編碼RVA基因組的拯救質(zhì)粒,仍可高效拯救重組病毒[16]?；谶@3種輪狀病毒反向遺傳系統(tǒng),研究人員成功的產(chǎn)生了多種重配以及表達報告基因的具有感染性的重組輪狀病毒[16-18]。

我們在拯救rSA11病毒株時對拯救過程進行了一些改進,經(jīng)驗如下:①最關(guān)鍵的是狀態(tài)良好的BHK/T7-9細胞,使用添加10%胎牛血清、1%NEAA、10%TPB的高糖DMEM完全培養(yǎng)基,額外的營養(yǎng)成分補充有助于BHK/T7-9細胞在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后延長活力,此外細胞每周2次傳代,隔代使用潮霉素補充培養(yǎng)基,用于篩選穩(wěn)定表達T7 RNA聚合酶的BHK/T7-9細胞;②最佳的細胞密度,即只在細胞匯合度達到80%時進行轉(zhuǎn)染;③轉(zhuǎn)染試劑和培養(yǎng)基在使用前要平衡至室溫;④轉(zhuǎn)染時可適當(dāng)增加11個T7拯救質(zhì)粒的用量1～2倍;⑤轉(zhuǎn)染前要確保質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑充分混合;⑥加入MA104細胞混合培養(yǎng)期間按需添加碳酸氫鈉控制細胞培養(yǎng)的pH值。另外,支原體污染BHK/T7-9和MA104細胞可能是輪狀病毒反向遺傳系統(tǒng)出現(xiàn)重組病毒失敗的重要因素。在細胞的培養(yǎng)過程中,我們同時使用基于PCR和熒光染色法的支原體檢測試劑盒定期來檢查BHK/T7-9細胞和MA104細胞,確保用到的細胞無支原體污染,如若檢測到,重新復(fù)蘇新的細胞系,丟棄之前使用過的培養(yǎng)基和培養(yǎng)基補充劑,并徹底清洗細胞培養(yǎng)箱,生物安全柜,實驗室工作臺和移液器。

本研究將輪狀病毒SA11株的NSP1片段5′端223至1 388的核苷酸截短,并插入了P2A終止-再啟動元件連接的EGFP基因,構(gòu)建質(zhì)粒pT7/SA11-NSP1-EGFP。采用已建立的RV反向遺傳12質(zhì)粒系統(tǒng)[9],以pT7/SA11-NSP1-EGFP質(zhì)粒替換掉原來系統(tǒng)的pT7/SA11-NSP1質(zhì)粒,成功拯救出了表達熒光報告基因(EGFP)的具有感染性的重組輪狀病毒,并通過RT-PCR、SDS-PAGE電泳、電鏡觀察及間接免疫熒光等方法,進行了一系列的結(jié)果驗證,證明了RVAs除了其原始基因組dsRNA外,還可以攜帶外源核苷酸作為遺傳物質(zhì),而且連續(xù)10次傳代后重組病毒基因組依然保持穩(wěn)定。當(dāng)我們按相同MOI值接種病毒時,重組病毒的復(fù)制效率略低于親本株,且拯救效率也要低于親本株。下一步的工作重點將提高重組病毒的拯救效率。

在重組RVA具有感染性的情況下,熒光報告基因的表達使得RVA在體內(nèi)和體外復(fù)制實現(xiàn)可視化。Hatazawa R等人已報告基于該系統(tǒng)可以生成表達多種外源基因的重組RV[19],插入片段的長度可達2 160 bp,這使其成為一種有潛力的靈活病毒載體。事實上,可以將編碼其他病原體中和抗原的序列插入RVA基因組,從而產(chǎn)生基于RVA的多價載體疫苗[20-21],不僅可以誘導(dǎo)對RVA的免疫保護,還可以誘導(dǎo)對插入其他病原體的免疫保護。因此,基于RVA的載體將在廣泛的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用中具有吸引力。

利益沖突：無

引用本文格式：柴薩薩,蔡昊,劉夏飛,等.利用反向遺傳技術(shù)產(chǎn)生表達外源基因的重組SA11輪狀病毒[J].中國人獸共患病學(xué)報,2024,40(2):140-146. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2024.00.020