王姝捷,謝 鑫,張 曦,陳 明,雷桃紅,鄧俊杰,許運斌

狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)引起的一種高度致死性的人獸共患傳染病,是當前危害人類公共衛(wèi)生的重要疫病。所有種類的哺乳動物均對RABV易感,其中犬是RABV最主要的儲存宿主和傳播宿主,直接導致了世界范圍內(nèi)大多數(shù)人狂犬病的死亡?？袢≡谌澜绶秶鷥?nèi)流行,造成每年約5～7萬人死亡,其中約95%的人狂犬病死亡病例發(fā)生在非洲和亞洲[1]。我國在世界上屬于狂犬病高發(fā)地區(qū),發(fā)病和死亡人數(shù)曾在歷史上一段時間僅次于印度,居全球第二[2]?？袢∫坏┌l(fā)病,最終會出現(xiàn)幾乎100%的死亡。因此,狂犬病極大的危害性使人們意識到加大對狂犬病病毒研究力度的必要性。目前,通過研究參與RABV復制過程中的宿主細胞因素,在細胞水平分析它們對RABV復制的作用,并揭示其調(diào)控RABV復制的分子機制,可為限制或阻斷病毒在宿主體內(nèi)的復制增殖提供靶標具有重要意義。

狂犬病病毒是不分節(jié)段、單分子負鏈RNA病毒,其基因組長度大約12 kb,編碼5種病毒結(jié)構(gòu)蛋白:核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、糖蛋白(G)和聚合酶蛋白(L),順序為3′-N-P-M-G-L-5′。在這5種病毒結(jié)構(gòu)蛋白中,M蛋白的研究受到廣泛關注。M蛋白由202個aa組成,約23 kD,是RABV病毒粒子中包膜內(nèi)側(cè)主要蛋白,也是病毒粒子中最小的病毒結(jié)構(gòu)蛋白。M蛋白是一種多功能性蛋白,在調(diào)控病毒轉(zhuǎn)錄與復制、促進病毒粒子脫衣殼、促進病毒粒子組裝和出芽、誘導特定細胞凋亡和影響病毒致病力等方面發(fā)揮著重要作用[3-10]。在誘導細胞凋亡方面,RABV病毒M蛋白可部分定位至線粒體,從而誘導細胞凋亡[7]。此外,有研究發(fā)現(xiàn)RABV野毒株GD-SH-01病毒M基因替代疫苗毒株HEP-Flury病毒M基因可顯著促進重組病毒誘導的細胞自噬,但RABV的M蛋白本身并不能誘導細胞自噬[11]。那么,M蛋白是如何與自噬或凋亡相關的宿主細胞因素相關聯(lián)進而參與或影響病毒復制,這是一個非常值得探討的問題。

Podins是一個富含脯氨酸的肌動蛋白結(jié)合蛋白家族。SYNPO2是Podins家族的成員,該蛋白含有一個PDZ結(jié)構(gòu)域和一個富含脯氨酸的基序(PPPY),被認為是侵襲性癌癥的抑癌因子[12],其發(fā)生甲基化修飾是預測晚期腎癌抗血管生成反應的生物標志物[13]。有研究發(fā)現(xiàn),在肌細胞中,SYNPO2與BAG3蛋白借助基序PPPY與WW結(jié)構(gòu)域的相互作用,可促進肌細胞機械應激過程中自噬泡的形成[14]。還有研究發(fā)現(xiàn),在神經(jīng)元細胞中同樣可以表達SYNPO2蛋白[15-16],但SYNPO2蛋白在正常神經(jīng)元細胞尤其是病毒感染的神經(jīng)元細胞中發(fā)揮著怎樣的生物學功能和如何發(fā)揮功能尚不清楚,值得探討。

本研究以RABV感染人神經(jīng)母細胞瘤細胞SK-N-SH為研究模型,借助分子生物學、細胞生物學、生物化學、病毒學等手段研究SYNPO2蛋白在RABV復制中的作用,為進一步深入研究SYNPO2影響RABV復制的具體分子細節(jié)奠定基礎,有助于抗RABV新藥物靶標的研究開發(fā)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與器材 實時熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD公司);冷凍離心機(美國Beckman公司);全波長酶標儀(美國Thermo Fisher公司);化學發(fā)光成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司);二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher公司);蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜設備(美國BIO-RAD公司);激光共聚焦顯微鏡(德國ZEISS公司);普通熒光倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司);96 孔、6 孔細胞培養(yǎng)板(中國NEST公司);玻底培養(yǎng)皿(中國NEST公司);PCR八聯(lián)管(中國上海生工公司)。

1.2 細胞和毒株 人神經(jīng)母細胞瘤細胞SK-N-SH細胞,培養(yǎng)于含5%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中?？袢〔《竟潭ǘ局闏VS-11和候選疫苗毒株SRV9(均為二級生物安全操作水平毒株),在SK-N-SH細胞中擴繁,測定病毒滴度,分裝,保存于-70 ℃。

1.3 抗體 狂犬病病毒M蛋白兔多抗,由本實驗室委托杭州華安生物科技有限公司制備并保存;狂犬病病毒P蛋白鼠單抗由昆明理工大學生命科學與技術學院張金陽教授惠贈;beta-actin鼠單抗、GAPDH鼠單抗購自杭州華安生物技術有限公司;SYNPO2兔多抗(專用于WB)購自美國Proteintech公司;SYNPO2兔多抗(專用于IFA)購自北京博奧森生物技術有限公司;HA鼠單抗(用于WB和IFA)購自愛必信(上海)生物科技有限公司;HA兔單抗(專用于IFA)購自美國CST公司;FITC標記的羊抗兔IgG購自美國KPL公司;Alexa Flour 594 標記的羊抗鼠IgG購自美國CST公司;Alexa Flour 405標記的羊抗鼠購自英國abcam公司。

1.4 真核表達載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)染 人源SYNPO2真核表達載體委托廣州輝駿生物科技股份有限公司構(gòu)建,以全基因合成的人源SYNPO2基因作為模板,采用特異性引物進行PCR,將全長人源SYNPO2基因克隆至PCI-neo-3xHA-MCS骨架載體中,并經(jīng)測序驗證成功。所采用的特異性引物為上游引物:CGTTCCAGATTACGCTCTCGAGATGGGCACAGGGGATTTTATC;下游引物:CCCTCACTAAAGGGAAGCGGCCGCTCATGTTTGG-CGTCTCCATC。SRV9毒株M基因真核表達載體由本實驗室構(gòu)建,以SRV9感染的細胞cDNA作為模板,采用特異性引物進行PCR,將全長M基因克隆至PCMV-N-myc骨架載體中,并經(jīng)測序驗證成功。所采用的特異性引物為上游引物:CGGAATTCCGATGAACCTCCTACGTAAGATAG-T;下游引物:CCGCTCGAGCGG TTATTCTAGAAGCAGAGAGGAAT。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SK-N-SH細胞采用ExFectTM轉(zhuǎn)染試劑(中國Vazyme公司)。

1.5 人源SYNPO2 shRNA干擾質(zhì)粒及其轉(zhuǎn)染 SK-N-SH細胞中SYNPO2基因的敲降采用載體介導的shRNA干擾方法。pGPU6/Neo載體介導的shRNA用于干擾SYNPO2(NM_133477.3;產(chǎn)品編號:SYNPO2-homo-535,靶序為GCAGAAGA-GCTGATCTTAAGG;產(chǎn)品編號:SYNPO2-homo-1178,靶序列為GGGTGTTGATGTTTAAGAA-GC),這些載體和無義干擾 shRNA載體(靶序列為GTTCTCCGAACGTGTCACGT)購自上海吉瑪生物技術有限公司。采用ExFectTM轉(zhuǎn)染試劑將shRNA干擾載體轉(zhuǎn)染至細胞密度達80%的SH-N-SH細胞。

1.6 免疫熒光實驗 SK-N-SH細胞鋪至玻底培養(yǎng)皿,即共聚焦平皿,過夜貼壁后轉(zhuǎn)染PCI-neo-3XHA-SYNPO2質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染一定時間后進行RABV感染;或共轉(zhuǎn)染PCI-neo-3XHA-SYNPO2和PCMV-N-myc-M(SRV9)兩個質(zhì)粒。病毒感染或質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染48 h后,棄去細胞上清,加入預冷的1xPBS洗滌3遍,然后吸干PBS,加入預冷固定液(甲醇∶丙酮=1∶1或4%多聚甲醛)對細胞進行固定,-20 ℃固定30 min或室溫固定30 min。棄去固定液,用PBS漂洗若干遍。甲醇∶丙酮固定后的細胞加入含有一抗的5%脫脂奶;4%多聚甲醛固定后的細胞先采用0.1% Triton x-100對細胞進行通透,后加入含有一抗的5%脫脂奶,37 ℃孵育1.5 h。棄去一抗,用PBS漂洗3遍除去非特異性結(jié)合的抗體。然后加入含有相應熒光二抗的5%脫脂奶,37 ℃孵育1 h。棄去二抗,用PBS漂洗3遍。最后將共聚焦平皿置于蔡司共聚焦顯微鏡(德國蔡司公司)下觀察熒光,并拍照,分析各蛋白亞細胞定位情況。

1.7 免疫印跡實驗 RABV感染SK-N-SH細胞48 h后收取蛋白樣品(裂解液裂解 (50 mmol/L Tris-Cl pH 7.4, 1%SDS,1%Triton X-100, 1 mmol/L PMSF);或SYNPO2過表達質(zhì)?；騭hRNA干擾質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染SK-N-SH細胞,轉(zhuǎn)染12 h后進行RABV感染,在RABV感染48 h后收取蛋白樣品(裂解液裂解 (50 mmol/L Tris-Cl pH 7.4, 1%SDS,1%Triton X-100, 1 mmol/L PMSF),冰上裂解5 min,然后與SDS 5ⅹ蛋白上樣緩沖液(上海碧云天公司)100 ℃煮沸10 min。接著對煮沸過的蛋白樣品進行4 ℃ 12 000 r/min 10 min的離心,取蛋白樣品上清進行電泳,程序為80 V恒壓120 min,至目的條帶分離充分;300 mA 120 min條件進行濕轉(zhuǎn)。濕轉(zhuǎn)成功的NC膜用5%的脫脂奶37 ℃封閉1 h,棄去脫脂奶后用PBST洗膜三次;分別加入一抗稀釋液稀釋好的一抗,4 ℃孵育過夜;PBST洗滌3次,加入稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG(1∶1 000)或羊抗兔(1∶1 000),室溫孵育2 h;PBST洗膜3次,每次10 min,然后采用化學發(fā)光儀上進行ECL顯色拍照,記錄結(jié)果,導出圖片后使用ImageJ軟件進行定量分析。

1.8 病毒滴度測定實驗 SYNPO2過表達質(zhì)?；騭hRNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞12 h后進行RABV感染,RABV感染48 h后收集感染細胞培養(yǎng)上清,接著對上清液進行病毒滴度測定。基本步驟如下:將細胞制成1×105個/mL細胞懸液,每孔100 μL接種于96孔中,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h至細胞長成單層。生物安全柜內(nèi)用無血清DMEM/F12培養(yǎng)液進行10倍倍比稀釋制備10-1～10-8共8個稀釋度的病毒液接種于上述已準備好的細胞中,每個稀釋度設6個復孔,每孔100 μL,置于37 ℃、5% CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。病毒感染48 h后采用預冷固定液(甲醇∶丙酮=1∶1)固定細胞,之后采用M兔多抗、FITC-羊抗兔IgG對細胞進行間接免疫熒光染色,接著采用普通熒光顯微鏡進行熒光信號的觀察,并最終計算出病毒滴度(TCID50)。

1.9 實時熒光定量PCR實驗 SYNPO2過表達質(zhì)粒或shRNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞12 h后進行病毒感染,病毒感染48 h,采用TRIZOL裂解液進行細胞總RNA抽提。抽提出來的總RNA采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司)反轉(zhuǎn)成單鏈cDNA。狂犬病病毒基因組和反基因組RNA的反轉(zhuǎn)錄采用特異性引物進行,病毒mRNA和內(nèi)參GAPDH mRNA的反轉(zhuǎn)錄采oligo(dT)20和隨機引物進行。熒光實時定量qRT-PCR采用CFX96型熒光定量PCR系統(tǒng)(Bio-rad公司)和 1×SYBR premix EX-Taq(Takara)進行。PCR 的條件參數(shù)如下:50 ℃ 2 min,95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,40個循環(huán)。溶解曲線采用系統(tǒng)默認的PCR程序獲得。定量數(shù)據(jù)的結(jié)果分析采用Bio-Rad CFX Manager 版本的軟件進行。定量方法如下:分析病毒 mRNA、基因組、反基因組的差異表達水平采用相對定量的方法(2-ΔΔCt法)。

1.10 生物統(tǒng)計學分析 采用GraphPad Prism 5.0軟件內(nèi)置統(tǒng)計學軟件t檢驗對各組數(shù)據(jù)統(tǒng)計學差異水平進行分析。檢驗水準α=0.05,P>0.05ns表示差異沒有統(tǒng)計學意義、*表示P<0.05,**表示P<0.01和***表示P<0.001。

2 結(jié) 果

2.1 病毒感染狀態(tài)下SYNPO2蛋白的表達變化 首先我們分析了RABV感染后SYNPO2蛋白的表達變化情況。如圖1A、1B所示,免疫印跡分別分析了RABV毒株CVS-11和SRV9感染SK-N-SH細胞后SYNPO2蛋白的表達水平,結(jié)果顯示,兩種病毒感染48 h、72 h后,SYNPO2蛋白均呈現(xiàn)下調(diào)表達趨勢(見圖中SYNPO2/GAPDH灰度值比值)。

圖1 免疫印跡分析病毒感染狀態(tài)下SYNPO2蛋白的表達情況Fig.1 Western blot analysis of SYNPO2 expression during rabies virus infection

2.2 真核表達載體構(gòu)建及表達鑒定 經(jīng)廣州輝駿生物科技股份有限公司對委托其構(gòu)建的載體進行測序,結(jié)果顯示載體中SYNPO2基因序列正確,且未發(fā)生移碼;經(jīng)生工生物工程(上海)股份有限公司對本實驗室構(gòu)建的載體進行測序,結(jié)果顯示SRV9毒株M基因序列正確,且未發(fā)生移碼。接著將PCI-neo-3xHA-SYNPO2、PCMV-N-myc-M(SRV9)及其各自的對照骨架質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SK-N-SH細胞,轉(zhuǎn)染48h收獲細胞總蛋白樣品,分別采用HA鼠抗和myc鼠抗免疫印跡檢測各融合蛋白 ,條帶大小與預期大小相符(圖2A、2B)。如此成功構(gòu)建了PCI-neo-3xHA-SYNPO2和PCMV-N-myc-M(SRV9)真核表達載體。

圖2 免疫印跡分析真核表達載體的表達情況Fig.2 The expression of eukaryotic expression vector analyzed by western blotting

2.3 干擾載體構(gòu)建及干擾效果鑒定 經(jīng)上海吉瑪生物技術有限公司對委托其構(gòu)建的SYNPO2 shRNA干擾載體進行測序,結(jié)果顯示載體中相關序列完全正確,且未發(fā)生移碼。接著將各個編號的SYNPO2 shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細胞一定時間,收獲蛋白樣品進行免疫印跡分析。如圖3A、3B,結(jié)果顯示,編號535 shRNA質(zhì)粒對SYNPO2干擾效果最佳。因此,最終選擇干擾效果最佳的編號535 shRNA質(zhì)粒和干擾效果偏中等的編號1178 shRNA質(zhì)粒進行下游干擾實驗。

圖3 免疫印跡篩選SYNPO2 shRNA有效干擾質(zhì)粒Fig.3 Screening of the interference plasmid of SYNPO2 shRNA by western blotting

2.4 過表達SYNPO2對RABV復制影響的分析

2.4.1 過表達SYNPO2對RABV病毒蛋白表達影響的分析 在2.2的基礎上,我們進一步分析了SYNPO2過表達后對RABV病毒SRV9蛋白表達的影響。如圖4A、4B,結(jié)果顯示,在病毒感染48 h后(48 h p.i.),過表達SYNPO2后相對于對照組可引起病毒M蛋白的顯著累積(P<0.05*,其中圖4B為圖4A的WB灰度值比值所作柱狀圖)。

注:A. 免疫印跡分析過表達SYNPO2對RABV病毒蛋白表達的影響。B.ImageJ 軟件分析A中M、beta-actin蛋白條帶灰度值,并計算M/beta-actin灰度值比值及作統(tǒng)計學分析。C.相對定量qRT-PCR分析過表達SYNPO2對RABV病毒轉(zhuǎn)錄和復制水平的影響。D.TCID50測定分析過表達SYNPO2對RABV病毒感染力的影響。

2.4.2 過表達SYNPO2對RABV病毒轉(zhuǎn)錄和復制水平影響的分析 由此同時,我們分析了SYNPO2過表達后對RABV病毒SRV9基因組轉(zhuǎn)錄和復制水平的影響。如圖4C,結(jié)果顯示,在48 h p.i.,過表達SYNPO2相對于對照組未引起病毒M基因轉(zhuǎn)錄水平的顯著變化(P>0.05ns),且未引起病毒基因組復制水平的顯著變化(P>0.05ns)。

2.4.3 過表達SYNPO2對RABV病毒感染力影響的分析 此外,我們分析了SYNPO2過表達后對細胞釋放可感染性RABV病毒粒子能力的影響。如圖4D,結(jié)果顯示,在48 h p.i.,過表達SYNPO2相對于對照組未顯著增強細胞釋放可感性RABV病毒粒子的能力(P>0.05ns)。

2.5 干擾SYNPO2對RABV復制影響的分析

2.5.1 干擾SYNPO2對RABV病毒蛋白表達影響的分析 在2.3的基礎上,我們進一步分析了SYNPO2敲降后對RABV病毒SRV9蛋白表達的影響。如圖5A、5B,結(jié)果顯示,在48 h p.i.,相對于無義shRNA質(zhì)粒(shNC)對照組,采用shRNA(編號535 shRNA質(zhì)粒和編號1178 shRNA質(zhì)粒)敲降SYNPO2后能夠?qū)е虏《綧蛋白水平的顯著下降(編號535 shRNA質(zhì)粒相對于shNC組P<0.01**;編號1178 shRNA質(zhì)粒相對于shNC組P<0.001***)。

注:A. 免疫印跡分析干擾SYNPO2對RABV病毒蛋白表達的影響。B.ImageJ 軟件分析A中M、beta-actin蛋白條帶灰度值,并計算M/beta-actin灰度值比值及作統(tǒng)計學分析。C.相對定量qRT-PCR分析干擾SYNPO2對RABV病毒轉(zhuǎn)錄和復制水平的影響。D.TCID50測定分析干擾SYNPO2對RABV病毒感染力的影響。

2.5.2 干擾SYNPO2對RABV病毒轉(zhuǎn)錄和復制水平影響的分析 我們分析了SYNPO2敲降后對RABV病毒SRV9基因組轉(zhuǎn)錄和復制水平的影響。如圖5C,結(jié)果顯示,在48 h p.i.,相對于shNC對照組,采用shRNA敲降SYNPO2后未引起病毒M基因轉(zhuǎn)錄水平的顯著變化(P>0.05ns),且未引起病毒基因組復制水平的顯著變化(P>0.05ns)。

2.5.3 干擾SYNPO2對RABV病毒感染力影響的分析 我們分析了SYNPO2敲降后對細胞釋放可感染性RABV病毒粒子能力的影響。如圖5D,結(jié)果顯示,在48 h p.i.,相對于shNC對照組,采用shRNA敲降SYNPO2后可顯著降低細胞釋放可感性RABV病毒粒子的產(chǎn)量(P<0.05*)。

2.6 病毒感染和真核表達狀態(tài)下SYNPO2蛋白定位情況 為了確定病毒感染情況下細胞內(nèi)SYNPO2蛋白與病毒M蛋白的相對位置關系,我們將3xHA-SYNPO2質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染SK-N-SH細胞,轉(zhuǎn)染12 h后進行RABV病毒SRV9感染,病毒感染36 h后固定細胞,進行間接免疫熒光實驗。即分別采用HA標簽鼠單抗和M蛋白兔多抗、SYNPO2兔多抗和P蛋白鼠單抗對RABV感染的SK-N-SH細胞進行雙蛋白標記,然后采用相應的熒光二抗Alexa Fluor 594-羊抗鼠IgG和FITC-羊抗兔IgG進行顯示,并采用激光共聚焦顯微鏡拍照。如圖6A-6B,結(jié)果顯示,RABV感染細胞中SYNPO2與M蛋白存在明顯共定位關系,而SYNPO2與P蛋白則未有此現(xiàn)象。此外,我們將3xHA-SYNPO2與PCMV-N-myc-M(SRV9)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染SK-N-SH細胞,轉(zhuǎn)染48h后固定細胞,進行間接免疫熒光實驗,結(jié)果顯示真核表達情況下SYNPO2與M蛋白也存在共定位關系(如圖6C)。

注:A.病毒感染情況下M蛋白與SYNPO2的亞細胞定位情況;B.病毒感染情況下P蛋白與SYNPO2的亞細胞定位情況;C.真核表達狀態(tài)下M蛋白與SYNPO2的亞細胞定位情況

3 討 論

RABV病毒M蛋白對病毒基因組轉(zhuǎn)錄和復制之間平衡的調(diào)節(jié),以及該蛋白在病毒粒子的聚集和出芽方面發(fā)揮的重要作用,都已被廣泛描述[3,17]。另外,研究發(fā)現(xiàn)RABV病毒M蛋白通過定位于線粒體從而誘導細胞凋亡[7],同時該病毒蛋白與RABV誘導的細胞自噬密切相關[11]。RABV病毒M蛋白如何與自噬或凋亡相關的宿主細胞因素相關聯(lián)進而參與或影響病毒復制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn),SYNPO2在肌細胞中與自噬相關[14],在神經(jīng)元細胞中同樣可以表達[15-16],但SYNPO2蛋白在正常神經(jīng)元細胞尤其是病毒感染的神經(jīng)元細胞中發(fā)揮著怎樣的生物學功能和如何發(fā)揮功能也不清楚。在本研究中,我們通過免疫印跡分析發(fā)現(xiàn),RABV感染細胞可引起SYNPO2蛋白的下調(diào)表達,這提示著SYNPO2蛋白可能在RABV復制過程中發(fā)揮著作用。此外,我們發(fā)現(xiàn)在病毒感染或真核表達細胞中病毒M蛋白與SYNPO2蛋白有顯著共定位關系。由此,我們推測RABV感染引起的SYNPO2蛋白表達的下調(diào)表達可能與病毒M蛋白有直接相關性,這將在后續(xù)的研究中進行深入探討。

目前,大量研究表明M蛋白多功能性的發(fā)揮除了受到其自身基因組分的調(diào)控,同時也受到宿主蛋白的調(diào)控。其中M蛋白可利用宿主細胞不同種類的蛋白質(zhì)來實現(xiàn)其功能。M與NF-κB家族蛋白RelAp43結(jié)合,降低RelAp43與ABIN2互作,同時抑制RelAp43與p105-ABIN2-TPL2復合體的結(jié)合,導致RelAp43-p50 NF-κB二聚體的形成,從而抑制NF-κB信號途徑及IFN-β的誘導表達,最終影響RABV的致病力[10]。宿主細胞蛋白ATP6V1A通過與M蛋白互作促進病毒粒子脫衣殼,進而促進RABV復制[4]。最近有研究發(fā)現(xiàn),M和細胞蛋白TSG101的相互作用不僅對來自感染細胞的子代病毒粒子的有效出芽至關重要,而且對子彈形病毒粒子形態(tài)的形成也至關重要[6]。盡管如此,相較于病毒M蛋白本身在RABV復制中發(fā)揮著諸多重要的生物學功能,病毒M蛋白如何與細胞蛋白相關聯(lián)進而影響RABV復制的研究還是相對較少。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)過表達SYNPO2可顯著促進病毒M蛋白表達,干擾SYNPO2則顯著抑制病毒M蛋白的表達,但兩者均未顯著影響病毒M基因的轉(zhuǎn)錄及病毒基因組的復制水平;同時,過表達SYNPO2總體上未顯著影響感染性病毒粒子的釋放,而干擾SYNPO2可顯著抑制感染性病毒粒子的釋放。由此顯示,SYNPO2在RABV復制過程中起著正向調(diào)控作用。進一步的研究,我們發(fā)現(xiàn)病毒M蛋白與SYNPO2存在顯著共定位關系,遺憾的是我們通過免疫共沉淀實驗并未檢測到SYNPO2與M蛋白的相互作用。那么,SYNPO2蛋白如何影響病毒M蛋白表達和病毒復制?這有待后續(xù)深入的研究。

此外,有研究發(fā)現(xiàn)RABV感染動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)后,病毒抗原主要存在于動物大腦皮質(zhì)、海馬、皮質(zhì)下結(jié)構(gòu)的神經(jīng)元中,而在腦干和小腦中不存在;在對動物進行外周接種病毒后,病毒抗原在軀干和小腦結(jié)構(gòu)中積累最多,在皮質(zhì)下和其他腦組織中檢測到的抗原較少[18]。同時在別的研究中也發(fā)現(xiàn),病毒感染大鼠后,病毒抗原主要存在于腦干、小腦、皮質(zhì)、海馬和紋狀體中[19]。由此提示,RABV感染動物后,對動物大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)不同部位的感染力不一樣,而這可能與不同部位細胞內(nèi)部的蛋白表達水平不一有關。有研究發(fā)現(xiàn),在神經(jīng)元細胞中可表達SYNPO2蛋白[15-16],但是大腦不同部位細胞SYNPO2蛋白含量有差異(參考人蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫:https://www.proteinatlas.org/ENSG00000172403-SYNPO2/brain)。那么,RABV在感染動物或人大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)后,病毒對不同部位的感染性是否與不同部位的SYNPO2蛋白含量相關?這將在后續(xù)的研究中展開驗證。

總而言之,本研究我們初步發(fā)現(xiàn)了SYNPO2蛋白對RABV復制起著正向調(diào)控作用,這可能與病毒M蛋白直接相關。這些發(fā)現(xiàn)為進一步解析SYNPO2影響RABV復制的分子機理奠定基礎,甚至可能通過進一步的研究,尋找到抗狂犬病藥物研究的新方向。

利益沖突：無

引用本文格式：王姝捷,謝鑫,張曦,等.SYNPO2蛋白在狂犬病病毒復制過程中的功能初探[J].中國人獸共患病學報,2024,40(2):154-160. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2024.00.025