廖 娜 夏澤敏 汪 毅 聶明霞 黃敏涵 李鑫宇 譚建華 席紹峰

(廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院,廣州 511447)

氯酚類化合物(chlorophenols, CPs)是氯取代苯酚類化合物的總稱,因具有良好的殺菌殺蟲效果,被廣泛用作殺菌劑、防腐劑[1],也被作為殺菌防腐劑廣泛使用在口腔清潔護(hù)理產(chǎn)品中。然而,CPs是廣泛的內(nèi)分泌干擾物,對生物體具有致癌、致畸、致突變的“三致”效應(yīng)。其性質(zhì)穩(wěn)定,難以生物降解,能在環(huán)境中相對持久地存在,且易通過食物鏈在生物體內(nèi)富集[2],會對人體健康造成不利影響,因此多種CPs已被多國列入優(yōu)先控制的毒性污染物名單。在我國,《牙膏用原料規(guī)范(GB 22115-2008)》中對幾種氯酚類防腐劑有明確規(guī)定:雙氯酚為牙膏中限用組分,牙膏中最大允許使用濃度為0.5%,并且需在產(chǎn)品標(biāo)簽中注明“含雙氯酚”;溴氯芬、芐氯酚、氯二甲酚作為牙膏中許用防腐劑,其最大使用濃度分別為0.1%、0.2%、0.5%;六氯酚和p-氯-m-甲酚為牙膏中禁用組分。

通過對國內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)資料進(jìn)行檢索,近年來在個人護(hù)理產(chǎn)品中CPs的檢測方面,檢測方法主要有高效液相色譜法[3～6]、氣相色譜法[7]和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[8,],涉及的產(chǎn)品類型主要是化妝品、香皂等皮膚清潔用品。然而,化妝品和牙膏在配方方面存在較大差異,化妝品的方法標(biāo)準(zhǔn)僅可以作為參考,而在分析實際樣品時,樣品的溶解、均質(zhì)、提取、凈化、測定等操作均不能完全通用。因此,本方法擬采用高效液相色譜法測定牙膏中p-氯-m-甲酚、氯二甲酚、雙氯酚、芐氯酚、 溴氯芬、六氯酚等六種氯酚類防腐劑,為廣大日化行業(yè)的檢測機(jī)構(gòu)和企業(yè)用戶提供一種快捷簡便、準(zhǔn)確高效的測定方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀(美國安捷倫公司);Milli-Q超純水器(美國Millipore公司);IKA MS3 digital渦旋振蕩器(德國IKA公司);SK8200H超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司);BS 224S電子天平(德國賽多利斯公司)。

p-氯-m-甲酚(CAS號35421-08-0)、六氯酚(CAS號70-30-4 )、雙氯酚(CAS號97-23-4)、氯二甲酚(CAS號88-04-0)、芐氯酚(CAS號120-32-1)及溴氯芬(CAS號15435-29-7),純度均大于98%,德國Dr.Ehrenstorfer公司;甲醇,色譜純,德國Merck公司;乙腈,色譜純,德國Merck公司;甲酸,分析純,上海安譜科學(xué)儀器有限公司;石英砂,分析純,廣州化學(xué)試劑廠,超純水,電阻率為18.2 MΩ·cm。

乙腈溶液(70%,v/v):準(zhǔn)確移取700mL乙腈置于適量水中,再加水稀釋至1000mL,混勻。

甲酸溶液(0.1%,v/v):準(zhǔn)確移取1mL甲酸置于適量水中,再加水稀釋至1000mL,混勻。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取p-氯-m-甲酚、氯二甲酚、雙氯酚、芐氯酚、溴氯芬及六氯酚的標(biāo)準(zhǔn)品10mg (精確至0.1mg)與10mL容量瓶中,用70%乙腈溶液定容至刻度,配制成質(zhì)量濃度約為1000mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。使用時,稀釋至所需要的質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品處理

將牙膏試樣擠出約20mm后,準(zhǔn)確稱取試樣1g(精確到0.001g)于50mL聚丙烯離心管中,加入約1g石英砂,渦旋后準(zhǔn)確加入70%乙腈溶液20mL,渦旋混勻后超聲提取10min,取適量提取液以10000r/min離心5min,上清液經(jīng)0.22μm濾膜過濾后待測。

1.4 儀器條件

色譜條件:色譜柱:Weltch XB-C18(150mm×4.6mm,5μm);流動相:A:0.1甲酸,B:乙腈;梯度洗脫程序(0～2min,70%～50% A;2～7min,50% A;7～12min,50%～10% A;12～19min,10% A;19～19.1min,10%～70% A;19. 1～25min,70% A);流速:0.8mL/min;柱溫:30℃;進(jìn)樣體積:20μL;檢測波長:六氯酚、溴氯芬檢測波長為298nm,p-氯-m-甲酚、氯二甲酚、雙氯酚、芐氯酚檢測波長為282nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方式及溶解的選擇

根據(jù)p-氯-m-甲酚、氯二甲酚、雙氯酚、芐氯酚、溴氯芬及六氯酚等六種氯酚的結(jié)構(gòu)以及理化性質(zhì),對提取溶劑和提取方法進(jìn)行考察,篩選合理的提取方法。六種氯酚皆不溶或微溶于水,易溶于多數(shù)有機(jī)溶劑,考慮到牙膏產(chǎn)品在水中分散效果較好,本方法采用有機(jī)溶劑-水體系作為提取溶劑。考察了不同比例的甲醇水溶液和乙腈水溶液(0%、20%、40%、50%、60%、80%、100%)兩種溶劑體系對含有六種氯酚的提取效果。結(jié)果顯示,隨著有機(jī)相比例增加,樣液變澄清,樣液變得容易經(jīng)濾膜過濾,當(dāng)有機(jī)相比例超過90%,樣品容易成團(tuán),不易分散。在乙腈水溶劑體系中,不同比例有機(jī)溶劑提取的目標(biāo)化合物回收率相似,皆能達(dá)到90%。在甲醇水體系中,隨著甲醇比例增加,回收率逐漸增加,甲醇比例達(dá)到70%,回收率高于90%。綜合兩個溶劑體系對六種氯酚的提取情況來看,70%乙腈水溶液的響應(yīng)面積最高。同時,考慮到牙膏一般具有較好的水分散性,提取溶劑中有機(jī)溶劑的比例越高,牙膏在提取溶劑中的分散效果越差。因此選擇70%乙腈水作為六種氯酚的提取溶劑。另外,為了提高牙膏在提取溶劑中的分散效果,本方法選擇加入適量石英砂對牙膏試樣進(jìn)行輔助分散。

2.2 色譜柱的選擇

考察了Athena C8柱(250mm×4.6mm,5μm)、Eclipse XDB-phenyl(250mm×4.6mm,5μm)以及Xbridge-C18柱(250mm×4.6mm,5μm)、AQ-C18(250 mm×4.6mm,5μm)、Diamonsil -C18(150mm×4.6mm,5μm)、Weltch XB-C18(150mm×4.6mm,5μm)、Proshell EC C18(150mm×4.6mm,5μm)等不同色譜柱對p-氯-m-甲酚、氯二甲酚、雙氯酚、芐氯酚、溴氯芬及六氯酚等六種組分和樣品基質(zhì)的分離效果。結(jié)果顯示,上述色譜柱對標(biāo)準(zhǔn)溶液中目標(biāo)化合物都可以達(dá)到良好的分離效果,但在實際樣品分析時,Weltch XB-C18(150mm×4.6mm,5μm)和Eclipse XDB-phenyl(150mm×4.6mm,5μm)對大部分樣品的分離效果較好,由于溴氯芬及六氯酚在色譜柱上難以洗脫,應(yīng)避免使用含碳量高的色譜柱。鑒于C18色譜柱通用性好,本方法選定Weltch XB-C18(150mm×4.6mm,5μm)為分析色譜柱。

2.3 流動相的選擇

六種氯酚分子結(jié)構(gòu)中的羥基和色譜柱固定相中殘留的硅羥基存在較強(qiáng)的氫鍵作用,使化合物在色譜柱上保留較強(qiáng),因此,若僅以甲醇-水或乙腈-水作為流動相,可能會出現(xiàn)色譜峰嚴(yán)重拖尾或不出峰的情況。然而,加入甲酸等改性劑,可以有效減小拖尾現(xiàn)象。因此,本方法考察了甲醇-0.1%甲酸水和乙腈-0.1%甲酸水兩種流動相體系。實驗結(jié)果表明,在0.1%甲酸-乙腈流動相體系中,六種氯酚的分離度好,峰形對稱,靈敏度高。因此,本方法選用0.1%甲酸-乙腈作為流動相。此外,六種目標(biāo)物極性差異較大,不適合采用等度洗脫,而使用梯度洗脫時,隨時間增加逐漸增加有機(jī)相比例,不僅可以加快目標(biāo)物的洗脫,還可以減小半峰寬。優(yōu)化后的六種氯酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖見圖1和圖2。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液的液相色譜圖(λ=282nm)

圖2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液的液相色譜圖(λ=298nm)

2.4 檢測波長的選擇

在200～400nm 范圍內(nèi)對六種氯酚的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全波長掃描,分別獲得相應(yīng)的紫外吸收光譜圖(圖3所示)。

圖3 六種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液的紫外吸收光譜圖

由表1可知,p-氯-m-甲酚、氯二甲酚、雙氯酚、芐氯酚、溴氯芬和六氯酚的質(zhì)量濃度在0.5～20μg/mL范圍內(nèi)與相應(yīng)色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系,六種氯酚的方法檢出限為4μg/g,方法定量限為10μg/g。

表1 六種目標(biāo)物的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、方法檢出限和定量限

2.5 線性方程和檢出限

在1.4儀器條件下對系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測定。以各目標(biāo)物質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo),對應(yīng)峰面積(y)為縱坐標(biāo),分別繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。對陰性樣品添加適量六種氯酚混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照試樣前處理方法和儀器條件進(jìn)行測定,以信噪比S/N≥3確定方法檢出限,以信噪比S/N≥10確定方法定量限。線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限見表2。

表2 精密度試驗和加標(biāo)回收試驗結(jié)果(n=6)

2.6 精密度試驗及加標(biāo)回收試驗

選用二氧化硅基質(zhì)、碳酸鈣基質(zhì)和磷酸氫鈣基質(zhì)3種空白牙膏樣品為加標(biāo)基質(zhì),按1.3方法進(jìn)行處理,分別加入低、中、高3個加標(biāo)水平的氯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液(添加水平分別為10μg/g、20mg/kg、200μg/g),在1.4儀器條件下平行測定6次,測定結(jié)果見表2。由表2可知,p-氯-m甲酚的平均回收率為94.8%～99.7%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.20%～3.94%(n=6);氯二甲酚的平均回收率為93.9%～101.2%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.61%～4.87%(n=6);雙氯酚的平均回收率為93.5%～99.1%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.91%～2.96%(n=6);芐氯酚的平均回收率為91.5%～99.8%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.42%～3.24%(n=6);溴氯芬的平均回收率為95.5%～102.0%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.10%～2.96%(n=6);六氯酚的平均回收率為95.7%～99.9%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.28%～3.19%(n=6)。結(jié)果表明,本方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度,滿足分析要求。

3 結(jié)論

本研究采用高效液相色譜技術(shù)建立了牙膏中p-氯-m-甲酚、氯二甲酚、雙氯酚、芐氯酚、溴氯芬及六氯酚的檢測方法。對提取條件和色譜條件等進(jìn)行了優(yōu)化,并將該方法應(yīng)用于不同基質(zhì)牙膏的檢測。結(jié)果表明,該方法能對p-氯-m-甲酚、氯二甲酚、雙氯酚、芐氯酚、溴氯芬及六氯酚進(jìn)行準(zhǔn)確測定,且方法精密度好,滿足相關(guān)檢測需求,可為牙膏產(chǎn)品的質(zhì)量監(jiān)控提供有力的技術(shù)支撐。