荀寶茹 秦洪濤 馬 蕊 郭楠楓 劉運(yùn)平 吳 瑩 藍(lán)興國

（東北鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150040）

在開花植物中，柱頭能特異地識別本物種的花粉而拒絕其他遠(yuǎn)源花粉和真菌孢子等的萌發(fā)，這一過程極為復(fù)雜，花粉和柱頭的精準(zhǔn)識別決定授粉事件的成功完成［1-2］。柱頭作為雌蕊授粉的受感面，當(dāng)花粉落到柱頭后，會迅速啟動一條基本反應(yīng)途徑，花粉經(jīng)過黏附、水合、萌發(fā)最終生長出花粉管，穿過花柱，進(jìn)入子房，一直到達(dá)胚珠并完成受精，此過程受到多種關(guān)鍵分子調(diào)控［3-5］。自然界中，許多開花植物進(jìn)化出一種自交不親和性遺傳機(jī)制，排斥自身花粉，接受異花花粉，以避免近親繁殖，促進(jìn)雜種優(yōu)勢［6-8］。在十字花科（Brassicaceae）中，自交不親和性（SI）遺傳機(jī)制受S位點(diǎn)控制［9］，雄性S位點(diǎn)決定因子為SP11/SCR，雌性S位點(diǎn) 決 定因子為SRK［10］。SP11/SCR 和SRK 之間相互作用能夠誘導(dǎo)SRK 自磷酸化，觸發(fā)下游信號級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致自身花粉被排斥［11］。M-位點(diǎn)蛋白激酶MLPK 和具有E3泛素連接酶活性的臂重復(fù)蛋白ARC1 已 被 鑒 定 為SRK 直 接 下 游 效 應(yīng) 因 子［12-14］。SRK 磷酸化后激活下游效應(yīng)因子ARC1，使其泛素化 進(jìn) 而 降 解 親 和 因 子Exo70A1［15］、GLO1［16］和PLD1［17］，導(dǎo)致SI反應(yīng)。

一些類受體激酶RLKs 在雌雄相互作用中已被鑒定，具有感知信號分子的功能［18-19］。FERONIA（FER）屬于類受體激酶CrRLKL1家族，在植物生長、發(fā)育、激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物和非生物脅迫等多種生物過程發(fā)揮著重要調(diào)控作用［20-25］。FER 的功能缺失會導(dǎo)致雄性不育、根毛、下胚軸、葉片、種皮等細(xì)胞伸長、根系發(fā)育及對病原菌應(yīng)答等缺陷［26-31］。FER-Rac/Rop 信號能夠調(diào)控NADPH 氧化酶產(chǎn)生活性氧（ROS），導(dǎo)致結(jié)球白菜（Brassica rapa）SI 反應(yīng)［6］。類受體激酶CrRLKL1 家族另一個(gè)成員ANJEA（ANJ），也在柱頭中高度表達(dá)［28，32］。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中，花粉外被蛋白（PCP-B）和快速堿化因子（RALF23/33）競爭性與ANJ-FER 復(fù)合物結(jié)合，導(dǎo)致柱頭中ROS下降，促進(jìn)花粉水合、萌發(fā)［33］。自交不親和花粉或種間花粉與柱頭SRK 結(jié)合，能夠招募FER，激活SI 柱頭中FER 介導(dǎo)的ROS 產(chǎn)生信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，以排斥不親和花粉［6，26，34-36］，SRK 和FER 整合了種內(nèi)和種間生殖屏障的潛在機(jī)制，可為十字花科作物遠(yuǎn)緣育種提供可行性途徑［37］。

目前FER 在羽衣甘藍(lán)（Brassica oleraceavar.acephala）授粉早期事件及其潛在靶向效應(yīng)因子等方面研究非常少。本研究從羽衣甘藍(lán)柱頭中成功克隆得到BoFER基因，對其氨基酸序列、組織特異性和授粉后不同時(shí)間的表達(dá)模式進(jìn)行分析，并鑒定其與已報(bào)道的SI 因子互作關(guān)系，以期進(jìn)一步了解BoFER 可能發(fā)揮的功能，為深入解析BoFER 在生殖發(fā)育過程中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

羽衣甘藍(lán)自交不親和系（S13-bS13-b）與親和系（S45S45）種植于東北林業(yè)大學(xué)花卉生物工程研究所（45°72′53″N，126°62′92″E）。分別用來自S45S45株系和自身（S13-bS13-b）的花粉對去雄后的S13-bS13-b株系成熟柱頭進(jìn)行親和及不親和授粉，收集親和及不親和授粉后0、30、60 min的雌蕊，同時(shí)采集S13-bS13-b株系萼片、花瓣、柱頭、花柱及子房等樣本，隨后用液氮立即冷凍樣本，于冰箱中-80 ℃存儲。

1.2 羽衣甘藍(lán)BoFER基因克隆

根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫提供的甘藍(lán)基因組序列，設(shè)計(jì)BoFER基因的CDS 序列特異性引物BoFERCDS-F 和BoFER-CDS-R，用于BoFER基因CDS 區(qū)的克隆。在BoFER 激酶結(jié)構(gòu)域（KD）序列兩端設(shè)計(jì)特異性引物BoFER-KD-F 和BoFER-KD-R，用于BoFER 激酶域的克隆，引物均由華大基因合成（見表1）。通過E.Z.N.A.? Plant RNA Kit（OMEGA）試劑盒提取S13-bS13-b柱頭總RNA，利用TranScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super-Mix（TransGen）試劑盒獲得柱頭cDNA。參考李陽等［38］的方法進(jìn)行載體構(gòu)建，利用LATaqDNA 聚合酶（TaKaRa）克隆基因，使用E.Z.N.A.?Gel Extraction Kit（OMEGA）試劑盒回收PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，并將回收產(chǎn)物連接到pMD19-T 載體連接，熱激法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α中，涂于相應(yīng)抗性平板上，挑取單克隆，進(jìn)行菌液PCR，符合目的片段大小的菌液送至華大基因進(jìn)行測序，利用TIANprep Mini Plasmid Kit（TIANGEN）試劑盒提取測序結(jié)果正確的菌液質(zhì)粒。

表1 引物信息Table 1 Primer sequences information

1.3 BoFER的生物信息學(xué)分析

參照栗赫銘等［39］提供的生物信息學(xué)方法，通過ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測蛋白分子量及理論等電點(diǎn)等。使用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）進(jìn) 行 結(jié) 構(gòu) 域 分析。通過NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行氨基酸序列分析。

1.4 qRT-PCR表達(dá)分析

利用E.Z.N.A.? Plant RNA Kit（OMEGA）試劑盒提取親和及不親和授粉后不同時(shí)間雌蕊，以及S13-bS13-b株系雄蕊、花萼、花瓣、柱頭、花柱及子房總RNA，使用TranScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（TransGen）合成cDNA。參照李晗等［40］的方法進(jìn)行qRT-PCR，使用Trans-Start?Top Green qPCR SuperMix（TRANS）試劑盒配制20 μL 反應(yīng)體系如下：TransStart Top Green qPCR SuperMix（2X） 10 μL，cDNA 1 μL，BoFER基因上游特異性引物0.4 μL，下游特異性引物0.4 μL（引物序列見表1），ddH2O 8.2 μL，通過LightCyker480Ⅱ（Roche）儀器進(jìn)行目的基因qRT-PCR 分析，程序設(shè)置：94 ℃預(yù)變性 30 s，94 ℃變性5 s，58 ℃退火30 s，40 個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束后采集熒光信號，所有循環(huán)結(jié)束后繪制熔解曲線。每個(gè)樣品進(jìn)行3 次技術(shù)重復(fù)。BoACTIN基因作為內(nèi)參基因［41］，通過比值分析方法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。

1.5 BoFER相互作用蛋白分析

將BoFER-KD 的序列構(gòu)建到pGADT7（激活域，AD）表達(dá)載體上（見表1）。將BoSRK13-b-KD、Bo-MLPK 及Bo-ARC1 的ORF 序 列 構(gòu) 建 到pGBKT7（DNA 結(jié)合域，BD）表達(dá)載體上，根據(jù)酵母轉(zhuǎn)化手冊將重組的AD 和BD 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到酵母菌株Y2HGold 中，共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒組合（見表2）。將酵母轉(zhuǎn)化子涂布到SD/-Leu-Trp 缺陷型平板上進(jìn)行培養(yǎng)2～3 d。挑取單個(gè)酵母菌落加入到含5 mL SD/-Leu-Trp 缺陷型液體培養(yǎng)基中，220 r·min-1培養(yǎng)1 d 后，取5 μL 培養(yǎng)液滴加在SD/-Leu-Trp 和SD/-Leu-Trp-His+x-α-gal 缺陷型平板上進(jìn)行培養(yǎng)。利用含有3-氨基-1，2，4-三唑（3-AT）的SD/-Leu-Trp-His缺陷型平板對自激活試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

表2 BoFER酵母共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒組合Table 2 Combination of BoFER yeast co-transformation plasmids

2 結(jié)果與分析

2.1 BoFER基因的克隆

以羽衣甘藍(lán)S13-bS13-b株系柱頭cDNA 為模板，通過RT-PCR 克隆得到BoFER（見圖1），通過測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)BoFER大小為2 682 bp，編碼893 個(gè)氨基酸（見圖2）。BoFER蛋白分子質(zhì)量大小為97.25 kDa，等電點(diǎn)為5.89。通過SMART 數(shù)據(jù)庫分析，BoFER蛋白結(jié)構(gòu)域主要由信號肽區(qū)域、Malectin-like 區(qū)域、跨膜螺旋區(qū)域、Ser/Thr激酶結(jié)構(gòu)域及低成分復(fù)雜區(qū)組成（見圖3）。從NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索出油菜（Brassica napus）、白菜（B.rapa）、擬南芥的FER 氨基酸序列，與BoFER 進(jìn)行序列相似度分析發(fā)現(xiàn)，與油菜BnFER 序列相似度達(dá)98.5%，與白菜BrFER序列相似度達(dá)96.5%，與擬南芥AtFER序列相似度達(dá)81.3%，且BoFER 激酶結(jié)構(gòu)域及Ser/Thr 激酶結(jié)合位點(diǎn)高度保守（見圖4）。

圖1 羽衣甘藍(lán)BoFER的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Results of RT-PCR amplification product of BoFER

圖2 BoFER核苷酸及氨基酸序列Fig.2 The nucleotide and amino acid sequences of BoFER

2.2 BoFER基因的組織特異性表達(dá)分析

對羽衣甘藍(lán)S13-bS13-b株系的萼片、花瓣、花藥、柱頭、花柱及子房中的BoFER的表達(dá)量進(jìn)行qRTPCR 分析。結(jié)果表明，BoFER在被測組織中均有表達(dá)，在柱頭中表達(dá)水平最高，顯著高于在其他被測組織中的表達(dá)水平，在花藥中表達(dá)水平最低（見圖5）。

圖5 BoFER在花器官中表達(dá)分析***.P＜0.001.Fig.5 BoFER expression analysis in floral organ

2.3 BoFER 基因在親和及不親和授粉過程中的表達(dá)模式分析

對S13-bS13-b株系進(jìn)行親和及不親和授粉，選取親和及不親和授粉后0、30、60 min 的雌蕊，對BoFER的表達(dá)量進(jìn)行qRT-PCR 分析。結(jié)果表明，BoFER在親和及不親和授粉后的各檢測時(shí)間點(diǎn)均有表達(dá)，在不親和授粉后表達(dá)水平逐漸升高，在不親和授粉后60 min 表達(dá)水平達(dá)到最高（見圖6A），BoFER在親和授粉后表達(dá)水平逐漸下降，在親和授粉后60 min表達(dá)水平達(dá)到最低（見圖6B）。

2.4 BoFER相互作用蛋白鑒定

利用酵母雙雜交分析FER 激酶結(jié)構(gòu)域（BoFER-KD）與十字花科植物中自交不親和相關(guān)因子的相互作用，構(gòu)建酵母表達(dá)載體pGADT7-BoFER-KD 與pGBKT7-SRK13-b-KD、pGBKT7-MLPK及pGBKT7-ARC1。將被檢測質(zhì)粒組合pGADT7-BoFER-KD 與pGBKT7-SRK13-b-KD、pGBKT7-MLPK及pGBKT7-ARC1 分別共轉(zhuǎn)化至Y2HGold 酵母感受態(tài)細(xì)胞中，通過SD/-Trp-Leu 和SD/-Trp-Leu-His+x-α-gal+3mM 3-AT 缺陷型培養(yǎng)基平板中菌落生長狀態(tài)，鑒定目的蛋白間相互作用情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在SD/-Trp-Leu二缺平板上，陽性對照、陰性對照以及共轉(zhuǎn)化酵母生長良好，在SD/-Trp-Leu-His+x-αgal+3mM 3-AT 缺陷型培養(yǎng)基平板中，陽性對照生長且變藍(lán)，陰性對照沒有生長，pGADT7-BoFERKD 與pGBKT7-SRK13-b-KD 的組合生長且變藍(lán)，pGADT7-BoFER-KD 與pGBKT7-MLPK 和pGBKT7-ARC1 的組合沒有生長（見圖7）。這些結(jié)果表明，BoFER-KD 與BoSRK13-b-KD 存在相互作用，BoFERKD與BoMLPK、BoARC1不存在相互作用。

圖7 BoFER與BoSRK相互作用分析Fig.7 Protein interaction analysis between BoFER and BoSRK

3 討論

本研究從羽衣甘藍(lán)自交不親和系（S13-bS13-b）中分離出BoFER基因。其開放閱讀框大小為2 682 bp，編碼含有893 個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。BoFER 蛋白由信號肽結(jié)構(gòu)域、Malectin-like 結(jié)構(gòu)域、跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域、Ser/Thr 激酶結(jié)構(gòu)域及低成分復(fù)雜區(qū)組成。對BoFER 氨基酸序列進(jìn)行比對分析發(fā)現(xiàn)，與油菜BnFER 序列相似度達(dá)98.5%，與白菜BrFER序列相似度達(dá)96.5%，與擬南芥AtFER序列相似度81.3%，這表明BoFER序列高度保守。

分析羽衣甘藍(lán)BoFER的組織表達(dá)特性發(fā)現(xiàn)其在萼片、花瓣、花藥、柱頭、花柱及子房組織中均有表達(dá)，且在柱頭中的表達(dá)量要顯著高于在其他花器官中的表達(dá)量，這個(gè)結(jié)果表明BoFER可能在柱頭中發(fā)揮著重要作用。Duan等［34］發(fā)現(xiàn)擬南芥FER是花粉管穿透柱頭乳突細(xì)胞，最終進(jìn)入配子體完成生殖過程的重要調(diào)控因子。本研究進(jìn)一步對羽衣甘藍(lán)BoFER在授粉過程中的表達(dá)模式進(jìn)行研究，結(jié)果顯示BoFER在親和及不親和授粉后的各時(shí)間點(diǎn)均有表達(dá)，在不親和授粉后表達(dá)水平逐漸升高，而在親和授粉后其表達(dá)水平逐漸下降，表明BoFER可能在羽衣甘藍(lán)親和授粉及不親和授粉中發(fā)揮作用。Zhang 等［6］研究發(fā)現(xiàn)，在白菜中，對BrFER的研究也有類似的表達(dá)特性，BrFER的表達(dá)水平下降，能夠打破自交不親和反應(yīng)，促進(jìn)親和授粉花粉管的生長。說明BoFER可能在授粉中發(fā)揮重要作用。

為了進(jìn)一步研究BoFER 在自交不親和中的作用，通過酵母雙雜交技術(shù)研究了BoFER-KD 與已知自交不親和相關(guān)因子的相互作用關(guān)系，發(fā)現(xiàn)BoFER-KD 與BoMLPK、BoARC1 不存在相互作用，與BoSRK13-b-KD 存在相互作用，表明BoFER 可能通過與BoSRK13-b的相互作用來參與自交不親和反應(yīng)。在白菜中也發(fā)現(xiàn)了BrFER1-KD與BrSRK46-KD的相互作用關(guān)系，BrSRK 通過招募BrFER，增加柱頭中ROS 含量，排斥自身花粉，也排斥種間花粉［37］。

本研究中對羽衣甘藍(lán)BoFER基因進(jìn)行克隆，序列分析及蛋白結(jié)構(gòu)分析，同時(shí)分析了該基因的組織表達(dá)特異性和在授粉過程中的表達(dá)模式，并通過酵母雙雜交鑒定BoFER 與其他自交不親和相關(guān)因子的相互作用。不僅豐富了對蕓薹屬植物BoFER 的認(rèn)識，而且為進(jìn)一步探討B(tài)oFER 與BoSRK13-b間的相互作用以及BoFER 的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。這將為更好地開發(fā)植物授粉過程所依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑提供線索，為未來作物育種提供重要的分子育種策略。