王科江 李雪森 （西南醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)學(xué)研究所，瀘州 646000）

乳腺癌是全球范圍內(nèi)高度流行的癌癥。過去二十年，早期診斷工具和治療方法進(jìn)步使乳腺癌病死率與1990年相比降低了1/3［1-2］。但乳腺癌仍是女性患者癌癥死亡的主要原因，威脅全球婦女的健康。越來越多的證據(jù)表明乳腺癌具有高度異質(zhì)性，局部腫瘤微環(huán)境對腫瘤發(fā)展至關(guān)重要，包括乳腺癌起始、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移及耐藥［3］。

細(xì)胞衰老是衰老的關(guān)鍵過程之一，是衰老與癌癥間的紐帶［4］。衰老與腫瘤的聯(lián)系復(fù)雜，目前知之甚少。細(xì)胞衰老在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中具有“雙刃劍”作用。一方面，衰老細(xì)胞進(jìn)入永久性細(xì)胞周期停滯的背景下，衰老確保組織動(dòng)態(tài)平衡并防止腫瘤發(fā)生［5-6］。另一方面，衰老細(xì)胞通過促進(jìn)多種類型免疫抑制細(xì)胞積累及各種炎癥相關(guān)信號(hào)分子和細(xì)胞因子激活改變腫瘤微環(huán)境，廣泛影響腫瘤微環(huán)境和腫瘤生長［7-8］。值得注意的是，衰老和細(xì)胞衰老可改變免疫細(xì)胞健康狀況，并最終影響癌癥治療效果，尤其是免疫治療。但細(xì)胞衰老與腫瘤微環(huán)境的關(guān)系尚不清楚，細(xì)胞衰老相關(guān)基因在評價(jià)乳腺癌免疫浸潤和臨床預(yù)后方面的價(jià)值有待進(jìn)一步研究。

為系統(tǒng)評估乳腺癌患者細(xì)胞衰老與預(yù)后的相關(guān)性，本研究建立了基于細(xì)胞衰老相關(guān)基因的新風(fēng)險(xiǎn)模型，并探討了其作為預(yù)測預(yù)后生物標(biāo)志物的潛在重要性，基于細(xì)胞衰老相關(guān)特征深入分析了風(fēng)險(xiǎn)亞群、免疫檢查點(diǎn)和免疫細(xì)胞滲透間的關(guān)系，為乳腺癌免疫治療策略及細(xì)胞衰老調(diào)控機(jī)制提供了新的見解。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源與下載 從TCGA網(wǎng)站（https：//portal.gdc.cancer.gov/）下載乳腺癌RNA-seq轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和相關(guān)臨床信息，對mRNA count數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，將標(biāo)準(zhǔn)化的count數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為TPM，進(jìn)一步對TPM數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og2對數(shù)轉(zhuǎn)化用于后續(xù)分析。將表達(dá)數(shù)據(jù)與臨床數(shù)據(jù)相匹配，去除重復(fù)樣本，共113例正常樣本和1 050例腫瘤樣本納入分析（表1），從GEO數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載并整理具有預(yù)后信息的327例乳腺癌患者隊(duì)列（GSE20685）作為外部驗(yàn)證集。細(xì)胞衰老相關(guān)基因來自CellAge數(shù)據(jù)庫（https：//genomics.senescence.info/cells/），該數(shù)據(jù)庫收錄了278個(gè)經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的細(xì)胞衰老相關(guān)基因。

表1 TCGA-BRCA隊(duì)列臨床信息基線資料Tab.1 Baseline clinical information of TCGA-BRCA cohort

1.2 差異顯著的細(xì)胞衰老相關(guān)基因鑒定及富集分析 R軟件“DEseq2”包鑒別差異表達(dá)的細(xì)胞衰老相關(guān)基因［9］，cut-off值設(shè)為|log2FC|＞1，Padj＜0.05，利用R軟件“clusterProfiler”包對差異表達(dá)的細(xì)胞衰老相關(guān)基因進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析［10］。

1.3 細(xì)胞衰老相關(guān)基因預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型構(gòu)建及外部數(shù)據(jù)集驗(yàn)證 TCGA中1 050個(gè)乳腺癌患者樣本作為訓(xùn)練集，采用單因素Cox回歸分析評估TCGA中差異表達(dá)的細(xì)胞衰老相關(guān)基因與患者總生存期（OS）的關(guān)系，篩選P＜0.05的所有基因進(jìn)行進(jìn)一步分析。采用LASSO分析選擇OS相關(guān)的最佳預(yù)后基因。通過多因素Cox回歸分析得到最優(yōu)模型，計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)評分，風(fēng)險(xiǎn)評分=基因表達(dá)量1×Coef1+基因表達(dá)量2×Coef2+……+基因表達(dá)量n×Coefn（Coef：基因在多因素Cox回歸分析中的回歸系數(shù)，n：預(yù)后相關(guān)細(xì)胞衰老相關(guān)基因總數(shù)）。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評分中位值將患者分為高、低風(fēng)險(xiǎn)組。將GSE20685的327個(gè)乳腺癌患者隊(duì)列作為外部驗(yàn)證集，將基因表達(dá)數(shù)據(jù)帶入TCGA訓(xùn)練集風(fēng)險(xiǎn)評分公式計(jì)算各樣本風(fēng)險(xiǎn)評分進(jìn)行驗(yàn)證。利用“survival”“survminer”“pheatmap”包繪制TCGA訓(xùn)練集和GSE20685外部驗(yàn)證集風(fēng)險(xiǎn)評分曲線圖、風(fēng)險(xiǎn)評分散點(diǎn)圖、生存曲線圖、高低風(fēng)險(xiǎn)評分組細(xì)胞衰老相關(guān)基因表達(dá)熱圖。

1.4 預(yù)后模型性能評估 在TCGA隊(duì)列中對風(fēng)險(xiǎn)評分和相關(guān)臨床參數(shù)進(jìn)行單因素和多因素Cox回歸分析，確定風(fēng)險(xiǎn)評分和相關(guān)臨床參數(shù)是否可作為乳腺癌患者OS的獨(dú)立預(yù)測因子。納入臨床病理參數(shù)和風(fēng)險(xiǎn)評分利用R軟件“regplot”包生成預(yù)后列線圖預(yù)測TCGA中乳腺癌患者一年、三年和五年OS，并采用校準(zhǔn)曲線驗(yàn)證預(yù)測的生存概率與實(shí)際觀察結(jié)果的吻合度。采用ROC曲線評價(jià)風(fēng)險(xiǎn)評分及相關(guān)臨床參數(shù)預(yù)測率。

1.5 GSEA基因集富集分析 GSEA可通過將預(yù)定義的基因集與特定表型進(jìn)行比對找出預(yù)定義基因集相關(guān)表型。根據(jù)細(xì)胞衰老關(guān)鍵預(yù)后基因風(fēng)險(xiǎn)評分中位值進(jìn)行分組，并與C2.CP.KEGG.v7.2基因集、Hallmark Gene Sets（癌癥特征基因集合）基因集進(jìn)行比對，C2.CP.KEGG.v7.2基因集和Hallmark收集自分子簽名數(shù)據(jù)庫（MSigDB），利用R軟件“clusterProfiler”包進(jìn)行分析［10］，探索細(xì)胞衰老關(guān)鍵預(yù)后基因在乳腺癌中可能的作用機(jī)制。顯著富集的基因集符合以下標(biāo)準(zhǔn)：P＜0.05，F(xiàn)DRq＜0.25。

1.6 免疫微環(huán)境及免疫細(xì)胞浸潤分析 利用“CIBERSORT”包反卷積算法評估所有TCGA乳腺癌病例中免疫細(xì)胞浸潤比例，并繪制免疫細(xì)胞浸潤比例豐度圖和22種免疫細(xì)胞相關(guān)性熱圖［11］。根據(jù)細(xì)胞衰老關(guān)鍵預(yù)后基因風(fēng)險(xiǎn)評分中位值進(jìn)行分組，評估22種免疫細(xì)胞在高、低風(fēng)險(xiǎn)組的浸潤比例和免疫檢查點(diǎn)基因表達(dá)。利用“ESTIMATAE”包進(jìn)行免疫微環(huán)境分析，計(jì)算免疫評分，評估風(fēng)險(xiǎn)評分與免疫微環(huán)境的關(guān)系［12］。

1.7 體細(xì)胞突變分析 體細(xì)胞突變數(shù)據(jù)來源于TCGA（https：//portal.gdc.cancer.gov/），數(shù)據(jù)類型為“Masked_Somatic_Mutation”，利用“maftools”包分析TCGA體細(xì)胞突變數(shù)據(jù)［13］，計(jì)算基因突變頻率。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有統(tǒng)計(jì)分析和數(shù)據(jù)繪圖均采用R軟件（4.1.2）進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫中差異表達(dá)的細(xì)胞衰老相關(guān)基因鑒定及差異表達(dá)基因功能富集分析 278個(gè)細(xì)胞衰老相關(guān)基因中有68個(gè)基因在腫瘤組織和正常樣本中的表達(dá)存在顯著差異，其中36個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，32個(gè)基因表達(dá)下調(diào)（圖1A、B）。通過功能富集分析探討上述68個(gè)細(xì)胞衰老差異表達(dá)基因在TCGA-BRCA隊(duì)列中的生物學(xué)功能和顯著富集通路，GO及KEGG富集分析結(jié)果顯示，差異基因顯著富集于細(xì)胞周期、細(xì)胞衰老相關(guān)信號(hào)通路及生物學(xué)進(jìn)程（圖1C、D）。

圖1 細(xì)胞衰老相關(guān)基因差異分析及GO/KEGG富集分析Fig.1 Difference analysis of senescence related genes and GO/KEGG enrichment analysis

2.2 細(xì)胞衰老相關(guān)基因預(yù)后模型構(gòu)建及驗(yàn)證 在TCGA隊(duì)列中對上述68個(gè)細(xì)胞衰老差異基因進(jìn)行單因素Cox回歸分析，結(jié)果顯示8個(gè)基因與乳腺癌患者OS相關(guān)（P＜0.05，圖2A）。為避免過度擬合，對8個(gè)有預(yù)后價(jià)值的基因進(jìn)行LASSO回歸（圖2B、C），對LASSO回歸確定的7個(gè)預(yù)后相關(guān)基因進(jìn)行多因素Cox回歸，確定了WT1、IFNG、TP63、IGFBP6、CPEB1 5個(gè)細(xì)胞衰老關(guān)鍵預(yù)后基因的最佳預(yù)后模型，風(fēng)險(xiǎn)評分=WT1×0.162 094+IFGN×（-0.320 910）+TP63×（-0.120 800）+IGFBP6×（-0.141 510）+CPEB1×0.385 455，預(yù)后模型森林圖如圖2D所示。根據(jù)中位風(fēng)險(xiǎn)評分將患者分為高、低風(fēng)險(xiǎn)組，風(fēng)險(xiǎn)評分散點(diǎn)圖、風(fēng)險(xiǎn)評分曲線圖顯示隨著風(fēng)險(xiǎn)評分升高，相同時(shí)間點(diǎn)患者死亡率越高（圖3A、B），熱圖展示了5個(gè)基因在高、低風(fēng)險(xiǎn)組的表達(dá)（圖3C），生存曲線顯示高風(fēng)險(xiǎn)組預(yù)后較差（圖3D）。為驗(yàn)證預(yù)后模型，對來自GEO數(shù)據(jù)庫的GSE20685乳腺癌隊(duì)列按照與TCGA隊(duì)列相同的風(fēng)險(xiǎn)評分計(jì)算公式計(jì)算各樣本風(fēng)險(xiǎn)評分，根據(jù)TCGA隊(duì)列中位評分將GSE20685驗(yàn)證隊(duì)列分為高、低風(fēng)險(xiǎn)組，結(jié)果顯示構(gòu)建的模型具有普適性，在GSE20685隊(duì)列中得到了驗(yàn)證（圖3E～H）。

圖2 細(xì)胞衰老相關(guān)基因預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型構(gòu)建Fig.2 Construction of a prognostic risk model for cell senescence related genes

圖3 TCGA訓(xùn)練集和GSE20685外部驗(yàn)證集高、低風(fēng)險(xiǎn)評分組患者基因表達(dá)及生存狀態(tài)評估Fig.3 Evaluation of gene expression and survival status of patients in TCGA training set and GSE20685 external validation set with high and low risk score

2.3 預(yù)后模型性能評估及列線圖建立 為進(jìn)一步驗(yàn)證預(yù)后模型的準(zhǔn)確性，研究風(fēng)險(xiǎn)評分是否可作為TCGA-BRCA隊(duì)列的OS獨(dú)立預(yù)后因素，對臨床特征和風(fēng)險(xiǎn)評分進(jìn)行單因素Cox回歸分析和多因素Cox回歸分析，結(jié)果顯示僅風(fēng)險(xiǎn)評分、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期（N_stage）在單因素Cox回歸分析和多因素回歸分析中均為獨(dú)立預(yù)后因素（P＜0.001，圖4A、B）。納入風(fēng)險(xiǎn)評分、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期3個(gè)獨(dú)立預(yù)后因子構(gòu)建預(yù)后列線圖（圖4C），校準(zhǔn)曲線提示該列線圖預(yù)測生存率與隊(duì)列實(shí)際生存率擬合度較好（圖4D）。繪制多重ROC曲線比較風(fēng)險(xiǎn)評分和臨床參數(shù)預(yù)測患者預(yù)后準(zhǔn)確率，結(jié)果顯示，風(fēng)險(xiǎn)評分具有較好的預(yù)測能力（圖4E）。

圖4 預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評分模型的獨(dú)立預(yù)后價(jià)值Fig.4 Independent prognostic value of prognostic risk score model

2.4 GSEA富集分析 為進(jìn)一步探討風(fēng)險(xiǎn)模型分類亞組間基因功能和通路差異，根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評分中位值將患者分為高、低風(fēng)險(xiǎn)組進(jìn)行GSEA富集分析，選擇顯著富集的前10個(gè)基因集進(jìn)行展示，結(jié)果顯示腫瘤免疫相關(guān)特征基因集和信號(hào)通路在高風(fēng)險(xiǎn)組中顯著下調(diào)，如KEGG數(shù)據(jù)集中的抗原加工與呈遞、趨化因子信號(hào)通路、細(xì)胞因子及細(xì)胞因子受體相互作用（圖5A），Hallmark基因集（癌癥特征基因集合）中的IL2_STAT5信號(hào)通路、IL6_JAK_STAT3信號(hào)通路，提示高風(fēng)險(xiǎn)患者可能處于免疫抑制狀態(tài)（圖5B）。

圖5 風(fēng)險(xiǎn)得分相關(guān)基因顯著富集于腫瘤免疫相關(guān)通路Fig.5 Genes related to risk score were significantly enriched in tumor immune-related pathways

2.5 高、低風(fēng)險(xiǎn)患者免疫微環(huán)境分析 基于GSEA分析結(jié)果推測高、低風(fēng)險(xiǎn)患者腫瘤免疫微環(huán)境可能存在差異。應(yīng)用CIBERSORT反卷積算法進(jìn)一步確認(rèn)風(fēng)險(xiǎn)評分與免疫成分的關(guān)系，構(gòu)建乳腺癌患者22種免疫細(xì)胞豐度圖（圖6A），分析22種免疫細(xì)胞的相關(guān)性（圖6B）。進(jìn)一步分析高風(fēng)險(xiǎn)患者和低風(fēng)險(xiǎn)患者22種免疫細(xì)胞浸潤比例，結(jié)果顯示CD8 T細(xì)胞、M0巨噬細(xì)胞、M1巨噬細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞比例存在顯著差異（P＜0.001，圖6C）。產(chǎn)生活性氧的M1巨噬細(xì)胞是腫瘤生長抑制因子，而產(chǎn)生IL-10和TGF-β的M2巨噬細(xì)胞可促進(jìn)腫瘤生長［14］。許多腫瘤中，如結(jié)直腸癌、乳腺癌、卵巢癌或膀胱癌，CD8 T細(xì)胞浸潤是很好的預(yù)后標(biāo)志［15］。值得注意的是，本研究中高風(fēng)險(xiǎn)患者M(jìn)2巨噬細(xì)胞顯著多于低風(fēng)險(xiǎn)患者，CD8 T細(xì)胞、M1巨噬細(xì)胞顯著少于低風(fēng)險(xiǎn)患者（P＜0.001，圖6C），表明基于風(fēng)險(xiǎn)評分對乳腺癌患者進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分層得到的結(jié)果與既往研究相符，風(fēng)險(xiǎn)評分可作為提示腫瘤微環(huán)境免疫細(xì)胞浸潤和預(yù)測患者預(yù)后的指標(biāo)。為評估高、低風(fēng)險(xiǎn)患者對免疫治療的影響，探討風(fēng)險(xiǎn)評分與公認(rèn)的免疫檢查點(diǎn)基因的相關(guān)性，結(jié)果顯示低風(fēng)險(xiǎn)患者PDCD1、CD274、CTLA4、CD86、LAG3、HAVCR2、TIGIT表達(dá)高于高風(fēng)險(xiǎn)患者（圖6D）；提示低風(fēng)險(xiǎn)患者免疫檢查點(diǎn)基因表達(dá)高于高風(fēng)險(xiǎn)患者，低風(fēng)險(xiǎn)患者可能有更好的免疫治療反應(yīng)。進(jìn)一步利用R軟件包ESTIMATE根據(jù)基因表達(dá)計(jì)算各腫瘤中各患者免疫評分，比較高、低風(fēng)險(xiǎn)組免疫評分差異及風(fēng)險(xiǎn)評分與免疫評分的相關(guān)性，結(jié)果顯示高風(fēng)險(xiǎn)組免疫評分顯著低于低風(fēng)險(xiǎn)患者，且風(fēng)險(xiǎn)評分與免疫評分呈負(fù)相關(guān)（圖6E、F）。提示高風(fēng)險(xiǎn)患者腫瘤微環(huán)境傾向于免疫抑制狀態(tài)，隨著風(fēng)險(xiǎn)評分升高免疫評分降低，同時(shí)高風(fēng)險(xiǎn)患者伴隨促腫瘤生長的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞高度浸潤及免疫檢查點(diǎn)基因表達(dá)顯著降低，可能影響高風(fēng)險(xiǎn)患者免疫治療應(yīng)答，尤其是免疫檢查點(diǎn)抑制劑。

圖6 高、低風(fēng)險(xiǎn)患者免疫微環(huán)境分析Fig.6 Analysis of immune microenvironment in patients with high and low risk

2.6 高、低風(fēng)險(xiǎn)患者基因組突變分析 結(jié)果展示了高、低風(fēng)險(xiǎn)亞組前30個(gè)高頻突變基因，高風(fēng)險(xiǎn)組460個(gè)樣本中420個(gè)樣本發(fā)生了突變（91.3%），低風(fēng)險(xiǎn)組466個(gè)樣本中422個(gè)樣本發(fā)生了突變（90.56%），其中高風(fēng)險(xiǎn)患者抑癌基因TP53突變頻率（38.00%）高于低風(fēng)險(xiǎn)（31.00%，圖7A、B紅框部分）。為進(jìn)一步說明TP53基因在兩組隊(duì)列中的突變差異，使用“Maftool”包的“mafCompare”函數(shù)比較兩組間TP53差異突變情況，該函數(shù)對兩個(gè)隊(duì)列生成的2×2關(guān)聯(lián)表進(jìn)行fisher檢驗(yàn)，找出差異突變基因，高風(fēng)險(xiǎn)組中TP53基因173個(gè)樣本發(fā)生了突變，低風(fēng)險(xiǎn)組中143個(gè)樣本發(fā)生了突變，OR＜1（OR=0.735）且P＜0.05（P=0.027），表明高風(fēng)險(xiǎn)患者抑癌基因TP53突變頻率更高。

圖7 高低風(fēng)險(xiǎn)亞組基因突變瀑布圖Fig.7 Waterfall map high and low risk subgroups

3 討論

乳腺癌是世界最常見的惡性腫瘤，據(jù)最近癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，乳腺癌占所有新診斷惡性腫瘤的30%以上，盡管乳腺癌在診斷、手術(shù)和藥物開發(fā)方面取得了一定進(jìn)展，但治療反應(yīng)不充分及復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，乳腺癌治療仍面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)［16］。此外，多數(shù)治療方法均針對癌細(xì)胞開發(fā)，忽略了腫瘤微環(huán)境周圍的非癌癥成分，導(dǎo)致反應(yīng)結(jié)果較差，腫瘤微環(huán)境包括各種非惡性細(xì)胞和非細(xì)胞成分，包括免疫系統(tǒng)成分、血細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和間質(zhì)成分，可能以不同方式改變腫瘤行為［17］。衰老是一個(gè)復(fù)雜的生物過程，具有細(xì)胞自主性和旁分泌效應(yīng)，對腫瘤微環(huán)境有重大影響［7］。但乳腺癌中衰老細(xì)胞如何與腫瘤免疫細(xì)胞相互作用及其在評估腫瘤免疫浸潤性和臨床預(yù)后方面的價(jià)值尚未見報(bào)道。

本研究分析了乳腺癌中細(xì)胞衰老相關(guān)基因的表達(dá)模式、預(yù)后價(jià)值及對腫瘤免疫微環(huán)境的影響，使用LASSO-Cox構(gòu)建了新的基于TCGA數(shù)據(jù)集中5個(gè)衰老特征表達(dá)的生存預(yù)測模型，該模型在GEO數(shù)據(jù)庫的公開數(shù)據(jù)集GSE20685得到了很好的驗(yàn)證。值得注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)單因素及多因素Cox回歸提示風(fēng)險(xiǎn)評分是乳腺癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素，根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評分中位值分組的高、低風(fēng)險(xiǎn)患者免疫狀態(tài)具有高度異質(zhì)性，高風(fēng)險(xiǎn)患者伴隨促腫瘤生長的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞高度浸潤以及免疫檢查點(diǎn)基因表達(dá)顯著降低，具有良好預(yù)后提示的CD8 T細(xì)胞浸潤豐度降低，且高風(fēng)險(xiǎn)患者基于ESITIMATE算法得出的免疫評分顯著低于低風(fēng)險(xiǎn)患者。提示細(xì)胞衰老相關(guān)基因預(yù)測模型指導(dǎo)乳腺癌患者預(yù)后具有積極作用，可與特異性免疫檢查點(diǎn)因子或腫瘤微環(huán)境聯(lián)合作為預(yù)測免疫檢查點(diǎn)抑制劑反應(yīng)的生物標(biāo)志物。

本研究模型中共納入5個(gè)細(xì)胞衰老相關(guān)基因：WT1、IFNG、TP63、IGFBP6、CPEB1。研究發(fā)現(xiàn)，原癌基因KRAS誘導(dǎo)的腫瘤模型中，WT1的RNA干擾顯著降低了腫瘤負(fù)擔(dān)，誘導(dǎo)了細(xì)胞衰老，并抑制了腫瘤細(xì)胞增殖［18］。WT1還通過調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白活性影響細(xì)胞骨架重排，參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，提示W(wǎng)T1在癌細(xì)胞侵襲和遷移中可能發(fā)揮作用［19］。IFNG屬于Ⅱ型干擾素家族成員，由免疫細(xì)胞如T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生，通過激活效應(yīng)免疫細(xì)胞和增強(qiáng)抗原呈遞，在抗菌、抗病毒和抗腫瘤反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［20］。臨床研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中TNF和IFNG均受到抑制，復(fù)發(fā)性結(jié)直腸癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞IFNG表達(dá)降低［21］。TP63作為TP53、TP63和TP73家族基因成員之一，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期停滯、衰老、代謝重編程和干細(xì)胞維持方面發(fā)揮重要作用［22］。此外，TP63的兩個(gè)亞型TAp63和DNp63在干細(xì)胞維持、腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮不同調(diào)節(jié)作用［23］。研究發(fā)現(xiàn)TAp63在13個(gè)腫瘤發(fā)展特征中始終表現(xiàn)出腫瘤抑制模式，而DNp63在腫瘤發(fā)生發(fā)展中作為腫瘤抑制基因或癌基因具有雙重作用［24］。IGFBP6是一種IGF結(jié)合蛋白，可延長IGF半衰期，并可抑制或刺激IGF在細(xì)胞培養(yǎng)中的促生長作用，IGFBP6可能在結(jié)腸癌發(fā)展過程中作為一種抑癌基因，低表達(dá)IGFBP6可作為結(jié)腸癌的獨(dú)立預(yù)后生物標(biāo)志物［25］。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)對TMZ（替莫唑胺）敏感的膠質(zhì)瘤細(xì)胞分泌的IGFBP6驅(qū)動(dòng)旁分泌機(jī)制在體內(nèi)外抑制表達(dá)IGF1-R的TMZ耐藥細(xì)胞增殖，耐TMZ膠質(zhì)瘤細(xì)胞中IGFBP6過表達(dá)延長了生存期［26］。CEBP1是編碼胞質(zhì)多聚腺苷酸化元件結(jié)合蛋白家族成員，研究發(fā)現(xiàn)CPEB1是腫瘤細(xì)胞（Hela）進(jìn)入M期和細(xì)胞增殖所必需的，單獨(dú)去除其家族成員CPEB4對細(xì)胞周期的影響很小，但CPEB4與CPEB1共同耗盡時(shí)可觀察到對細(xì)胞增殖的協(xié)同抑制［27］。相反的是，研究發(fā)現(xiàn)CPEB1表達(dá)下調(diào)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和細(xì)胞周期進(jìn)展，且CPEB1通過介導(dǎo)SIRT1/SOX2通路調(diào)控乳腺癌發(fā)生［28］，但CPEB1也能在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮促增殖作用，前提是CPEB1首先在原代細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞衰老［29］，提示CPEB1在腫瘤中的調(diào)控作用可能與衰老微環(huán)境相關(guān)。進(jìn)一步證實(shí)細(xì)胞衰老相關(guān)基因在腫瘤中的調(diào)控是雙向的，發(fā)揮抑癌或促癌作用的關(guān)鍵可能取決于腫瘤微環(huán)境差異。

另外，本研究雖提供了一定理論基礎(chǔ)和研究參考，但也存在一定局限性。利用公共數(shù)據(jù)庫的回顧性數(shù)據(jù)對現(xiàn)有模型進(jìn)行開發(fā)和驗(yàn)證，尚需更多前瞻性研究數(shù)據(jù)驗(yàn)證其臨床應(yīng)用，上述發(fā)現(xiàn)還需進(jìn)一步研究證實(shí)。其次，這些細(xì)胞衰老關(guān)鍵預(yù)后基因在預(yù)后模型中調(diào)節(jié)乳腺癌進(jìn)程的潛在機(jī)制尚不清楚，其生物學(xué)功能需進(jìn)一步探索。最后，由于細(xì)胞衰老在癌癥中的作用很大程度上被忽視，因此更廣泛地了解癌癥、衰老和免疫環(huán)境間的聯(lián)系非常重要。本研究確定并驗(yàn)證了基于5個(gè)細(xì)胞衰老相關(guān)基因的細(xì)胞衰老相關(guān)信號(hào)，作為免疫細(xì)胞浸潤指標(biāo)對乳腺癌具有獨(dú)立預(yù)后價(jià)值。因此，識(shí)別影響腫瘤免疫應(yīng)答的細(xì)胞衰老相關(guān)基因并進(jìn)一步研究其調(diào)控機(jī)制可能有助于危險(xiǎn)分層，并為提高乳腺癌對免疫治療的反應(yīng)提供靶點(diǎn)。