苗 妍，路 露，謝夢迪，岳佑凇，桂新景，宋明坤，王艷麗，姚 靜，施鈞瀚，張 璐，李學(xué)林，劉瑞新*

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，河南 鄭州 450046；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000；3.河南省中藥臨床應(yīng)用、評價(jià)與轉(zhuǎn)化工程研究中心，河南 鄭州 450000；4.河南中醫(yī)藥大學(xué) 呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450046；5.河南省中藥臨床藥學(xué)中醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州450000；6.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中一集團(tuán)公司，河南 鄭州 450000）

中藥傳統(tǒng)湯劑是我國臨床應(yīng)用最早、最廣泛的劑型，兼具起效快、易吸收等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)還體現(xiàn)了中醫(yī)藥隨證加減、辨證論治的優(yōu)勢特色［1］。然而，在當(dāng)今生活節(jié)奏日益加快和中醫(yī)藥現(xiàn)代化的背景下，其煎煮過程繁瑣、貯存和攜帶不便等缺點(diǎn)嚴(yán)重制約了在臨床上的應(yīng)用和發(fā)展。此時(shí)，中藥傳統(tǒng)湯劑劑型改革的創(chuàng)新性成果—中藥配方顆粒（Dispensing granule of Chinese medicine，DGCM）應(yīng)運(yùn)而生，它是由單味中藥飲片經(jīng)水提、分離、濃縮、干燥、制粒而成的顆粒，在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，按照中醫(yī)臨床處方調(diào)配后，供患者沖服使用。DGCM 不僅保留了中藥傳統(tǒng)湯劑辨證論治、隨證加減的中醫(yī)藥特色，還具有免煎煮、服用方便、便于攜帶等優(yōu)勢［2］。然而，中藥配方顆粒自誕生之日起始終存在一個(gè)備受質(zhì)疑的核心問題，即配方顆粒湯劑（Dispensing granule decoction，DGD）與傳統(tǒng)湯劑（Traditional decoction，TD）之間的差異性問題或等效性問題［3］。

近年來，研究人員進(jìn)行了大量DGD 和TD 間的等效性研究，取得了顯著成績。但總體來說，兩者之間的差異對比研究大多僅針對某一單味藥或處方進(jìn)行單一或多種成分的對比［4-5］，或針對某一單味藥或處方進(jìn)行單個(gè)或多種藥效的對比［6-7］，僅有少數(shù)研究結(jié)合多批次樣品、多維度指標(biāo)（化學(xué)成分指標(biāo)、基礎(chǔ)藥效學(xué)指標(biāo)、臨床藥效學(xué)指標(biāo)等）的對比結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)分析和綜合比較。且已有研究大多采用指紋圖譜相似度評價(jià)方法、單因素方差分析、t檢驗(yàn)等統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法比較二者之間的差異。上述分析方法雖然可以根據(jù)相似度數(shù)值、差異是否顯著來分析二者之間的等效性，但在二者相似度達(dá)到多少可以等效替代、等效替代程度是多少等方面，即沒有判別標(biāo)準(zhǔn)，也不能給出置信度，更未以圖形化的形式進(jìn)行直觀區(qū)分和判別。因此，構(gòu)建一個(gè)圖形化、直觀化、可從多維度指標(biāo)（化學(xué)成分指標(biāo)、基礎(chǔ)藥效學(xué)指標(biāo)、臨床藥效學(xué)指標(biāo)等）綜合評價(jià)TD和DGD等效性的方法很有必要。

主成分分析法（PCA） 是多元統(tǒng)計(jì)分析中經(jīng)典的降維方法之一。其基本思想是將數(shù)據(jù)中具備相關(guān)性的多個(gè)指標(biāo)重新進(jìn)行線性組合得到數(shù)量較少且互不相關(guān)的綜合性指標(biāo)，即降維處理。這些綜合性指標(biāo)被稱為主成分，可最大限度地反映原始數(shù)據(jù)中的有用信息［8-10］。PCA作為當(dāng)前數(shù)據(jù)處理領(lǐng)域最具代表性的一種數(shù)據(jù)降維方法，在圖像分析［11］、故障診斷［12］、中藥質(zhì)量評價(jià)［13-15］等方面均得到了很好的運(yùn)用。置信橢圓是對置信區(qū)域的描述方式，可以提供一種圖形化的方法來量化兩組數(shù)據(jù)集之間的差異［16-17］，使二者之間的差異更加直觀化。因此，為解決現(xiàn)有評價(jià)TD 和DGD 等效性的分析方法不直觀、未對其進(jìn)行多維度指標(biāo)綜合評價(jià)、無法以圖形化形式展示二者之間的關(guān)系、無法確定等效替代程度等問題，本研究依托于PCA 算法，構(gòu)建了一種基于多指標(biāo)降維判別分析的TD 與DGD 的等效性評價(jià)方法，該評價(jià)方法以TD 和DGD 的化學(xué)成分指標(biāo)或藥效學(xué)指標(biāo)為數(shù)據(jù)，通過構(gòu)建的兩個(gè)置信橢圓的位置關(guān)系快速直觀地綜合呈現(xiàn)TD和DGD之間的關(guān)系，可為TD和DGD等效性評價(jià)提供新的思路與方法。

1 多指標(biāo)降維判別分析方法的原理與流程

多指標(biāo)降維判別分析（MiDRDA）是依托于PCA 算法，對包含TD 和DGD 多指標(biāo)（Multi-index）信息（化學(xué)成分指標(biāo)、基礎(chǔ)藥效學(xué)指標(biāo)、臨床藥效學(xué)指標(biāo)等）的兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行適宜降維，并基于降維后的兩組數(shù)據(jù)構(gòu)建一定置信度下的置信橢圓，直觀評價(jià)兩者之間關(guān)系的一種方法。該分析方法采用Matlab 軟件將判別分析結(jié)果通過二維PCA 得分圖進(jìn)行可視化，通過分析二維PCA 得分圖中自動生成的代表TD和DGD的兩個(gè)置信橢圓的位置關(guān)系，快速、直觀地判別TD和DGD的可替代程度。

1.1 構(gòu)造初始判別式D

首先構(gòu)造初始判別式D（公式（1）），以此判別式判斷TD和DGD兩組數(shù)據(jù)是否可以進(jìn)行下一步分析。樣本量要求為：TD樣本數(shù)≥3、3≤DGD樣本數(shù)≤TD樣本數(shù)，樣本數(shù)據(jù)均需具有代表性。初始判別式D中的CT為TD 組各變量數(shù)值的變異系數(shù)（RSD），CD為DGD 組各變量數(shù)值的變異系數(shù)（RSD），p為變量數(shù)，D則為TD 組變量數(shù)值RSD 平均值與DGD 組變量數(shù)值RSD 平均值的差值。若D≥0，說明該DGD 樣品組內(nèi)變異小于TD 組，樣品質(zhì)量相對穩(wěn)定，可進(jìn)行下一步分析；若D＜0，但CD＜5%，說明DGD 樣品組內(nèi)變異雖然大于TD 組，但差異較小，仍可進(jìn)行后續(xù)判別分析；若D＜0 且CD≥5%，說明該DGD 樣品組內(nèi)變異大于TD組，配方顆粒樣品質(zhì)量極不穩(wěn)定，為不合格藥品，不需進(jìn)行后續(xù)直觀判別分析。

式中，i為指標(biāo)變量的編號。

1.2 構(gòu)建置信橢圓E

取符合初始判別式D的表征TD 樣品質(zhì)量的數(shù)據(jù)信息與表征DGD 樣品質(zhì)量的數(shù)據(jù)信息，根據(jù)二維隨機(jī)變量概率論相關(guān)知識，兩類樣品數(shù)據(jù)信息可在給出的一定置信度條件下，得到一個(gè)二維隨機(jī)樣本集構(gòu)成的橢圓形區(qū)域（置信橢圓），當(dāng)置信度α分別為99%、 95%、90%時(shí)，可計(jì)算出二維連續(xù)性隨機(jī)變量聯(lián)合概率密度函數(shù)，據(jù)此構(gòu)建置信橢圓E。其之所以為橢圓形，是因?yàn)槎S正態(tài)分布（不一定是標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布）的概率密度函數(shù)為一個(gè)類似“帽子形”的三維圖形，用平行于xoy的平面截取該三維圖形，會得到一組同心橢圓，在同一橢圓上其分布密度相同，稱為等密度橢圓，該橢圓所圍成的區(qū)域?yàn)闄z測結(jié)果在某一概率下可能出現(xiàn)的置信區(qū)間，稱為置信橢圓［18-19］。

置信橢圓E的構(gòu)造方式如下：①基于PCA 算法得到數(shù)據(jù)協(xié)方差矩陣對應(yīng)的特征值λ和特征向量v；②獲取最大特征值λmax、特征向量vmax和最小特征值λmin、特征向量vmin，利用反正切函數(shù)求出最大特征向量vmax與x軸的夾角θ，即為置信橢圓的旋轉(zhuǎn)角度，可利用旋轉(zhuǎn)矩陣R=［cosθsinθ，-sinθcosθ］對置信橢圓進(jìn)行旋轉(zhuǎn)；③根據(jù)橢圓公式（2）構(gòu)造卡方檢驗(yàn)，其中自由度為2，s是一個(gè)與置信度有關(guān)的量，當(dāng)置信度分別為99%、95%和90%時(shí)，s的取值分別為9.210、5.991 和4.605，并可求得橢圓長半軸a和短半軸b；④以兩組數(shù)據(jù)的均值為置信橢圓中心，2a、2b為橢圓的長軸和短軸，即可確定置信橢圓E的面積和邊界。整個(gè)構(gòu)造過程可通過Matlab程序?qū)崿F(xiàn)。

1.3 構(gòu)造判別標(biāo)準(zhǔn)

將上述步驟通過 Matlab 軟件實(shí)現(xiàn)判別函數(shù)的可視化，可直觀評價(jià)DGD 與TD 的等效關(guān)系，判斷兩者是否可以相互替代。由PCA 得到的主成分二維圖上，各個(gè)樣品點(diǎn)為二維隨機(jī)變量，在二維平面中，假定其點(diǎn)用（x，y）表示，此時(shí)x和y是正交的，其隨機(jī)分布的區(qū)域可以構(gòu)造為兩個(gè)二維平面圖中任一可能的置信橢圓E1、E2，其中E1為TD 組，E2為DGD 組。在95 %的置信度下，當(dāng)前兩個(gè)主成分解釋變異達(dá)80%及以上時(shí)，表明前兩個(gè)主成分能夠涵蓋樣品大部分的原始數(shù)據(jù)信息［20-21］，則構(gòu)建的兩個(gè)置信橢圓可以很好地表征TD 和DGD 的化學(xué)成分、藥效數(shù)據(jù)信息，其位置關(guān)系可準(zhǔn)確表示兩組樣品間的等效關(guān)系。當(dāng)公式（3）有解，即兩個(gè)置信橢圓的位置關(guān)系為包含/相交/相切時(shí)，表明在此置信度下TD 和DGD 存在共有區(qū)域，該區(qū)域內(nèi)，代表兩種湯劑成分、藥效數(shù)據(jù)信息的樣品點(diǎn)可能會完全一致，進(jìn)而可認(rèn)為其成分、藥效接近，兩者在一定程度上可達(dá)到完全等效/部分等效，可以相互替代/部分替代；若公式（3）無解，則兩個(gè)置信橢圓相離，可判斷兩者不等效、不可替代。此時(shí)可依據(jù)TD 的化學(xué)或藥效數(shù)據(jù)對DGD 當(dāng)量比進(jìn)行校正后，再檢驗(yàn)判別，若兩橢圓相切/相交/包含，則認(rèn)為DGD 在經(jīng)當(dāng)量比校正后可與TD有不同程度的替代，若仍然不能相交，則認(rèn)為經(jīng)當(dāng)量比校正后兩者仍不可替代。

1.4 多指標(biāo)降維判別分析方法步驟

Step1：采用合適的化學(xué)分析方法和藥理藥效學(xué)方法獲取TD和DGD化學(xué)成分、藥效學(xué)等數(shù)據(jù)。

Step2：將數(shù)據(jù)按照公式（1）計(jì)算D值，根據(jù)D值判斷配方顆粒樣品的質(zhì)量穩(wěn)定性。若結(jié)果符合“1.1”項(xiàng)中規(guī)定的要求，TD和DGD兩組數(shù)據(jù)可進(jìn)入下一步分析。

Step3：將符合公式（1）的兩組數(shù)據(jù)輸入Matlab 程序中相應(yīng)的位置，運(yùn)行該程序，程序依托PCA 算法對TD和DGD兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理，得到二維PCA得分圖，并自動生成兩個(gè)分別表征TD和DGD數(shù)據(jù)信息的置信橢圓。

Step4：當(dāng)前兩個(gè)主成分解釋變異達(dá)80%及以上時(shí)，可根據(jù)二維PCA 得分圖中兩個(gè)置信橢圓的位置關(guān)系判斷TD和DGD 之間的等效性。若兩個(gè)置信橢圓包含/相交/相切，表明二者存在共有區(qū)域，在該區(qū)域內(nèi)，代表TD 和DGD 成分、藥效數(shù)據(jù)信息的樣品點(diǎn)可能會完全一致，判斷TD 和DGD 可完美等效替代/部分等效替代/等效替代程度低；若兩個(gè)置信橢圓相離，表明二者沒有共有區(qū)域，說明代表TD 和DGD成分、藥效數(shù)據(jù)信息的樣品點(diǎn)沒有重疊部分，判斷TD和DGD不能等效替代。

Step5：采用當(dāng)量比校正方法對不能和TD 完美等效替代的配方顆粒進(jìn)行當(dāng)量比校正，將校正后的數(shù)據(jù)重復(fù)以上4個(gè)步驟，判斷經(jīng)當(dāng)量比校正后DGD與TD的等效性。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 炙甘草配方顆粒湯劑與傳統(tǒng)湯劑等效性評價(jià)

2.1.1 數(shù)據(jù)來源基于課題組前期關(guān)于炙甘草DGD與TD的差異對比研究內(nèi)容，選取其中部分實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)驗(yàn)證多指標(biāo)降維判別分析方法的有效性。選取的5 批炙甘草飲片、9 批（3 個(gè)廠家各3 批）配方顆粒的樣品來源信息見表1、表2。

表1 5批炙甘草中藥飲片批號、產(chǎn)地及廠家Table 1 Batch numbers，regions and manufacturers of 5 batches of baked licorice pieces

表2 3個(gè)廠家炙甘草配方顆粒生產(chǎn)批號Table 2 Production batch numbers of three manufacturers of baked licoric dispensing granule

選取的5 批炙甘草TD 和9 批炙甘草DGD 的HPLC 指紋圖譜、共有峰峰面積等相關(guān)數(shù)據(jù)信息均采用高效液相色譜儀測得。液相色譜條件如下：Shim-pacCGISTC18-AQ 色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm），流動相A 為乙腈，流動相B 為0.2%磷酸水溶液（含0.02 mol/L 的磷酸二氫鉀），梯度洗脫（0～6 min，19% A；6～15 min，19%～25% A；15～45 min，25%～50% A，45～46 min，50%～19% A；46～56 min，19%A），流速0.7 mL/min，檢測波長237 nm，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μL。5 批炙甘草TD 和9 批DGD 的HPLC指紋圖譜見圖1。

圖1 5批炙甘草TD和9批炙甘草DGD的HPLC指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of 5 batches TD and 9 batches DGD of baked licorice

2.1.2 A 廠炙甘草配方顆粒湯劑與傳統(tǒng)湯劑等效性評價(jià)驗(yàn)證結(jié)果以A 廠的3批炙甘草DGD 和5批炙甘草TD為樣本，以指標(biāo)成分甘草酸、芹糖甘草苷及其他共有峰的峰面積為數(shù)據(jù)進(jìn)行方法驗(yàn)證。初始判別式D的計(jì)算結(jié)果為D＞0，表明A 廠炙甘草DGD 樣品組內(nèi)差異小于TD 組，批次間質(zhì)量穩(wěn)定，可對兩組樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行降維可視化分析。將TD 和DGD 的數(shù)據(jù)輸入Matlab 程序，得到95%置信度下炙甘草TD樣品和A 廠炙甘草DGD 樣品的二維PCA 得分圖，在二維PCA 得分圖中可自動生成兩個(gè)分別表征TD 和DGD 數(shù)據(jù)信息的置信橢圓，且其主成分解釋變異達(dá)到了80%以上，表明前兩個(gè)主成分能夠涵蓋樣品大部分的原始信息，構(gòu)建的兩個(gè)置信橢圓可以很好地表征傳統(tǒng)湯劑和配方顆粒湯劑的數(shù)據(jù)信息，可根據(jù)兩個(gè)置信橢圓的位置關(guān)系清晰直觀地判斷二者的等效程度（見圖2）。在該置信度下，代表炙甘草TD 樣品與A 廠DGD 樣品的兩個(gè)置信橢圓相離（圖2A），表明TD 與DGD 在此置信度下沒有共有區(qū)域，說明代表TD 和DGD 化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)信息的樣品點(diǎn)沒有重疊部分，可認(rèn)為二者不能等效替代，需對配方顆粒當(dāng)量比進(jìn)行校正。分別采用峰面積加和法［1，22］、平均倍數(shù)法［22］、CRITIC客觀賦權(quán)法［23］3種方法對A廠炙甘草配方顆粒當(dāng)量比進(jìn)行校正，將校正后的數(shù)據(jù)輸入Matlab 程序中進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用峰面積加和法［1，22］對配方顆粒當(dāng)量比進(jìn)行校正后（下調(diào)），二維PCA 得分圖中的兩個(gè)置信橢圓部分相交（圖2B），說明在相交區(qū)域內(nèi)，代表TD 和DGD 化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)信息的樣品點(diǎn)可能會完全一致，表明A 廠炙甘草DGD經(jīng)當(dāng)量比校正后與TD可部分等效替代。

2.1.3 B廠炙甘草配方顆粒湯劑與傳統(tǒng)湯劑等效性評價(jià)驗(yàn)證結(jié)果以指標(biāo)成分甘草酸、芹糖甘草苷及其他共有峰的峰面積為數(shù)據(jù)，按照與A 廠相同的方法，對B 廠家的3 批炙甘草DGD 和5 批炙甘草TD 進(jìn)行方法驗(yàn)證。按照“1.4”操作步驟，依次得到D＞0 和95%置信度下的二維PCA 得分圖以及PCA 得分圖中分別表征TD 和DGD 數(shù)據(jù)信息的置信橢圓（圖3）。在95%置信度下，代表炙甘草TD 樣品與B 廠DGD 樣品的兩個(gè)置信橢圓雖然包含（圖3A），但因其主成分解釋變異未達(dá)80%，表明前兩個(gè)主成分無法代表樣本的大部分原始數(shù)據(jù)信息，故構(gòu)建的兩個(gè)置信橢圓無法很好地表征TD 和DGD 的數(shù)據(jù)信息，在二維平面中不能直接判定其等效，需對配方顆粒當(dāng)量比進(jìn)行校正。分別采用“2.1.2”中所述的3種方法對B 廠炙甘草配方顆粒當(dāng)量比進(jìn)行校正，將校正后的數(shù)據(jù)輸入Matlab 程序進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用CRITIC客觀賦權(quán)法［23］對配方顆粒當(dāng)量比進(jìn)行校正后（略微下調(diào)），二維PCA得分圖中的兩個(gè)置信橢圓不僅包含，且其主成分解釋變異大于80%（圖3B），表明前兩個(gè)主成分能夠涵蓋樣品大部分的原始信息，構(gòu)建的兩個(gè)置信橢圓可以很好地表征傳統(tǒng)湯劑和配方顆粒湯劑的數(shù)據(jù)信息。而且在包含區(qū)域內(nèi)，代表TD 和DGD 化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)信息的樣品點(diǎn)可能會完全一致，表明B 廠炙甘草DGD 經(jīng)當(dāng)量比校正后與TD可相互替代，兩者等效。

圖3 B廠炙甘草DGD與TD當(dāng)量比校正前（A）和校正后（B）的多指標(biāo)降維判別分析結(jié)果Fig.3 The results of multi-index dimension reduction discriminant analysis before（A） and after（B） equivalence ratio correction for DGD and TD of baked licorice in manufacturer B

2.1.4 C廠炙甘草配方顆粒湯劑與傳統(tǒng)湯劑等效性評價(jià)驗(yàn)證結(jié)果以指標(biāo)成分甘草酸、芹糖甘草苷及其他共有峰的峰面積為數(shù)據(jù)，按照與A 廠相同的方法，對C 廠的3 批炙甘草DGD 和5 批炙甘草TD 進(jìn)行方法驗(yàn)證。按照“1.4”操作步驟，依次得到D＞0 和95%置信度下的二維PCA 得分圖以及PCA 得分圖中分別表征TD和DGD 數(shù)據(jù)信息的置信橢圓（圖4），其主成分解釋變異達(dá)到80%以上，表明可根據(jù)兩個(gè)置信橢圓的位置關(guān)系清晰直觀地判斷二者的等效程度。在95%置信度下，炙甘草TD樣品與C廠DGD樣品的兩個(gè)置信橢圓相離（圖4A），表明TD 與DGD 在此置信度下沒有共有區(qū)域，說明代表TD 和DGD 化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)信息的樣品點(diǎn)沒有重疊部分，可認(rèn)為二者不能等效替代，需對其配方顆粒當(dāng)量比進(jìn)行校正。分別采用“2.1.2”中所述的3 種方法對C 廠炙甘草配方顆粒當(dāng)量比進(jìn)行校正，將校正后的數(shù)據(jù)輸入Matlab 程序進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用CRITIC 客觀賦權(quán)法［23］對配方顆粒當(dāng)量比進(jìn)行校正后（下調(diào)），二維PCA 得分圖中的兩個(gè)置信橢圓部分相交（圖4B），說明在相交區(qū)域內(nèi)，代表TD 和DGD 化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)信息的樣品點(diǎn)可能會完全一致，表明C廠炙甘草DGD經(jīng)當(dāng)量比校正后與TD可部分等效替代。

圖4 C廠炙甘草DGD與TD當(dāng)量比校正前（A）和校正后（B）的多指標(biāo)降維判別分析結(jié)果Fig.4 The results of multi-index dimension reduction discriminant analysis before（ A） and after（B） equivalence ratio correction for DGD and TD of baked licorice in manufacturer C

2.2 白芍配方顆粒湯劑與傳統(tǒng)湯劑等效性評價(jià)

2.2.1 數(shù)據(jù)來源基于課題組前期關(guān)于白芍DGD與TD的差異對比研究內(nèi)容，選取其中部分實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)驗(yàn)證多指標(biāo)降維判別分析方法的有效性。選取的6 批白芍飲片、6 批（2 個(gè)廠家各3 批）配方顆粒樣品來源信息見表3、表4。

表3 6批白芍中藥飲片批號、產(chǎn)地及廠家Table 3 Batch number，region and manufacturer of 6 batches of radix paeoniae alba pieces

表4 兩個(gè)廠家白芍配方顆粒生產(chǎn)批號Table 4 Production batch number of two manufacturers of radix paeoniae alba dispensing granule

選取的6 批白芍TD 和6 批白芍DGD 的HPLC 指紋圖譜、共有峰峰面積等相關(guān)數(shù)據(jù)信息均采用高效液相色譜儀測得。液相色譜條件同“2.1.1”，6批白芍TD和6批DGD的指紋圖譜見圖5。

圖5 6批白芍TD和6批白芍DGD的HPLC指紋圖譜Fig.5 HPLC fingerprints of 6 batches TD and 6 batches DGD of radix paeoniae alba

2.2.2 D廠白芍配方顆粒湯劑與傳統(tǒng)湯劑等效性評價(jià)驗(yàn)證結(jié)果以D廠的3批白芍DGD和6批白芍TD為樣本，以指標(biāo)成分芍藥內(nèi)酯苷、沒食子酸及其他共有峰的峰面積為數(shù)據(jù)進(jìn)行方法驗(yàn)證。按照“1.4”操作步驟，依次得到D＞0和95%置信度下的二維PCA 得分圖以及PCA 得分圖中分別表征TD 和DGD 數(shù)據(jù)信息的置信橢圓（圖6），其主成分解釋變異達(dá)到80%以上，表明前兩個(gè)主成分能夠涵蓋樣品大部分的原始信息，構(gòu)建的兩個(gè)置信橢圓可以很好地表征傳統(tǒng)湯劑和配方顆粒湯劑的數(shù)據(jù)信息，可根據(jù)兩個(gè)置信橢圓的位置關(guān)系清晰直觀地判斷二者的等效程度。在95%置信度下，白芍TD 樣品與D 廠DGD 樣品的兩個(gè)置信橢圓相離（圖6A），表明TD 與DGD 在此置信度下沒有共有區(qū)域，說明代表TD 和DGD 化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)信息的樣品點(diǎn)沒有重疊部分，可認(rèn)為二者不能等效替代，需對其配方顆粒當(dāng)量比進(jìn)行校正。分別采用“2.1.2”中所述的3種方法對D 廠白芍配方顆粒當(dāng)量比進(jìn)行校正，將校正后的數(shù)據(jù)輸入Matlab 程序進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3 種當(dāng)量比校正方法均不能使TD 和DGD 的兩個(gè)置信橢圓相交，無法使二者等效替代。其中CRITIC 客觀賦權(quán)法［23］校正后的驗(yàn)證結(jié)果如圖6B 所示。說明簡單的當(dāng)量比校正無法使D廠白芍DGD與TD等效替代。

圖6 D廠白芍DGD與TD當(dāng)量比校正前（A）和校正后（B）的多指標(biāo)降維判別分析結(jié)果Fig.6 The results of multi-index dimension reduction discriminant analysis before（A） and after（B） equivalence ratio correction for DGD and TD of radix paeoniae alba in manufacturer D

2.2.3 E廠白芍配方顆粒湯劑與傳統(tǒng)湯劑等效性評價(jià)驗(yàn)證結(jié)果以指標(biāo)成分芍藥內(nèi)酯苷、沒食子酸及其他共有峰的峰面積為數(shù)據(jù)，按照與D 廠相同的方法，對E 廠的3 批白芍DGD 和6 批白芍TD 進(jìn)行方法驗(yàn)證。按照“1.4”操作步驟，依次得到D＞0 和95%置信度下的二維PCA 得分圖以及PCA 得分圖中分別表征TD和DGD 數(shù)據(jù)信息的置信橢圓（圖7），其主成分解釋變異達(dá)到80%以上，表明前兩個(gè)主成分能夠涵蓋樣品大部分的原始信息，構(gòu)建的兩個(gè)置信橢圓可以很好地表征傳統(tǒng)湯劑和配方顆粒湯劑的數(shù)據(jù)信息，根據(jù)兩個(gè)置信橢圓的位置關(guān)系可清晰直觀地判斷二者的等效程度。在95%置信度下，白芍TD樣品與E 廠DGD 樣品的兩個(gè)置信橢圓相離（圖7A），表明TD 與DGD 在此置信度下沒有共有區(qū)域，說明代表TD 和DGD 化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)信息的樣品點(diǎn)沒有重疊部分，可認(rèn)為二者不能等效替代，需對其配方顆粒當(dāng)量比進(jìn)行校正。分別采用“2.1.2”中所述的3種方法對E 廠白芍配方顆粒當(dāng)量比進(jìn)行校正，將校正后的數(shù)據(jù)輸入Matlab程序中進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種當(dāng)量比校正方法均不能使TD和DGD的兩個(gè)置信橢圓相交，無法使二者等效替代。其中CRITIC 客觀賦權(quán)法［23］校正后的驗(yàn)證結(jié)果如圖7B 所示。說明簡單的當(dāng)量比校正無法使E廠白芍DGD與TD等效替代。

圖7 E廠白芍DGD與TD當(dāng)量比校正前（A）和校正后（B）的多指標(biāo)降維判別分析結(jié)果Fig.7 The results of multi-index dimension reduction discriminant analysis before（A） and after（B） equivalence ratio correction for DGD and TD of radix paeoniae alba in manufacturer E

2.3 砂仁配方顆粒湯劑與傳統(tǒng)湯劑等效性評價(jià)

2.3.1 數(shù)據(jù)來源基于課題組前期關(guān)于砂仁DGD與TD的差異對比研究內(nèi)容，選取其中部分實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)驗(yàn)證多指標(biāo)降維判別分析方法的有效性。選取的3 批砂仁飲片、3 批配方顆粒（3 個(gè)廠家各1 批）樣品來源信息見表5、表6。

表5 3批砂仁中藥飲片批號、產(chǎn)地及廠家Table 5 Batch numbers，regions and manufacturers of 7 batches of amomi fructus pieces

表6 3個(gè)廠家砂仁配方顆粒生產(chǎn)批號Table 6 Production batch numbers of three manufacturers amomi fructus dispensing granule

選取的3 批砂仁TD 和3 批砂仁DGD 的GC 指紋圖譜、共有峰峰面積等相關(guān)數(shù)據(jù)信息均采用氣相色譜儀測得。氣相色譜條件如下：HP-5 毛細(xì)管柱（0.25 μm × 250 μm，30 m），載氣為氮?dú)?，體積流量1.0 mL/min；采用程序升溫，初始溫度60 ℃，以4 ℃/min 升至124 ℃，以8 ℃/min 上升至196 ℃保持5 min，10 ℃/min 上升至260 ℃保持5 min；分流進(jìn)樣，分流比1∶60；進(jìn)樣量1 μL；進(jìn)樣口溫度250 ℃。3批砂仁TD和3批砂仁DGD的氣相指紋圖譜見圖8。

圖8 3批砂仁TD和3批砂仁DGD的GC指紋圖譜Fig.8 GC fingerprints of 3 batches TD and 3 batches DGD of amomi fructus

通過小鼠胃腸蠕動實(shí)驗(yàn)，以葡聚糖藍(lán)2000為胃腸推進(jìn)示蹤染料，計(jì)算小鼠胃排空率、小腸推進(jìn)比和相對胃染料殘留率，評價(jià)砂仁傳統(tǒng)湯劑與配方顆粒湯劑在胃腸保護(hù)藥理作用方面［24］的差異。實(shí)驗(yàn)動物為昆明種SPF 級雄性小鼠，體重20～24 g。將其隨機(jī)分為空白組和6 個(gè)實(shí)驗(yàn)組（砂仁TD3 組，砂仁DGD 3組），每組8只。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，小鼠禁食（不禁水）24 h，開始灌胃給藥，給藥前稱量體重，實(shí)驗(yàn)組分別灌服相應(yīng)的中藥煎液，對照組灌服同體積的蒸餾水。灌藥30 min后再灌入0.2 mL 10 mg/mL葡聚糖藍(lán)2000，20 min 后脫頸處死，打開腹腔，結(jié)扎胃賁門和幽門，在結(jié)扎線外剪斷食道和小腸，取出胃體，用濾紙沾干后稱重，得胃體和內(nèi)容物重量。然后取胃，沿大彎側(cè)剪開，將胃內(nèi)色素殘留物充分洗于1.5 mL 生理鹽水中，再將空胃體沾干后稱重，得胃體重量，計(jì)算胃排空率。胃排空率（%）=（灌胃量-（胃體和內(nèi)容物重量-胃體重量））/灌胃量×100%。

將整段小腸放置在被生理鹽水濕潤的玻璃板上，自然拉直小腸，測量從幽門到回盲結(jié)口的小腸總長度，再測量從幽門到染料顯色末端的小腸長度。小腸推進(jìn)比（%）=染料顯色腸長度/小腸總長度×100%。

將上述用生理鹽水洗滌過的胃內(nèi)色素殘留物以5 000 r/min 離心3 min，吸取150 μL 上清液至于96孔板，用酶標(biāo)儀在最大吸收波長處測定上清液中染料的吸光度，確定胃染料濃度，得相對胃染料殘留率（%）。相對胃染料殘留率（%）=實(shí)驗(yàn)組胃內(nèi)色素殘留量/對照組胃內(nèi)色素殘留量×100%。

最終取得的胃排空率、小腸推進(jìn)比、相對胃染料殘留率數(shù)據(jù)見表7。

表7 胃排空率、小腸推進(jìn)比、相對胃染料殘留率結(jié)果（±s，n=8）Table 7 Gastric emptying rate，small intestinal propulsion ratio，and relative gastric dye residue rate results

表7 胃排空率、小腸推進(jìn)比、相對胃染料殘留率結(jié)果（±s，n=8）Table 7 Gastric emptying rate，small intestinal propulsion ratio，and relative gastric dye residue rate results

Sample TD-1 TD-2 TD-3 F1 G1 H1 Gastric emptying rate /%91.87±3.78 91.20±5.54 90.09±5.30 89.56±3.67 89.42±3.60 87.42±4.38 Small intestinal propulsion ratio/%71.48±0.09 73.26±0.09 75.12±0.07 68.32±0.11 62.17±0.10 58.87±0.08 Relative gastric dye residue rate/%57.85±0.07 79.46±0.12 81.87±0.06 73.44±0.05 78.44±0.12 60.39±0.03

2.3.2 砂仁配方顆粒湯劑與傳統(tǒng)湯劑等效性評價(jià)驗(yàn)證結(jié)果以3 批砂仁DGD 和3 批砂仁TD 為樣本，以指標(biāo)成分乙酸龍腦酯及其他共有峰的峰面積和小鼠胃排空率、小腸推進(jìn)比、相對胃染料殘留率為數(shù)據(jù)進(jìn)行方法驗(yàn)證。按照“1.4”操作步驟，依次得到D＞0 和95%置信度下的二維PCA 得分圖以及PCA得分圖中分別表征TD 和DGD 數(shù)據(jù)信息的置信橢圓（圖9）。在95%置信度下，砂仁TD 樣品與DGD 樣品的兩個(gè)置信橢圓相離且其主成分解釋變異未達(dá)80%，表明前兩個(gè)主成分無法代表樣本的大部分變異信息，構(gòu)建的兩個(gè)置信橢圓無法很好地表征TD和DGD的數(shù)據(jù)信息，且TD與DGD在此置信度下沒有共有區(qū)域（圖9A），說明代表TD 和DGD 化學(xué)成分、藥效數(shù)據(jù)信息的樣品點(diǎn)沒有重疊部分，可認(rèn)為二者不能等效替代，需對其配方顆粒當(dāng)量比進(jìn)行校正。分別采用“2.1.2”中所述的3種方法對砂仁配方顆粒當(dāng)量比進(jìn)行校正，將校正后的數(shù)據(jù)輸入Matlab程序進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用CRITIC 客觀賦權(quán)法［23］對配方顆粒當(dāng)量比進(jìn)行校正后（略微下調(diào)），二維PCA 得分圖中的兩個(gè)置信橢圓雖然相切，但其主成分解釋變異仍小于80%（圖9B），表明前兩個(gè)主成分仍無法代表樣本的大部分原始數(shù)據(jù)信息，構(gòu)建的兩個(gè)置信橢圓無法很好地表征TD 和DGD 數(shù)據(jù)信息，故在二維平面中不能根據(jù)兩個(gè)置信橢圓的位置關(guān)系判定二者的等效性。推測可能因砂仁含揮發(fā)性成分較多，DGD 與TD 兩者間的影響因素眾多，僅經(jīng)簡單校正無法使其等效。

圖9 砂仁DGD與TD當(dāng)量比校正前（A）和校正后（B）的多指標(biāo)降維判別分析結(jié)果Fig.9 The results of multi-index dimension reduction discriminant analysis before（A） and after（B） equivalence ratio correction for DGD and TD of amomi fructus

2.4 討 論

在方法效果實(shí)例驗(yàn)證分析結(jié)果中，本研究所構(gòu)建的方法可以直觀地以兩個(gè)置信橢圓的位置關(guān)系展示TD 和DGD 的等效性關(guān)系。其中，A、B、C 3廠炙甘草DGD 均不能與其TD 判定為等效，根據(jù)峰面積數(shù)據(jù)采用峰面積加和法［1，22］、CRITIC 客觀賦權(quán)法［23］對配方顆粒當(dāng)量比進(jìn)行校正后（均下調(diào)），3 個(gè)廠家的炙甘草DGD 均可判定與其TD 可以相互替代或替代程度增高，說明各廠家對其配方顆粒當(dāng)量比制定偏大，當(dāng)服用與傳統(tǒng)湯劑相同劑量的配方顆粒湯劑時(shí)，相比傳統(tǒng)湯劑，配方顆粒中的化學(xué)成分含量偏低，導(dǎo)致配方顆粒與其傳統(tǒng)湯劑無法達(dá)到等效或等效程度較低［25-26］。

D、E 兩廠的白芍DGD 和F、G、H 廠的砂仁DGD 在其當(dāng)量比校正前和校正后均不能判定與其相應(yīng)TD 具有等效性，分析其原因可能為以下幾點(diǎn)：（1）配方顆粒在制備過程中經(jīng)歷了水提、分離、濃縮、干燥等多個(gè)步驟，而傳統(tǒng)湯劑僅是加水煎煮，不同的制備工藝造成兩者之間的差異。（2）砂仁中含有較多的揮發(fā)性成分［27］，該類成分穩(wěn)定性差，在制備成配方顆粒過程中可能會揮散、氧化、變質(zhì)等，從而導(dǎo)致與傳統(tǒng)湯劑無法達(dá)到完全等效。各廠家在制備不同類別品種的中藥配方顆粒時(shí)，應(yīng)結(jié)合飲片自身性質(zhì)和特點(diǎn)，以其傳統(tǒng)湯劑制備方法為參照，為每類飲片“量身打造”適合其自身性質(zhì)的配方顆粒制備工藝。（3）TD 和DGD 中不同化學(xué)成分的含量可能并不是按等比例變化，僅經(jīng)簡單的當(dāng)量比整體上調(diào)或下調(diào)進(jìn)行校正無法使二者達(dá)到完全等效。

2.5 方法對比及改進(jìn)措施

本課題組前期使用指紋圖譜相似度評價(jià)、t檢驗(yàn)、客觀賦權(quán)法等方法對TD 和DGD 的差異進(jìn)行研究［22-23，28］，這些方法雖然能以相似度數(shù)值、差異是否顯著來判斷TD和DGD的等效性，但二者相似度達(dá)到多少可以等效替代、等效可替代程度是多少，既沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，也不能以圖形化的形式直觀展現(xiàn)，同時(shí)不能基于化學(xué)成分、藥效學(xué)信息綜合分析二者之間的差異。而本研究所構(gòu)建的多指標(biāo)降維判別分析方法的底層核心算法是PCA，該方法可以從TD 和DGD 的化學(xué)成分、藥效學(xué)信息等多個(gè)指標(biāo)著手，通過降維的方法將原來多個(gè)線性相關(guān)的指標(biāo)轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個(gè)線性無關(guān)的指標(biāo)，綜合分析各指標(biāo)的整體效應(yīng)［29］，從多個(gè)指標(biāo)綜合評價(jià)二者之間的等效性；同時(shí)，本方法可以運(yùn)用Matlab 軟件將二者的等效性判別分析結(jié)果通過二維PCA 得分圖進(jìn)行可視化，即以圖形化的形式通過兩個(gè)置信橢圓的位置關(guān)系展示，從而可以快速直觀地展現(xiàn)TD和DGD之間的等效性關(guān)系，是對上述分析方法的有力補(bǔ)充。

但該方法在實(shí)際應(yīng)用中也存在以下幾點(diǎn)可改進(jìn)之處：（1）在實(shí)際應(yīng)用中，基于PCA 算法降維后前兩個(gè)主成分的解釋變異可能達(dá)不到80%，推測是因?yàn)樵摲椒ú捎枚嗯螛悠?、多指?biāo)信息（化學(xué)成分指標(biāo)、基礎(chǔ)藥效學(xué)指標(biāo)、臨床藥效學(xué)指標(biāo)等）來判別DGD 和TD 之間的等效關(guān)系，涉及變量、樣品數(shù)相對較多，導(dǎo)致降維效率降低；或因?yàn)闃悠分g的共線性本身較差，各樣品之間的差異相對較大。后續(xù)可以考慮采用經(jīng)過歸屬且具有明確藥理活性的成分群（變量）進(jìn)行PCA，以提高降維效率和分析準(zhǔn)確性［22］。（2）本判別方法判斷TD 和DGD 是否可以等效替代的依據(jù)是二維空間中所構(gòu)建的兩個(gè)置信橢圓的位置關(guān)系，然而，在三維空間中兩類樣本之間的位置關(guān)系基于此方法無法展現(xiàn)，后續(xù)研究可以考慮基于降維后的三維或多維空間的n個(gè)點(diǎn)（n≥4）建立置信橢球，立體化展現(xiàn)二者之間的關(guān)系。本研究所建方法在二維空間已經(jīng)可以解釋80%以上的數(shù)據(jù)變異，可以較準(zhǔn)確地直觀展現(xiàn)TD 和DGD 之間的關(guān)系，同時(shí)為后續(xù)三維空間方法的建立奠定了基礎(chǔ)。（3）本文在方法效果實(shí)例驗(yàn)證中選取的樣本量較少，若增加樣本量，有望獲取更多的藥效學(xué)數(shù)據(jù)，得到更具代表性和廣泛性的判別結(jié)果。（4）中藥湯劑和配方顆粒湯劑成分眾多、藥效多樣，成分與藥效之間關(guān)系復(fù)雜［30］。本文所建方法雖是基于多個(gè)指標(biāo)對其進(jìn)行判別分析，但也僅能從整體上判別二者的等效性，不能分析出其化學(xué)成分與藥理作用之間強(qiáng)度的大小，該方面的研究還需進(jìn)一步的深入。

3 結(jié) 論

為方便、快速、直觀化判別TD 和DGD 之間的等效性，本研究提出了一種在對多指標(biāo)（化學(xué)成分指標(biāo)、基礎(chǔ)藥效學(xué)指標(biāo)、臨床藥效學(xué)指標(biāo)等）信息進(jìn)行降維的前提下，構(gòu)建一定置信度下的置信橢圓，依據(jù)兩個(gè)置信橢圓的位置關(guān)系來判別TD 和DGD 是否具有等效性的方法。對多廠家多批次炙甘草、白芍、砂仁DGD 和TD 相應(yīng)數(shù)據(jù)的驗(yàn)證結(jié)果顯示，所構(gòu)建的方法可以通過二維PCA 得分圖中兩個(gè)置信橢圓的位置關(guān)系直觀清晰地展現(xiàn)TD 和DGD 之間的等效性關(guān)系，有效解決了現(xiàn)有分析方法不直觀、無法以圖形化形式展示二者之間等效性、無法確定二者等效替代程度等問題，為TD 和DGD 的等效性評價(jià)提供了新的思路與方法。