張凱敏 黃玉潔 段瑩 郭寶平 柯晴 廖成成 岑洪

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院淋巴血液及兒童腫瘤科

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是成人中最常見的一種侵襲性B 細(xì)胞淋巴瘤，可分為生發(fā)中心B細(xì)胞（germinal center B-cell like，GCB）亞型和活化B細(xì)胞（activated B-cell like，ABC）亞型［1］。B 細(xì)胞的AKT（也稱為蛋白激酶B）對(duì)生發(fā)中心的形成和維持、抗體的產(chǎn)生和親和力的成熟必不可少［2-3］。PI3K（phosphatidylinositol 3 kinase）家族由一系列絲氨酸/蘇氨酸和脂質(zhì)激酶組成，其可啟動(dòng)AKT的激活［4-7］。另外，研究發(fā)現(xiàn)PI3K 信號(hào)通路在控制B細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和代謝中起著重要作用［8］。PI3Kδ 是PI3K 的一個(gè)亞型，研究證實(shí)PI3Kδ 在維持B 細(xì)胞功能及與B 細(xì)胞有關(guān)的腫瘤發(fā)生中發(fā)揮作用［9］。由于PI3Kδ 參與B 細(xì)胞受體（B cell receptor，BCR）信號(hào)傳導(dǎo)，并在B 細(xì)胞存活和分化中發(fā)揮重要作用，因此PI3K 有可能成為DLBCL 的治療靶點(diǎn)。林普利塞（Linperlisib，YY-20394）是由上海瓔黎藥業(yè)有限公司自主研發(fā)的一種PI3Kδ選擇性抑制劑，對(duì)濾泡中心起源的B 細(xì)胞淋巴瘤（濾泡淋巴瘤）患者表現(xiàn)出較好的療效［10］，但在GCB 亞型和ABC 亞型DLBCL 中的作用機(jī)制尚未明確。本研究擬探索YY-20394 對(duì)SU-DHL-4 細(xì)胞（屬于GCB 亞型）和U2932 細(xì)胞（屬于ABC 亞型）的抗腫瘤效應(yīng)及其在不同亞型DLBCL 細(xì)胞中的作用機(jī)制，為PI3K 抑制劑治療DLBCL 提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

SU-DHL-4 細(xì)胞（GCB 亞型人DLBCL 細(xì)胞株）和U2932 細(xì)胞（ABC 亞型人DLBCL 細(xì)胞株）均購自南京科佰生物科技有限公司。PI3K 抑制劑YY-20394（純度＞99%）由上海瓔黎藥業(yè)有限公司贈(zèng)送；RPMI-1640培養(yǎng)液及胎牛血清均購自美國(guó)Gibco 公司；PE Annexin V 凋亡試劑盒購自美國(guó)BD Biosciences 公司；青霉素和鏈霉素均購自北京索萊寶科技有限公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所；總RNA 提取試劑盒購自蘇州新賽美生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將SU-DHL-4細(xì)胞和U2932細(xì)胞于含10%胎牛血清和100 U/mL 青霉素及100 μg/mL 鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中懸浮生長(zhǎng)，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，進(jìn)行消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 CCK-8法檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞增殖的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SU-DHL-4 細(xì)胞和U2932 細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基稀釋成5×105個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液，按90 μL/孔接種于96 孔板中，再加入10 μL 已用DMSO溶解的不同濃度的YY-20394 藥液，使其終濃度為0.875、1.750、3.500、7.000、14.000 μmol/L，同組樣本設(shè)置3 個(gè)重復(fù)孔。分別于培養(yǎng)24 h和48 h后，向每孔加入10μL CCK-8 試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，使用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度（A）。細(xì)胞增殖抑制率=［（Ac-As）/（Ac-Ab）］×100%。Ab：空白孔（不含細(xì)胞和藥物的完全培養(yǎng)基，含有CCK-8）；Ac：對(duì)照孔（含有細(xì)胞的完全培養(yǎng)基、CCK-8、溶解藥物所需的等量DMSO，無藥物）；As：實(shí)驗(yàn)孔（含有細(xì)胞的完全培養(yǎng)基、CCK-8 和藥物）。使用GraphPad Prism 5.0 軟件分別計(jì)算YY-20394的25%抑制濃度（25% inhibitory concentration，IC25）、50%抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）、75% 抑制濃度（75% inhibitory concentration，IC75）。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SU-DHL-4 細(xì)胞和U2932 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至5×105個(gè)/mL 后接種1 mL 于6 孔板中，根據(jù)YY-20394 的IC25、IC50、IC75，加入相應(yīng)濃度的YY-20394藥液，孵育24 h后，按照PE Annexin V 凋亡試劑盒說明書，用PBS 液清洗細(xì)胞2 次，再用1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL。取100 μL 的細(xì)胞懸液于5 mL 流式管中，先加入5 μL PE Annexin V 染料，混勻后于室溫避光孵育5 min，再加入5 μL 7-AAD 染料。最后加入400 μL 1×Binding Buffer，1 h 內(nèi)使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，并計(jì)算凋亡率。

1.5 轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序

取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SU-DHL-4細(xì)胞和U2932細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL接種1 mL于6孔板中，根據(jù)YY-20394的IC50，加入相應(yīng)濃度的藥液孵育24 h，各組樣本設(shè)置3 個(gè)重復(fù)孔。培養(yǎng)24 h 后離心收集細(xì)胞。PBS 漂洗2 次后用Trizol 試劑裂解細(xì)胞。按照總RNA 提取試劑盒說明書對(duì)樣本進(jìn)行RNA 抽提。由深圳中科普瑞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行RNA-Seq測(cè)序。

1.6 生物信息學(xué)分析

采用R 4.0.1 軟件limma 包分析藥物處理前后SU-DHL-4 細(xì)胞和U2932 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜基因的表達(dá)變化，并將分析結(jié)果可視化，繪制火山圖和熱圖；利用R 軟件clusterProfiler 包對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG富集分析和GO 功能注釋分析，進(jìn)一步探索基因功能及其細(xì)胞定位、生物學(xué)功能；并且利用GSEA 富集分析藥物處理前后各細(xì)胞表達(dá)的基因在常見腫瘤相關(guān)信號(hào)通路的富集情況，探討藥物的作用機(jī)制。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組樣本比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；不滿足正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 YY-20394抑制DLBCL細(xì)胞的增殖能力

CCK-8結(jié)果（圖1A）顯示，不同濃度（0.875、1.750、3.500、7.000、14.000 μmol/L）的YY-20394 處理SU-DHL-4 細(xì)胞24 h 后，均對(duì)細(xì)胞增殖能力表現(xiàn)出抑制作用，且隨著濃度的增加而逐漸增加，其中YY-20394 的IC25為（0.69±0.71）μmol/L、IC50為（3.30±0.46）μmol/L、IC75為（15.79±2.31）μmol/L；在不同濃度YY-20394 處理48 h 后也觀察到類似的效應(yīng)，提示YY-20394 能抑制SU-DHL-4 細(xì)胞生長(zhǎng)，其效應(yīng)隨著藥物濃度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。YY-20394 處理U2932 細(xì)胞24 h 和48 h 后，細(xì)胞增殖能力未被明顯抑制（圖1B）?；诖?，選擇YY-20394 藥物處理24 h 后SU-DHL-4細(xì)胞的IC25（0.69μmol/L）、IC50（3.30μmol/L）、IC75（15.79μmol/L）用于后續(xù)的細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步探索藥物對(duì)該細(xì)胞株的凋亡誘導(dǎo)作用。

圖1 YY-20394對(duì)SU-DHL-4和U2932細(xì)胞的增殖抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of YY-20394 on proliferation of SU-DHL-4 and U2932 cells

2.2 YY-20394誘導(dǎo)SU-DHL-4細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果如圖2 所示，不同濃度（0.69、3.30、15.79 μmol/L）YY-20394 分別處理SU-DHL-4 和U2932細(xì)胞24 h后，SU-DHL-4細(xì)胞中3個(gè)藥物濃度組細(xì)胞的凋亡率均較未處理組增加［（6.87±0.37）%、（14.95±0.25）%、（40.58±0.52）%vs（5.32±0.32）%，均P＜0.05］；U2932 細(xì)胞中3個(gè)藥物濃度組細(xì)胞的凋亡率與未處理組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［（4.42±0.15）%、（4.31±0.22）%、（4.32±0.14）%vs（4.28±0.22）%，均P＞0.05］。上述結(jié)果表明，YY-20394 對(duì)SU-DHL-4 細(xì)胞凋亡有一定影響，且對(duì)細(xì)胞凋亡的影響隨藥物濃度的遞增而增大，但對(duì)U2932細(xì)胞凋亡沒有明顯影響。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)YY-20394作用后SU-DHL-4和U2932細(xì)胞的凋亡率Fig.2 The apoptosis rates of SU-DHL-4 and U2932 cells treated with YY-20394 were detected by flow cytometry

2.3 YY-20394影響DLBCL細(xì)胞的基因表達(dá)

用3.30μmol/L（IC50）的YY-20394處理SU-DHL-4細(xì)胞24 h后進(jìn)行RNA-Seq測(cè)序并繪制火山圖，如圖3A顯示，SU-DHL-4細(xì)胞共檢測(cè)到600個(gè)差異表達(dá)基因，包括259個(gè)上調(diào)基因和341個(gè)下調(diào)基因；另外，挑選表達(dá)差異最顯著的前20個(gè)基因繪制熱圖（圖3B），結(jié)果顯示YY-20394處理后SU-DHL-4細(xì)胞的基因表達(dá)發(fā)生了顯著變化。而YY-20394處理U2932細(xì)胞后僅檢測(cè)到3個(gè)下調(diào)基因（AC026464.2、SNORD14D、MIR155HG）；12個(gè)上調(diào)基因（MIR4426、AL671277.1、MIR4538、AC018638.1、SLC6A6、MIR4539、PRR15L、AC099811.2、RN7SL2、SNORD104、RN7SL1、CORO7-PAM16）。

圖3 YY-20394影響SU-DHL-4細(xì)胞的基因表達(dá)Fig.3 YY-20394 affected gene expression in SU-DHL-4 cells

2.4 生物信息學(xué)分析YY-20394 對(duì)SU-DHL-4 細(xì)胞的抗腫瘤作用

將YY-20394 處理SU-DHL-4 細(xì)胞后檢測(cè)到的差異基因進(jìn)行KEGG 富集分析，結(jié)果（圖4A）顯示，藥物處理細(xì)胞后，細(xì)胞的氨基酸代謝、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用和細(xì)胞凋亡信號(hào)通路等重要細(xì)胞生物學(xué)功能途徑被激活；而cGMP-PKG、cAMP、mTOR、AMPK、PI3K-AKT、Ras、NF-κB、BCR、JAK-STAT 等重要信號(hào)通路顯著下調(diào)，同時(shí)磷酸戊糖途徑、類固醇的合成、DNA的復(fù)制和細(xì)胞周期等重要的細(xì)胞功能也被顯著抑制，提示PI3K 抑制劑可能誘導(dǎo)了這些信號(hào)通路活性變化，從而導(dǎo)致SU-DHL-4 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制和凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。GO 功能注釋分析結(jié)果（圖4B）顯示，在YY-20394處理SU-DHL-4細(xì)胞后差異表達(dá)基因主要定位在核糖體、核糖體亞基、胞質(zhì)大核糖體亞基和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，與膽固醇及其他醇類合成、與代謝及核轉(zhuǎn)錄的mRNA分解、靶向膜的信號(hào)識(shí)別顆粒（signal recognition particle，SRP）依賴的共翻譯蛋白等生物學(xué)過程相關(guān)，且與NADP 合成、核糖體結(jié)構(gòu)組成的分子功能相關(guān)。另外，對(duì)YY-20394 處理SU-DHL-4細(xì)胞前后的腫瘤相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行GSEA富集分析，結(jié)果（圖4C）顯示，Hedgehog、JAK-STAT、MAPK、NF-κB、Notch、PI3K-AKT、Wnt 等信號(hào)通路在SU-DHL-4 細(xì)胞的未加藥組中顯著富集，而YY-20394 處理后上述通路的激活水平顯著降低。然而，YY-20394處理U2932細(xì)胞后，KEGG 富集分析未富集到具有顯著水平的信號(hào)通路。

圖4 生物信息學(xué)分析YY-20394對(duì)SU-DHL-4細(xì)胞的抗腫瘤作用Fig.4 The anti-tumor effect of YY-20394 on SU-DHL-4 cells was analyzed by bioinformatics

進(jìn)一步利用GSEA 富集分析YY-20394 處理后SU-DHL-4 細(xì)胞和U2932 細(xì)胞的PI3K-AKT 信號(hào)通路富集情況，結(jié)果（圖4D）顯示，PI3K-AKT 信號(hào)通路在SU-DHL-4 細(xì)胞中富集，而在U2932 細(xì)胞中的活化程度低，推測(cè)這可能是YY-20394 對(duì)U2932 細(xì)胞無明顯抗腫瘤作用的原因。

3 討論

PI3K-AKT 信號(hào)通路在腫瘤的增殖、存活、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、抵抗凋亡、血管發(fā)生和轉(zhuǎn)移以及對(duì)化療耐藥、放療抵抗中發(fā)揮了重要作用［11-12］。為探討PI3K 在DLBCL治療中的價(jià)值，本研究使用一種新的PI3K抑制劑YY-20394 并研究其對(duì)DLBCL 細(xì)胞的作用。本研究發(fā)現(xiàn)YY-20394 能抑制GCB 亞型DLBCL 細(xì)胞株SU-DHL-4細(xì)胞的生長(zhǎng)，促使細(xì)胞凋亡，且其效應(yīng)隨藥物作用時(shí)間延長(zhǎng)和藥物濃度增高而增強(qiáng)。但是，在ABC亞型的U2932 細(xì)胞中未能觀察到明顯的細(xì)胞增殖抑制和促凋亡現(xiàn)象。目前研究認(rèn)為，BCR 信號(hào)活化在ABC 型DLBCL 的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用［13］，該信號(hào)的一個(gè)主要特征是BTK 和NF-κB 信號(hào)通路的構(gòu)成性激活［14］，但是GCB亞型DLBCL缺乏這種信號(hào)。另外，有研究發(fā)現(xiàn)GCB 亞型DLBCL 的發(fā)生依賴于另一種信號(hào)BCR 信號(hào)：強(qiáng)直性BCR 信號(hào)，該信號(hào)通路的激活被認(rèn)為與抗原無關(guān)，其特征是基線NF-κB 活性較低，但PI3K-AKT 信號(hào)通路活性增加［15］。因此，PI3K 抑制劑YY-20394有望用于治療GCB亞型DLBCL。

本研究還發(fā)現(xiàn)YY-20394 作用于SU-DHL-4 細(xì)胞后存在多個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生改變，并且GSEA 分析發(fā)現(xiàn)7 條跟腫瘤密切相關(guān)的信號(hào)通路發(fā)生了改變，包括PI3K-AKT、NF-κB、MAPK、JAK-STAT、Notch、Wnt 和Hedgehog 信號(hào)通路，PI3K 抑制劑YY-20394 顯著抑制了上述信號(hào)通路的激活。目前已知BCR、PI3K/AKT等信號(hào)通路與DLBCL 預(yù)后密切相關(guān)，在DLBCL 的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用［16-18］。在KEGG 富集分析和GO 功能注釋分析中，還觀察到了DNA 的復(fù)制和細(xì)胞周期調(diào)控等重要的細(xì)胞功能在藥物作用后也被顯著抑制。這些研究結(jié)果進(jìn)一步揭示了PI3K抑制劑對(duì)SU-DHL-4細(xì)胞抗腫瘤作用的機(jī)制。然而，YY-20394處理U2932細(xì)胞后，KEGG 富集分析未富集到具有顯著水平的信號(hào)通路。另外，GSEA 富集分析發(fā)現(xiàn)PI3K-AKT 信號(hào)通路在SU-DHL-4 和U2932 兩種細(xì)胞中的富集水平具有顯著差異，PI3K-AKT 信號(hào)通路在GCB 亞型的SU-DHL-4細(xì)胞中活化水平高，而在ABC亞型的U2932細(xì)胞中活化水平低，推測(cè)這可能是PI3K抑制劑對(duì)ABC亞型DLBCL患者療效不佳的原因。

目前，PI3K 抑制劑在濾泡性淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞白血病和小淋巴細(xì)胞淋巴瘤具有較好的療效，但是在復(fù)發(fā)/難治性DLBCL 中的治療效果并不理想［19-20］，其原因可能是其中的分子作用機(jī)制有所不同。本研究發(fā)現(xiàn)PI3K 抑制劑對(duì)GCB 亞型DLBCL 細(xì)胞SU-DHL-4增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)具有明顯的作用，而對(duì)ABC亞型DLBCL 細(xì)胞U2932 不敏感，推測(cè)PI3K-AKT 信號(hào)通路可能不是影響ABC 亞型DLBCL 細(xì)胞增殖生長(zhǎng)最主要的信號(hào)通路，并且該信號(hào)通路在兩種細(xì)胞的富集水平分析結(jié)果也充分證明了其在U2932 細(xì)胞中活化水平不高。但是，由于本研究?jī)H在細(xì)胞層面探討了PI3K 抑制劑YY-20394 的抗腫瘤作用，未來仍需在體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證其作用。