盧薇薇，蘇 丹，彭 秘，劉匡一

（1.江西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，江西 南昌 330000； 2.江西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥防治認(rèn)知障礙腦疾病江西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330000； 3.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第908 醫(yī)院，江西 南昌 330000；4.南昌市第一醫(yī)院藥劑科，江西 南昌 330000）

小綠葉止咳糖漿為德國(guó)Engelhard 制藥公司開(kāi)發(fā)的純天然藥物，主要成分是常春藤葉干提取物，用于緩解小兒感冒等各種病因引起的咳嗽，舒緩咽喉腫脹，能有效對(duì)抗可能轉(zhuǎn)化的嚴(yán)重支氣管炎癥［1］。前期課題組從小綠葉止咳糖漿中共鑒定出62 種成分［1］，主要為黃酮類(lèi)、酚酸類(lèi)、皂苷類(lèi)，其中皂苷類(lèi)的常春藤皂苷C、常春藤皂苷B、α-常春藤皂苷，黃酮類(lèi)的蘆丁、秦皮甲素、金絲桃苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷，以及酚酸類(lèi)的綠原酸等均對(duì)呼吸道系統(tǒng)疾病具有一定作用［2-6］。但預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，秦皮甲素、金絲桃苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷含量太低，傳統(tǒng)的HPLC 法無(wú)法滿(mǎn)足其含量測(cè)定要求。

UPLC-MS/MS 法作為靈敏度較高的檢測(cè)方法，適用于含量低、成分復(fù)雜的樣品檢測(cè)。因此，本實(shí)驗(yàn)采用該方法同時(shí)測(cè)定小綠葉止咳糖漿中常春藤皂苷C、常春藤皂苷B、α-常春藤皂苷、蘆丁、秦皮甲素、金絲桃苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、綠原酸的含量，以期為該制劑質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考，也為其后期藥動(dòng)學(xué)、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料

1.1 儀器 超高效液相色譜系統(tǒng)（日本島津公司）； AB SCIEX 5500 三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（美國(guó)AB SCIEX 公司）； TC-16G 高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）； VORTEX-6 渦旋混合器（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司）； AL104 分析天平［梅特勒-托利多儀器（上海） 有限公司］； DCY-24S 恒溫氮?dú)獯蹈蓛x（青島?？苾x器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 綠原酸對(duì)照品（批號(hào)110753-201415，純度≥96.2%） 購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院； 蘆丁（批號(hào)B20771）、常春藤皂苷C （批號(hào)B20163）、常春藤皂苷B （批號(hào)B20166）、α-常春藤皂苷 （ 批號(hào) B21958）、秦皮甲素 （ 批號(hào)B20989）、金絲桃苷（批號(hào)B20631）、山柰酚-3-O-蕓香糖苷（批號(hào)B21133） 對(duì)照品均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司，純度均≥98.0%。小綠葉止咳糖漿 （德國(guó) Engelhard 公司，批號(hào) 19F059A、19L051A、20D095A、21N069A） 購(gòu)于網(wǎng)絡(luò)購(gòu)物平臺(tái)天貓國(guó)際自營(yíng)店。甲醇、乙腈為色譜純，均購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher 公司； 甲酸為質(zhì)譜純，購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司； 水為蒸餾水，購(gòu)于廣州屈臣氏食品飲料有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液制備 取100 μL 藥液，置于10 mL 量瓶中，加50% 乙腈至刻度，超聲處理30 min，50%乙腈補(bǔ)足減失的質(zhì)量，取適量，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，16 000 r/min 離心10 min，取上清液，即得。

2.2 對(duì)照品溶液制備 取常春藤皂苷C、常春藤皂苷B、α-常春藤皂苷、蘆丁、秦皮甲素、金絲桃苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、綠原酸對(duì)照品適量，80%乙腈溶解稀釋?zhuān)瞥少|(zhì)量濃度分別為1 169、181、159、118、152、150、192.5、142 μg/mL 的溶液，即得，4 ℃下冷藏保存。

2.3 陰性樣品溶液制備 按說(shuō)明書(shū)添加工藝，制成缺常春藤提取物的純糖漿空白制劑，按“2.1”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.4 色譜條件 Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）； 流動(dòng)相0.05%甲酸（A） -乙腈（B），梯度洗脫（0 ～1.5 min，5% B；1.5～5 min，5% ～40%B； 5～10 min，40% ～90%B；10 ～11 min，90% B； 11 ～11.1 min，90% ～5% B；11.1～12 min，5%B）［7-13］； 體積流量0.3 mL/min；柱溫40 ℃； 進(jìn)樣量1 μL。

2.5 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI）； 正負(fù)離子掃描； 正離子電壓5 500 V，負(fù)離子電壓-4 500 V；Gas 1/Gas 2 50 psi （1 psi ＝6.895 kPa）； Cur Gas3 5 psi，其他參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 各成分質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 Mass spectrometry parameters for various constituents

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 圖1 ～3 顯示，各成分色譜峰峰形理想，空白無(wú)干擾，表明該方法專(zhuān)屬性良好。

圖1 陰性樣品多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖Fig.1 Multiple reaction monitoring chromatograms of negative samples

圖2 對(duì)照品多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖Fig.2 Multiple reaction monitoring chromatograms of reference substances

圖3 供試品多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖Fig.3 Multiple reaction monitoring chromatograms of test samples

2.6.2 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密吸取“2.2” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，乙腈稀釋成不同質(zhì)量濃度，在“2.4” “2.5” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，并分別以S/N ＝10、3 為定量限、檢測(cè)限，結(jié)果見(jiàn)表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

表2 各成分線(xiàn)性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.6.3 精密度試驗(yàn) 取“2.2” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，選擇中間質(zhì)量濃度，在“2.4” “2.5” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定7 次，測(cè)得常春藤皂苷C、常春藤皂苷B、α-常春藤皂苷、蘆丁、秦皮甲素、金絲桃苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、綠原酸峰面積RSD 分別為 2.31%、2.17%、2.28%、3.58%、2.03%、3.01%、2.85%、2.76%，表明儀器精密度良好。

2.6.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1” 項(xiàng)下供試品溶液適量，于0、2、4、6、8、10、12、24 h 在“2.4”“2.5” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得常春藤皂苷C、常春藤皂苷B、α-常春藤皂苷、蘆丁、秦皮甲素、金絲桃苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、綠原酸峰面積RSD 分別為 2.79%、3.22%、2.67%、3.88%、2.56%、3.42%、3.06%、2.98%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取“2.1” 項(xiàng)下供試品溶液適量，在“2.4” “2.5” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定7 次，測(cè)得常春藤皂苷C、常春藤皂苷B、α-常春藤皂苷、蘆丁、秦皮甲素、金絲桃苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、綠原酸峰面積RSD 分別為2.33%、2.16%、2.54%、3.15%、3.52%、3.11%、2.92%、2.73%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.6 加樣回收率試驗(yàn) 取藥液 （批號(hào)21N069A） 50 μL，加入常春藤皂苷C、常春藤皂苷B、α-常春藤皂苷、蘆丁、秦皮甲素、金絲桃苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、綠原酸質(zhì)量濃度分別為1.67、1.81、1.59、1.18、1.52、1.50、1.93、1.42 μg/mL 的“2.2” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液100、200、500 μL，按“2.1” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.4” “2.5” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，常春藤皂苷C、常春藤皂苷B、α-常春藤皂苷、蘆丁、秦皮甲素、金絲桃苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、綠原酸平均加樣回收率分別為98.11%、96.72%、99.48%、100.13%、101.28%、96.61%、98.12%、98.54%，RSD 分別為2.19%、3.42%、3.67%、2.48%、2.11%、1.78%、3.82%、2.66%。

2.6.7 樣品含量測(cè)定 取3 批樣品，按“2.1”項(xiàng)下方法平行制備3 份供試品溶液，在 “2.4”“2.5” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各成分含量測(cè)定結(jié)果（μg/mL，n＝3）Tab.3 Results for content determination of various constituents （μg/mL，n＝3）

3 討論與結(jié)論

在色譜柱方面，課題組前期定性研究時(shí)采用T3 柱，目的是將小綠葉止咳糖漿中極性偏大或偏中性的成分更好地進(jìn)行分離。本實(shí)驗(yàn)所測(cè)成分大多為極性偏小的黃酮類(lèi)和皂苷類(lèi)，故最終選擇C18色譜柱。

在流動(dòng)相方面，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)正負(fù)離子同時(shí)掃描的方式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，水相考察了0.1%、0.05%甲酸，綜合化合物響應(yīng)情況，最終選擇0.05% 甲酸-乙腈體系。

MRM 圖顯示，3.01 min 為綠原酸出峰時(shí)間，2.33、3.41 min 出現(xiàn)相應(yīng)峰信號(hào)。根據(jù)前期定性分析數(shù)據(jù)，可知存在新綠原酸、隱綠原酸同分異構(gòu)體，通過(guò)二級(jí)確證，推測(cè)2.33 min 處為新綠原酸，3.41 min 處為隱綠原酸，根據(jù)參考文獻(xiàn)［14-20］結(jié)構(gòu)相似定量報(bào)道，以綠原酸為對(duì)照品對(duì)兩者進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果分別為19.64、4.80 μg/mL。

本實(shí)驗(yàn)首次建立UPLC-MS/MS 方法同時(shí)測(cè)定小綠葉止咳糖漿中常春藤皂苷C、常春藤皂苷B、α-常春藤皂苷、蘆丁、秦皮甲素、金絲桃苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、綠原酸的含量，該方法專(zhuān)屬性強(qiáng)，靈敏度高，分析時(shí)間短，可為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供參考，并能為其后期藥動(dòng)學(xué)、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供數(shù)據(jù)支撐，從而為相關(guān)臨床合理用藥奠定基礎(chǔ)。