千 一，李如琪，吳俊麗，李 欣，張 峰*

（1.河南大學第一附屬醫(yī)院，河南 開封 475000； 2.河南大學中醫(yī)藥研究院，藥學院，河南 開封 475004）

碧綠米仔蘭Aglaiaperviridis是楝科米仔蘭屬植物，主要生長在中國南部及西南部，其枝葉或花朵在民間常作為草藥使用。米仔蘭屬藥用植物中富含多種類型的次生代謝產(chǎn)物，包括Flavagline 類、萜類、黃酮類、生物堿類等，具有抗炎、抗菌、抗腫瘤等作用［1-5］。本實驗對碧綠米仔蘭莖枝的化學成分及其生物活性進行研究，從中分離得到21 個化合物，并首次分別采用T-AOC 試劑盒及MTT 法評價其抗氧化活性和神經(jīng)保護活性，化合物1 ～20 均為首次從該種植物中分離得到。化合物2、9、10、14～20 具有較強的總抗氧化能力； 化合物10 的神經(jīng)保護作用與濃度呈正相關，化合物9、15 的最佳濃度分別為50、100 μmol/L。

1 材料

1.1 藥物與試劑 甲醇、乙腈均為色譜純； 二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、石油醚均為分析純，購自天津市富宇精細化工有限公司； 氘代甲醇和氘代氯仿購自寧波旋光醫(yī)藥科技有限公司； C18反相填料購自上海博勢生物科技有限公司； 硅膠GF254薄層板和柱層析硅膠（200～300、300～400 目） 購于青島海洋化工有限公司； 總抗氧化能力 （T-AOC）測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所； 維生素C 購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司； 依達拉奉注射液（20 mL/30 mg） 購自吉林省博大制藥股份有限公司； 30%過氧化氫購自天津市科密歐化學試劑有限公司。人源神經(jīng)母細胞瘤 （SH-SY5Y）購自中國科學院上海生化細胞所。碧綠米仔蘭藥材采集于云南西雙版納，經(jīng)河南大學藥學院袁王俊教授鑒定為正品。

1.2 儀器 LC-20AT 型高效液相色譜儀、LC-6A型制備高效液相色譜儀（日本島津公司）； 基質輔助激光解析離子飛行質譜檢測儀、AVANCE AV-300 核磁共振波譜儀（德國Bruke 公司）； Agilent 1100 Series LC/MSD Trap 質譜儀（美國安捷倫公司）； 搖擺式粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）；旋轉蒸發(fā)儀（鄭州長城科工貿有限公司）。

2 提取與分離

取碧綠米仔蘭莖枝10 kg，粉碎成粗粉，95%乙醇加熱回流提取3 次。提取液過濾后減壓濃縮成浸膏（926.5 g），分別用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取，萃取液減壓濃縮，分別得到浸膏139、43.6、40 g。

二氯甲烷浸膏43.6 g 經(jīng)石油醚-乙酸乙酯（50 ∶1、20 ∶1、10 ∶1、5 ∶1、2 ∶1、1 ∶1） 梯度洗脫，TLC 檢測合并后得到Fr.1 ～Fr.6； Fr.1、Fr.2 中分別直接獲得化合物1 （72.3 mg）、21（60.9 mg）。Fr.3 經(jīng)硅膠柱分離，以石油醚-乙酸乙酯（15 ∶1） 洗脫，得到化合物2 （9.8 mg）。Fr.4 經(jīng)硅膠柱分離，以石油醚-乙酸乙酯（10 ∶1）洗脫，得到化合物3 （6 mg）、4 （49.7 mg）、5（211.6 mg）。Fr.5、Fr.6 經(jīng)硅膠柱分離，以石油醚-乙酸乙酯（8 ∶1） 洗脫，得到化合物6 （21.8 mg）、7 （6.7 mg）。

乙酸乙酯部位浸膏40 g，以二氯甲烷-甲醇（100 ∶1、50 ∶1、30 ∶1、20 ∶1、10 ∶1、5 ∶1、1 ∶1） 梯度洗脫，經(jīng)TLC 檢測合并，得到Fr.1～Fr.7。從Fr.1 直接得到化合物8 （51.5 mg）。Fr.4經(jīng)ODS 分離，以20% ～90% 甲醇梯度洗脫，在30%甲醇流分中直接得到化合物11 （16.2 mg），40%甲醇的洗脫液經(jīng)TLC 檢測合并后得到Fr.4-1～Fr.4-3。Fr.4-1 經(jīng)制備HPLC 分離（流動相33%乙腈-水，檢測波長210、254 nm，體積流量3 mL/min），得到化合物18 （tR＝23 min，10.5 mg）。Fr.4-2 經(jīng)制備HPLC 分離（流動相25%乙腈-水，檢測波長210、254 nm，體積流量3 mL/min），得到化合物13 （tR＝22 min，18.6 mg）、10 （tR＝27 min，19.9 mg）、19 （tR＝31.5 min，14.7 mg）。從Fr.4-3 直接得到化合物9 （6 mg）。從Fr.5 直接得到化合物12 （16.8 mg）。Fr.6 經(jīng)ODS 分離，以20% ～90%甲醇梯度洗脫，20% 甲醇流分經(jīng)制備HPLC 分離（流動相15%乙腈-水，檢測波長210、254 nm，體積流量3 mL/min），得到化合物15 （tR＝27 min，275.7 mg）、16 （tR＝33 min，153 mg）、17 （tR＝40.5 min，85.6 mg）； 30%甲醇流分經(jīng)制備HPLC 分離（流動相25%乙腈-水，檢測波長210、254 nm，體積流量3 mL/min），得到化合物14 （tR＝40 min，4.7 mg）、20 （tR＝62 min，39 mg）。

3 結構鑒定

化合物1： 白色粉末（甲醇），分子式C30H52O3，ESI-MSm/z： 483.52 ［M ＋Na］＋。1H-NMR （300 MHz，DMSO-d6）δ： 0.74 （3H，s），0.78 （3H，s），0.81 （3H，s），0.84 （3H，s），0.90 （3H，s），0.98 （3H，s），1.02 （3H，s），1.03 （3H，s）；13C-NMR （75 MHz，DMSO-d6）δ： 31.8 （C-1），24.4 （C-2），77.3 （C-3），36.5 （C-4），48.8（C-5），19.5 （C-6），35.4 （C-7），44.6 （C-8），54.6 （C-9），37.5 （C-10），21.4 （C-11），27.5（C-12），43.9 （C-13），50.2 （C-14），33.5 （C-15），28.0 （C-16），49.5 （C-17），16.3 （C-18），12.6 （C-19），86.4 （C-20），23.6 （C-21），35.9（C-22），26.4 （C-23），83.5 （C-24），71.5 （C-25），27.4 （C-26），24.5 （C-27），28.5 （C-28），22.2 （C-29），16.8 （C-30）。以上數(shù)據(jù)與文獻［6］ 報道基本一致，故鑒定為3-epicotillol。

化合物2： 無色結晶（甲醇），分子式C9H10O5。與三氯化鐵-鐵氰化鉀和與溴甲酚綠反應呈陽性，ESI-MSm/z： 196.9 ［M-H］-。1H-NMR （300 MHz，CD3OD）δ： 7.33 （2H，s，H-2，6），3.88 （6H，s，H-3，5-OCH3）；13C-NMR （75 MHz，CD3OD）δ：121.9 （ C-1），108.2 （ C-2），148.8 （ C-3），141.7 （C-4），148.8 （C-5），108.2 （C-6），56.7（3，5-OCH3），169.8 （-COOH）。以上數(shù)據(jù)與文獻［7］ 報道基本一致，故鑒定為丁香酸。

化合物3： 白色無定形粉末（氯仿），分子式C16H32O2，與溴甲酚綠反應呈陽性，ESI-MSm/z：255.1 ［M-H］-，碎片離子峰213.2 ［M-C3H7］-。1HNMR （300 MHz，CDCl3）δ： 2.35 （2H，t，J＝7.6 Hz，H-2），1.52 （2H，m，H-3），1.25～1.38（16H，m，H-4 ～13），1.25 （2H，m，H-14），1.38 （2H，m，H-15），0.88 （3H，t，J＝7.2 Hz，H-16）；13C-NMR （75 MHz，CDCl3）δ： 178.9 （C-1），34.0 （C-2），32.1 （C-14），29.9 （C-6 ～11），29.6 （C-12），24.8 （C-3），29.5 （C-5），29.4 （C-13），29.2 （C-4），22.8 （C-15），14.3（C-16）。以上數(shù)據(jù)與文獻［8］ 報道基本一致，故鑒定為棕櫚酸。

化合物4： 黃色油狀液體 （氯仿），分子式C18H26O4，ESI-MSm/z： 307.4 ［M ＋H］＋。1H-NMR（300 MHz，CDCl3）δ： 7.68 （2H，dd，J＝3.2，5.6 Hz，H-3，6），7.52 （2H，dd，J＝3.2，5.6 Hz，H-4 ～5），4.29 （4H，t，J＝6.8 Hz，H-8，8′），1.70 （4H，m，H-9，9′），1.44 （4H，m，H-10，10′），1.24 （4H，s，H-11，11′），0.94（6H，t，J＝7.2 Hz，H-12，12′）；13C-NMR （75 MHz，CDCl3）δ： 132.3 （C-1 ～2），131.0 （C-4，5），128.9 （C-3，6），167.8 （C-7，7′），65.6（C-8，8′），30.6 （C-9，9′），29.8 （C-10，10′），19.2 （C-11，11′），13.9 （C-12，12′）。以上數(shù)據(jù)與文獻［9］ 報道基本一致，故鑒定為鄰苯二甲酸二戊酯。

化合物5： 黃色油狀液體，分子式C10H12O3，ESI-MSm/z： 203.2 ［M＋Na］＋。1H-NMR （300 MHz，CDCl3）δ： 7.24 （2H，d，J＝8.8 Hz，H-2，6），6.92 （2H，d，J＝8.8 Hz，H-3，5），4.32 （2H，q，J＝7.1 Hz，H-1′），1.40 （3H，t，J＝7.1 Hz，H-2′）；13C-NMR （75 MHz，CDCl3）δ： 130.3 （C-2，6），115.5 （C-3，5），125.2 （C-1），155.2（C-4），40.4 （C-7），61.2 （C-1′），14.2 （C-2′），173.3 （C-8）。以上數(shù)據(jù)與文獻［10］ 報道基本一致，故鑒定為對羥基苯乙酸乙酯。

化合物6： 無色針狀結晶 （甲醇），分子式C10H8O4，ESI-MSm/z： 193.3 ［M ＋H］＋。1H-NMR（300 MHz，DMSO-d6）δ： 6.20 （1H，d，J＝9.6 Hz，H-3），7.89 （1H，d，J＝9.6 Hz，H-4），3.81 （3H，s，-OCH3），7.21 （1H，s，H-5），6.78 （1H，s，H-8）；13C-NMR （75 MHz，DMSO-d6）δ： 160.6 （C-2），111.6 （C-3），144.6 （C-4），109.7 （ C-5），145.3 （ C-6），151.0 （ C-7），102.9 （ C-8），149.6 （ C-9），110.4 （ C-10），55.9 （-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻［11］ 報道基本一致，故鑒定為6-甲氧基-7 羥基香豆素。

化合物7： 白色油狀物 （氯仿），分子式C8H18O，ESI-MSm/z： 153.4 ［M ＋Na］＋。1H-NMR（300 MHz，CDCl3）δ： 3.66 （2H，s，H-1），0.88 （3H，t，J＝6.4 Hz，8-CH3），1.53 （2H，s，H-2），1.25 （n× CH2）；13C-NMR （75 MHz，CDCl3）δ： 7.4 （C-1），32.1 （C-2），30.2 （C-3），29.9 （C-4），29.5 （n×CH2），22.9 （C-7），14.2 （C-8）。以上數(shù)據(jù)與文獻［12］ 報道基本一致，故鑒定為1-辛醇。

化合物8： 無色針狀結晶 （甲醇），分子式C8H8O3，與三氯化鐵-鐵氰化鉀和溴甲酚綠反應呈陽性，ESI-MSm/z： 153.4 ［M＋H］＋。1H-NMR （300 MHz，CD3OD）δ： 7.07 （2H，d，J＝8.5 Hz，H-2′，6′），6.74 （2H，d，J＝8.5 Hz，H-3′，5′），3.48 （2H，s，H-2）；13C-NMR （75 MHz，CD3OD）δ： 176.5 （C-1），41.0 （C-2），157.2 （C-4′），131.2 （C-2′，6′），126.9 （C-1′），116.3 （C-3′，5′）。以上數(shù)據(jù)與文獻［13］ 報道基本一致，故鑒定為對羥基苯乙酸。

化合物9： 淡黃色無定形粉末（甲醇），分子式C28H36O13，ESI-MSm/z： 603.4 ［M ＋Na］＋，。1H-NMR （300 MHz，CD3OD）δ： 6.75 （2H，s，H-2，6），6.70（2H，s，H-2′，6′），4.67 （1H，d，J＝3.6 Hz，H-7），4.80 （1H，d，J＝4.1 Hz，H-7′），4.18（2H，m，H-9′），3.88 （2H，dd，J＝9.4 Hz，H-9），3.35 （2H，m，H-8′），2.66 （2H，m，H-8）；13C-NMR （75 MHz，CD3OD）δ： 140.4 （C-1），105.2 （C-2.6），154.3 （C-3，5），133.8（C-4），89.8 （C-7），56.4 （C-8），71.7 （C-9），131.4 （C-1′），104.9 （C-2′，6′），149.3 （C-3′，5′），135.7 （C-4′），83.3 （C-7′），51.5 （C-8′），70.5 （C-9′），105.4 （C-1″），75.7 （C-2″），77.8（C-3″），71.3 （C-4″），78.3 （C-5″），62.5 （C-6″），57.1 （3，5-OCH3），56.8 （3′，5′-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻［14］ 報道基本一致，故鑒定為（＋） -表丁香樹脂醇-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物10： 淡黃色無定形粉末（甲醇），分子式C28H36O13，ESI-MSm/z： 603.4 ［M ＋Na］＋，。1H-NMR （300 MHz，CD3OD）δ： 6.72 （2H，s，H-2，6），6.65（2H，s，H-2′，6′），4.77 （1H，d，J＝3.6 Hz，H-7），4.71 （1H，d，J＝4.1 Hz，H-7′），4.27（2H，m，H-9′），3.92 （2H，dd，J＝9.2，3.1 Hz，H-9），3.13 （2H，brs，H-8，8′）；13C-NMR（75 MHz，CD3OD）δ： 139.5 （C-1），104.8 （C-2.6），154.4 （C-3，5），135.5 （C-4），87.2 （C-7），55.7 （C-8），87.6 （C-7′），55.4 （C-8′），72.8 （C-9′），105.3 （C-1″），75.7 （C-2″），77.8（C-3″）。以上數(shù)據(jù)與文獻 ［15］ 報道基本一致，故鑒定為（＋） -丁香脂素-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物11： 黃色油狀液體（甲醇），分子式C9H10O3，ESI-MSm/z： 167.2 ［M ＋H］＋。1H-NMR（300 MHz，CD3OD）δ： 7.09 （2H，d，J＝8.6 Hz，H-2，6），6.75 （2H，d，J＝8.6 Hz，H-3，5），3.52 （2H，s，H-7），3.65 （3H，s，H-9）；13C-NMR （75 MHz，CD3OD）δ： 157.5 （C-4），131.3 （C-2，6），126.3 （C-1），116.2 （C-3，5），174.6 （C-8），52.4 （C-9）。以上數(shù)據(jù)與文獻［16］ 報道基本一致，故鑒定為對羥基苯乙酸甲酯。

化合物12： 白色無定形粉末（甲醇），分子式C14H20O9，ESI-MSm/z： 355.1 ［M＋Na］＋。與三氯化鐵-鐵氰化鉀反應呈陽性。1H-NMR （300 MHz，CD3OD）δ： 6.13 （2H，s，H-2，6），3.79 （6H，2×OCH3），4.66 （1H，d，J＝7.4 Hz，H-1′）；13CNMR （75 MHz，CD3OD）δ： 106.1 （C-1′），75.7（C-2′），78.2 （C-3′），71.2 （C-4′），77.9 （C-5′），62.7 （C-6′），129.5 （C-4），154.7 （C-3，5），155.9 （C-1），56.9 （3，5-OCH3） 以上數(shù)據(jù)與文獻［17］ 報道基本一致，故鑒為koaburaside。

化合物13： 白色無定形粉末（甲醇），分子式C19H32O7，ESI-MSm/z： 371.4 ［M-H］-。1H-NMR（300 MHz，CD3OD）δ： 1.19 （3H，d，J＝6.9 Hz，H-10），1.09 （3H，s，H-11），1.01 （3H，s，H-12），2.05 （3H，d，J＝1.63 Hz，H-13），5.81 （1H，s，H-4），4.33 （1H，d，J＝7.1 Hz，H-1′）；13C-NMR （75 MHz，CD3OD）δ： 102.1 （C-1′），75.1 （C-2′），78.1 （C-3′），71.8 （C-4′），77.9 （C-5′），62.9 （C-6′），202.4 （C-3），125.4（C-4），170.1 （C-5），19.9 （C-10），29.1 （C-11），27.5 （C-12），25.0 （C-13），75.5 （C-9），52.4 （C-6），48.1 （C-2），37.8 （C-8），37.3（C-1），26.8 （C-7）。以上數(shù)據(jù)與文獻［18］ 報道基本一致，故鑒定為byzantionoside B。

化合物14： 淡黃色粉末 （甲醇），分子式C21H20O11，ESI-MSm/z： 449.3 ［M＋H］＋。1H-NMR（300 MHz，CD3OD）δ： 7.34 （1H，s，H-2′），7.30 （1H，d，J＝8.3 Hz，H-6′），6.93 （1H，d，J＝8.3 Hz，H-5′），6.37 （1H，d，J＝2.1 Hz，H-6），6.20 （1H，d，J＝2.1 Hz，H-8），5.35 （1H，s，H-1″），0.95 （3H，d，J＝6.0 Hz，H-6″）。將該化合物進行酸水解與單糖標準品進行TLC 薄層對照，確定六元糖的化學結構是鼠李糖。根據(jù)δ：0.95 （3H，d，J＝6.0 Hz，H-6″） 的偶合常數(shù)確定糖苷鍵為α 型；13C-NMR （75 MHz，CD3OD）δ：103.5 （C-1″），73.2 （C-4″），72.1 （C-3″），72.0（C-2″），71.9 （C-5″），17.7 （C-6″），179.9 （C-4），159.5 （C-5），99.8 （C-6），166.1 （C-7），94.6 （ C-8），163.3 （ C-9），105.9 （ C-10），122.9 （ C-1′，6′），116.8 （ C-5′），116.5 （ C-2′），149.9 （C-4′），146.1 （C-3′），158.4 （C-2），136.3 （C-3）。以上數(shù)據(jù)與文獻［19］ 報道基本一致，故鑒定為槲皮素3-O-α-L-鼠李糖苷。

化合物15： 淡黃色無定形粉末（甲醇），分子式C21H22O12，ESI-MSm/z： 465.3 ［M-H］-。1HNMR （300 MHz，CD3OD）δ： 6.97 （1H，d，J＝2.0 Hz，H-2′），6.80 （1H，dd，J＝8.0，2.0 Hz，H-6′），6.77 （1H，d，J＝8.0 Hz，H-5′），5.91（1H，d，J＝2.0 Hz，H-6），5.90 （1H，d，J＝2.0 Hz，H-8），3.86 （1H，d，J＝7.5 Hz，H-1″）；13C-NMR （75 MHz，CD3OD）δ： 102.5 （C-1″），74.5 （C-2″），78.0 （C-3″），71.1 （C-4″），77.5（C-5″），62.4 （C-6″），168.9 （C-7），165.3 （C-5），164.0 （C-9），102.5 （C-10），97.3 （C-8），96.3 （ C-6），147.2 （ C-3′），146.2 （ C-4′），128.9 （ C-1′），121.1 （ C-6′），116.2 （ C-5′），115.9 （ C-2′），195.9 （ C-4），83.5 （ C-20），77.1 （C-3）。以上數(shù)據(jù)與文獻［20］ 報道基本一致，故鑒定為（2R，3R） - （＋） -蟻母樹苷。

化合物16： 淺黃色粉末 （甲醇），分子式C21H22O12，ESI-MSm/z： 465.3 ［M-H］-。1H-NMR（300 MHz，CD3OD）δ： 7.03 （1H，d，J＝2.0 Hz，H-2′），6.85 （1H，dd，J＝8.0，2.0 Hz，H-6′），6.83 （1H，d，J＝8.0 Hz，H-5′），5.96 （1H，d，J＝2.0 Hz，H-6），5.98 （1H，d，J＝2.0 Hz，H-8），3.88 （1H，d，J＝7.5 Hz，H-1″）；13C-NMR（75 MHz，CD3OD）δ： 169.1 （C-7），165.5 （C-5），164.0 （C-9），102.3 （C-10），97.3 （C-8），96.4 （ C-6），128.8 （ C-1′），116.0 （ C-2′），146.9 （ C-3′），146.0 （ C-4′），116.2 （ C-5′），121.1 （C-6′），196.1 （C-4），83.4 （C-2），77.7（C-3）； 104.6，75.4，77.9，71.4，77.8，62.7為6 個糖碳信號。以上數(shù)據(jù)與文獻［20］ 報道基本一致，故鑒定為（2S，3S） - （-） -蟻母樹苷。

化合物17： 白色無定形粉末（甲醇），分子式C28H38O13，ESI-MSm/z： 605.4 ［M＋Na］＋。1H-NMR（300 MHz，CD3OD）δ： 3.77 （3H，s，7-OCH3），3.74 （6H，s，3′，5′-OCH3），3.28 （3H，s，5-OCH3），4.26 （1H，d，J＝7.5 Hz，H-1″），6.57（1H，s，H-8），6.43 （2H，s，H-2′，6′）；13CNMR （75 MHz，CD3OD）δ： 33.8 （C-1），40.5（C-2），46.6 （C-3），42.8 （C-4），147.4 （C-5），138.8 （ C-6），148.5 （ C-7），107.7 （ C-8），130.1 （ C-9），126.3 （ C-10），134.3 （ C-1′），106.7 （C-2′，6′），148.9 （C-3′，5′），139.3 （C-4′），66.1 （C-2α），62.7 （C-3α），104.7 （C-1″），78.1 （C-3″），77.8 （C-5″），75.1 （C-2″），71.5 （ C-4″），62.7 （ C-6″），60.1 （5-OCH3），56.5 （7-OCH3），56.8 （3′，5′-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻［21］ 報道基本一致，故鑒定為（＋） -南燭木樹脂酚-3α-O-β-D-吡喃葡萄糖。

化合物18： 淡黃色粉末 （甲醇），分子式C26H34O11，ESI-MSm/z： 522.4 ［M-H］-。1H-NMR（300 MHz，CD3OD）δ： 6.76 （1H，d，J＝1.8 Hz，H-2′），6.64 （1H，d，J＝7.9 Hz，H-5′），6.62（1H，dd，J＝1.8，7.9 Hz，H-6′），6.19 （1H，s，H-5），2.07 （1H，m，H-8），4.13 （1H，d，J＝7.7 Hz，H-1″），3.81 （3H，s，6-OCH3），3.78 （3H，s，3′-OCH3）；13C-NMR （75 MHz，CD3OD）δ： 138.5 （C-1′），114.3 （C-2′），147.1（C-3′），145.2 （ C-4′），116.3 （ C-5′），123.1（C-6′），47.8 （C-7′），46.2 （C-8′），68.8 （C-9′），104.1 （C-1″），75.3 （C-2″），77.9 （C-3″），71.6 （C-4″），78.0 （C-5″），62.9 （C-6″），56.3（3′-OCH3），56.4 （ 6-OCH3），128.5 （ C-1），112.3 （ C-2），149.0 （ C-3），145.8 （ C-4），117.5 （C-5），134.3 （C-6），33.9 （C-7），39.6（C-8），65.6 （C-9）。以上數(shù)據(jù)與文獻［22］ 報道基本一致，故鑒定為（＋） -異落葉松脂素-9′-O-β-D-吡喃葡萄糖。

化合物19： 白色粉末 （甲醇），分子式C28H38O13，ESI-MSm/z： 605.4 ［M＋Na］＋。1H-NMR（300 MHz，CD3OD）δ： 3.33 （3H，s，5-OCH3），3.83 （3H，s，7-OCH3），3.75 （6H，s，3′，5′-OCH3），4.30 （1H，d，J＝7.8 Hz，H-1″），6.57（ 1H，s，H-8 ），6.43 （ 2H，s，H-2′，6′）；13C-NMR （75 MHz，CD3OD）δ： 33.6 （C-1），41.1 （C-2），46.8 （C-3），42.7 （C-4），147.6（C-5），139.0 （C-6），148.7 （C-7），107.8 （C-8），129.3 （C-9），126.0 （C-10），134.5 （C-1′），106.8 （C-2′，6′），148.7 （C-3′，5′），139.0（C-4′），68.4 （C-2α），62.8 （C-3α），104.8 （C-1″），75.1 （C-3″），78.2 （C-5″），75.1 （C-2″），78.2 （C-3″），71.6 （C-4″），77.9 （C-5″），62.8（C-6″），60.1 （5-OCH3），56.5 （7-OCH3），56.8（3′，5′-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻［23］ 報道基本一致，故鑒定為（-） -南燭木樹脂酚-3α-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物20： 淡黃色無定形粉末（甲醇），分子式C21H24O10，ESI-MSm/z： 577.9 ［M＋H］＋。與三氯化鐵-鐵氰化鉀反應呈藍色。1H-NMR （300 MHz，CD3OD）δ： 6.16 （1H，d，J＝2.1 Hz，H-3′），6.14 （1H，d，J＝2.1 Hz，H-5′），7.04 （2H，dd，J＝8.8，1.8 Hz，H-2，6），6.66 （2H，dd，J＝8.8，1.8 Hz，H-3，5），4.99 （1H，d，J＝8.1 Hz，H-1″），3.42 （2H，t，J＝7.5 Hz，H-α），2.81 （2H，t，J＝7.5 Hz，H-β）；13C-NMR （75 MHz，CD3OD）δ： 102.0 （C-1″），74.7 （C-2″），78.4 （C-3″），71.1 （C-4″），78.5 （C-5″），62.4（C-6″），206.4 （C ＝O），106.6 （C-1′），166.3（C-2′），98.4 （C-3′），167.6 （C-4′），95.5 （C-5′），162.3 （C-6′），133.9 （C-1），130.4 （C-2，6），116.1 （C-3，5），156.3 （C-4），46.9 （Cα），30.8 （C-β）。以上數(shù)據(jù)與文獻［24］ 報道基本一致，故鑒定為根皮苷。

化合物21： 白色針狀結晶（石油醚-丙酮），分子式C29H50O，沸點130 ～132 ℃，Liebermann-Burchard 反應呈陽性，使用3 種不同的展開劑與β-谷甾醇對照品對照在同一薄層板展開，具有相同的薄層行為，與β-谷甾醇對照品混合熔點保持不變，故鑒定為β-谷甾醇。

4 活性實驗

4.1 總抗氧化能力（T-AOC） 將化合物1 ～20制成濃度為3.7 mmol/L 的溶液，因試驗體系為3.7 mL，其中樣品溶液為0.1 mL，即樣品終濃度為0.1 mmol/L。按照總抗氧化能力（T-AOC） 試劑盒說明書進行樣品處理，樣品分為測定管和對照管。測定管加入1 mL 試劑一、0.1 mL 的樣品溶液、2 mL 試劑二、0.5 mL 試劑三，對照管加入1 mL試劑一、2 mL 試劑二、0.5 mL 試劑三； 渦旋混勻后，37 ℃水浴30 min 后，再分別在測定管與對照管中加0.1 mL 試劑四和0.1 mL 樣品溶液； 渦旋混勻后，室溫放置10 min，在520 nm 波長處測量吸光度（雙蒸水調零）。按下式（1） 計算總抗氧化能力，結果見表1?；衔?、9 ～10、14 ～20具有較強的總抗氧化能力。根據(jù)結構類型分析發(fā)現(xiàn)，天然酚酸類總抗氧化能力最高，黃酮類和木脂素類的總抗氧化能力次之，其他類型的化合物總抗氧化能力最弱。

表1 化合物1～20 的總抗氧化能力測定結果Tab.1 Detemination results of total antioxidant capacities of compounds 1-20

A為吸光度，T為反應時間30 min，N為樣品測試前稀釋倍數(shù)。

4.2 神經(jīng)細胞保護活性 經(jīng)MTT 法檢測發(fā)現(xiàn)，化合物2、15、17 和依達拉奉分別在10、25、50、100、200 μmol/L 對SH-SY5Y 細胞存活率無影響，化合物9 ～10 對SH-SY5Y 細胞的增殖具有促進作用，無細胞毒性，見圖1。

圖1 部分化合物和依達拉奉對SH-SY5Y 細胞生長的影響Fig.1 Effects of some compounds and edaravone on the growth of SH-SY5Y cells

經(jīng)MTT 法檢測發(fā)現(xiàn)，不同濃度H2O2（100、200、300、400、500、600 μmol/L） 處理SH-SY5Y細胞6、24 h 后，細胞存活率隨濃度增大和時間延長而減小。造模6 h 時SH-SY5Y 的存活率分別為（92.34±0.19）%、（91.04±0.20）%、（88.07±0.23）%、（77.45±0.34）%、（76.04±0.35）%、（69.62±0.41）%； 造模2 h 時SH-SY5Y 的存活率分別為 （99.62±0.11）%、（87.20±0.24）%、（83.25±0.28）%、（76.11±0.35）%、（54.62±0.56）%、（42.87±0.68）%，比對發(fā)現(xiàn)400 μmol/L的H2O2處理細胞6 h 為最優(yōu)建模條件，見圖2。

圖2 不同時間和濃度的H2O2 對SH-SY5Y 細胞的影響Fig.2 Effect of different time and concentration of H2O2 on SH-SY5Y cells

經(jīng)MTT 法檢測發(fā)現(xiàn)，模型組細胞存活率為（72.34±0.45）%，陽性對照組（依達拉奉） 在10、25、50、100、200 μmol/L 時存活率分別為（80.93±0.36）%、（83.40 ± 0.34）%、（84.31 ± 0.33）%、（86.70±0.30）%、（90.29±0.36）%，細胞存活率隨著濃度的增大而增加，見圖3。

圖3 不同濃度的依達拉奉對H2O2 誘導的SH-SY5Y 細胞損傷的影響Fig.3 Effect of edaravone at different concentration on H2O2-induced SH-SY5Y cell injury

經(jīng)MTT 法檢測發(fā)現(xiàn)，化合物2 和17 對H2O2誘導的SH-SY5Y 細胞損傷保護作用隨藥物濃度的增大而增大，但與模型組比較無顯著差異； 化合物9 和15 的最佳保護濃度分別為50、100 μmol/L，其保護作用在大于最佳濃度時作用下降； 化合物10 保護作用與藥物濃度呈正比，且同等濃度下化合物10 保護作用更強，見圖4。

圖4 部分化合物對H2O2 誘導的SH-SY5Y 細胞損傷的影響Fig.4 Effects of some compounds on H2O2-induced SH-SY5Y cell injury

綜上所述，本實驗從碧綠米仔蘭中分離得到化合物1～20，并對其進行總抗氧化能力（T-AOC）測定，發(fā)現(xiàn)天然酚酸類總抗氧化能力最高，黃酮類和木脂素類的總抗氧化能力次之。對化合物2、9～10、15、17 進行神經(jīng)細胞保護活性研究時，發(fā)現(xiàn)化合物2 和17 對H2O2誘導的SH-SY5Y 細胞損傷保護作用與藥物濃度呈正相關，但與模型組比較無顯著性差異； 化合物9 和15 對H2O2誘導的神經(jīng)細胞損傷后的保護作用的最優(yōu)保護濃度分別為50、100 μmol/L； 化合物10 保護作用與藥物濃度呈正比，且同等濃度下化合物10 保護作用更強。