杜梓萱，曹佳音，李雯婷，周逸凡，苗 水*，季 申*

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海 201203； 2.上海市食品藥品檢驗研究院國家藥品監(jiān)督管理局中藥質(zhì)量控制重點實驗室，上海 201203）

植物生長調(diào)節(jié)劑（下文簡稱“植調(diào)劑” ） 是一類具有與植物激素相似生理活性的人工合成農(nóng)藥［1］。其中矮壯素和甲哌鎓是我國普遍使用的2 種植調(diào)劑，矮壯素常被用作植物生長延緩劑，可促進(jìn)光合作用，甲哌鎓可抑制農(nóng)作物過度增長、提高產(chǎn)量，兩者均可增強植株的抗逆性［2］，但其不良影響已被廣泛研究和報道［3-4］。

矮壯素和甲哌鎓極性較大、揮發(fā)性低、無發(fā)色或熒光基團(tuán)，在酸性條件下具有熱穩(wěn)定性［5］，在紫外-可見光區(qū)沒有吸收。目前檢測方法有離子色譜法［5］、高效液相色譜法［6］、表面增強拉曼光譜法［7］等，操作繁瑣。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)可解決此問題［8-9］，可通過在流動相加入離子對試劑，如三氟乙酸［10］或七氟丁酸［11］，進(jìn)行反相柱分析。但這些試劑會導(dǎo)致電離抑制、靈敏度降低［12］、儀器污染，而親水相互作用液相色譜（HILIC） 因不需要加入離子對試劑而得到應(yīng)用［13］。課題組前期基于傳統(tǒng)QuEChERS 方法檢測74種農(nóng)藥/植調(diào)劑［14］時發(fā)現(xiàn)矮壯素和甲哌鎓的回收率低，可能是因為極性較大、易殘留于水相。

QuPPe-PO-Method 是針對植物源食品中極性農(nóng)藥殘留分析而開發(fā)出的一種快速檢測方法［15-17］。本研究參考該方法，對提取溶劑和凈化材料進(jìn)行考察，采用HILIC 模式的Amide 酰胺色譜柱及分散固相萃取材料PXA，建立了LCMS/MS 測定延胡索、板藍(lán)根和桔梗這3 種根莖類藥材中矮壯素和甲哌鎓的方法，并對多批樣品中的矮壯素和甲哌鎓殘留狀況進(jìn)行了檢測分析。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1290 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）； AB SCIEX 6500＋三重四極桿質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX公司）； 島津UV 2550 紫外光譜儀（日本島津公司）； 5810 R 離心機(jī)、移液槍（德國Eppendorf 公司）； KS 260 basic 平板振蕩儀 （德國IKA 公司）； Milli-Q 超純水器 （美國Millipore 公司）； MSU225P-1CE-DU 電子天平、SQP 電子天平（十萬分之一、萬分之一，德國Sartorius 公司）； VTX-3000L 渦旋混合儀（德國CLN Freising 公司）。

1.2 試劑與藥物 10 mol/L 甲酸銨、甲醇、乙腈（色譜純，美國Sigma 公司）； 甲酸（質(zhì)譜純，上海麥克林生化科技有限公司）； 分散固相萃取 （dSPE） 凈化粉末PXA、SAX、反相硅膠鍵合吸附劑C18（北京迪科馬科技有限公司）； 矮壯素（純度99.0%）、甲哌鎓（純度99.0%）、矮壯素同位素內(nèi)標(biāo) （純度99.0%） 對照品 （德國Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司）。收集32 批延胡索、32 批板藍(lán)根和12 批桔梗藥材，均由上海市食品藥品檢驗研究院中藥天然藥物所楊新華主管藥師鑒定為正品，均粉碎、過3 號篩。

2 方法

2.1 對照品溶液制備 精密稱取各對照品10 mg 于10 mL量瓶中，用1%甲酸甲醇溶解，稀釋至刻度，制成1 mg/mL的對照品儲備溶液，-20 ℃冰箱保存。用1%甲酸甲醇稀釋制成10 μg/mL 的對照品溶液。內(nèi)標(biāo)化合物氘代矮壯素的內(nèi)標(biāo)儲備液和稀釋內(nèi)標(biāo)溶液同法制備。

2.2 供試品溶液制備 提取： 對多批延胡索、板藍(lán)根和桔梗進(jìn)行篩查，分別找出矮壯素和甲哌鎓陽性的藥材和空白藥材。稱取藥材粉末2 g，置50 mL 聚苯乙烯離心管中，加入10 mL 超純水，搖散，加入10 μg/mL 內(nèi)標(biāo)溶液125 μL，加入10 mL 1% 甲酸甲醇溶液，500 次/min 振蕩15 min，-20 ℃下冷凍凈化30 min，于4 ℃下3 900 r/min 離心15 min。

凈化： 精密量取10 mL 上清液置于含500 mg dSPE PXA 粉末的15 mL 聚丙烯離心管中，500 次/min 振蕩15 min，于4 ℃下3 900 r/min 離心15 min，取上清液2 mL 過0.22 μm 的PTFE、PES 或Nylon 微孔濾膜，取0.8 mL 濾液置于液相小瓶中，加入0.2 mL 的1%甲酸甲醇-水（1 ∶1）溶液，3 000 r/min 渦旋1 min 混合均勻，即得。

2.3 分析條件

2.3.1 色譜 Waters XBridge? BEH Amide （3.0 mm×100 mm，2.5 μm） 色譜柱； 流動相水（含50 mmol/L 甲酸銨，甲酸調(diào)至pH ＝3） （A） -乙腈（B），梯度洗脫（0 ～0.5 min，97%B； 0.5～4 min，97% ～70% B； 4 ～5 min，70% ～50%B； 5～6 min，50%B； 6～6.1 min，50% ～97%B； 6.1～10 min，97%B）； 體積流量0.4 mL/min； 柱溫35 ℃； 進(jìn)樣量1 μL。

2.3.2 質(zhì)譜 電噴霧離子源（ESI）； 正離子模式； 多反應(yīng)監(jiān)測模式； 電噴霧電壓5 500 V； 霧化氣壓力344.75 kPa；輔助加熱氣壓力379.23 kPa； 氣簾氣壓力275.80 kPa； 碰撞氣壓力55.16 kPa； 離子源溫度500 ℃； 掃描時間0.3 s；碰撞室入口電壓10 V； 碰撞室出口電壓12 V。為了校正操作過程誤差，采用同位素內(nèi)標(biāo)法定量，以矮壯素-d4 作為內(nèi)標(biāo)。主要質(zhì)譜參數(shù)見表1，總離子流圖見圖1。

圖1 各成分總離子流圖（2 μg/L）

表1 各成分主要質(zhì)譜參數(shù)

3 結(jié)果

3.1 提取方法選擇 采用矮壯素和甲哌鎓陽性延胡索藥材進(jìn)行提取條件的考察。選取1%甲酸乙腈-水（1 ∶9）、1%甲酸乙腈-水（3 ∶7）、1%甲酸乙腈-水（5 ∶5）、1%甲酸乙腈-水（7 ∶3）、1%甲酸甲醇-水（1 ∶9）、1% 甲酸甲醇-水（3 ∶7）、1% 甲酸甲醇-水（5 ∶5）、1% 甲酸甲醇-水（7 ∶3） 作為提取溶劑，室溫下500 次/min 振蕩提取15 min?？瞻姿幉囊韵鄳?yīng)方法提取得到藥材基質(zhì)溶液，并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行準(zhǔn)確定量。以矮壯素和甲哌鎓的提取量作為考察指標(biāo)，結(jié)果見圖2?？芍?，1%甲酸甲醇-水（5 ∶5） 同時對矮壯素和甲哌鎓具有最好的提取效果，故選擇該溶劑作為提取溶劑進(jìn)行后續(xù)實驗。本實驗參考?xì)W盟QuPPe 標(biāo)準(zhǔn)，在提取溶劑中加入少量甲酸有利于矮壯素和甲哌鎓質(zhì)子化或解離。

圖2 不同提取溶劑對植調(diào)劑的提取結(jié)果（n＝4）

3.2 凈化條件選擇 根據(jù)前期結(jié)果，矮壯素和甲哌鎓這類極性較強的離子型化合物，適用以陰離子交換為原理的分散固相萃取凈化材料，故重點考察以強陰離子交換為原理的SAX、以混合型陰離子交換為原理的PXA 及常用的反相硅膠鍵合吸附劑C18。SAX 為硅膠鍵合季銨基團(tuán)的吸附劑，PXA 為含親水基團(tuán)的聚苯乙烯/二乙烯基苯共聚物上鍵合季銨基團(tuán)，均可用于含水樣品、生物體液以及有機(jī)相中陰離子化合物的純化。C18對非極性、弱極性以及中等極性化合物均有廣泛保留，是目前分散固相萃取中應(yīng)用最廣的吸附劑。

按照“2.2” 項下方法制備藥材提取液，精密量取10 mL 分別加入含有500 mg C18、500 mg SAX、500 mg PXA 分散固相萃取凈化粉末的離心管中，500 次/min 振蕩15 min，于4 ℃下3 900 r/min 離心15 min，取上清液2 mL 過0.22 μm 的PTFE、PES 或Nylon 微孔濾膜。延胡索取0.5 mL 濾液，加10 mL 1%甲酸甲醇-水（1 ∶1） 稀釋，板藍(lán)根和桔梗取1 mL 濾液，加10 mL 1%甲酸甲醇-水（1 ∶1） 稀釋，均3 000 r/min 渦旋1 min，混合均勻，即得供試品溶液，紫外光譜法檢測。以不同材料對藥材的凈化效果為考察指標(biāo)，結(jié)果見圖3?？芍?，3 種凈化材料對藥材提取液的凈化效果從高到低依次為PXA、SAX、C18。3 種藥材的提取溶液在PXA 下均得到不錯的凈化效果，并考慮到方法的普適性，故選擇PXA 作為凈化材料。

圖3 紫外光譜下不同凈化材料對3 種藥材的凈化結(jié)果

3.3 方法學(xué)考察

3.3.1 基質(zhì)效應(yīng)、線性范圍、定量限與檢出限 根據(jù)SANTE 11312/2021［18］，在LC-MS/MS 分析中，使用共提取基質(zhì)組分分析待測物是基質(zhì)效應(yīng)（ME） 的主要原因。采用延胡索、板藍(lán)根和桔?？瞻姿幉慕⒑幉幕|(zhì)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用“加標(biāo)提取法” 對ME 進(jìn)行評價。用外標(biāo)法分別建立含藥材基質(zhì)的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線和不含藥材基質(zhì)的溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線（權(quán)重1/X），制備過程見表2，不含藥材基質(zhì)的溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線建立時將其藥材基質(zhì)替換為1%甲酸甲醇-水（1 ∶1） 即可。不同藥材間比較基質(zhì)效應(yīng)ME，公式為。計算得到的矮壯素和甲哌鎓在3 種藥材中的基質(zhì)效應(yīng)的絕對值見圖4。由于ME 值均大于20%，故采用含基質(zhì)溶劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線和同位素內(nèi)標(biāo)進(jìn)行分析。

圖4 延胡索、板藍(lán)根和桔?；|(zhì)效應(yīng)絕對值（n＝3）

表2 含基質(zhì)溶劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線制備（n＝3）

為保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，采用內(nèi)標(biāo)法建立含藥材基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算藥材中矮壯素和甲哌鎓的含量。制備過程見表2，在1～400 μg/L （1、2、5、10、50、100、200、300、400 μg/L） 范圍內(nèi)測定9 個濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。以待測成分與內(nèi)標(biāo)的濃度比為橫坐標(biāo)（X），以峰面積比為縱坐標(biāo)（Y） （權(quán)重： 1/X），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，結(jié)果見表3?？芍?，藥材基質(zhì)中各成分在一定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.998。

表3 各植調(diào)劑線性關(guān)系（n＝3）

3.3.2 準(zhǔn)確度與精密度試驗 按照“2.2” 項下方法，從低到高分別制備4 種加樣水平（20、100、500、1 000 μg/kg）的溶液（n＝3）。用內(nèi)標(biāo)法建立的含基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算回收率。連續(xù)進(jìn)樣4 個水平的樣品溶液3 d，根據(jù)峰面積計算日內(nèi)和日間的精密度。各藥材中待測物的平均回收率、日內(nèi)和日間精密度見表4。各濃度水平下待測成分的平均加樣回收率分別為95.9% ～105.0% （延胡索）、83.2% ～103.7%（板藍(lán)根）、76.7% ～101.9% （桔梗）。3 種藥材的日內(nèi)精密度均小于5.7%，日間精密度均小于6.2%。

表4 各植調(diào)劑的平均加樣回收率、日內(nèi)和日間精密度（n＝3）

3.4 樣品檢測 應(yīng)用新建方法對32 批延胡索（編號分別為YHS1-YHS32）、32 批板藍(lán)根 （編號分別為 BLG1-BLG32）、12 批桔梗（編號分別為JG1-JG12） 進(jìn)行檢測，不同批次藥材之間進(jìn)樣空白溶劑，以確保不存在交叉污染。結(jié)果延胡索、板藍(lán)根和桔梗中矮壯素的檢出范圍分別為31.7～86.9、20.5 ～12 094.8、91.8 ～109.7 μg/kg，檢出率分別為12.5%、87.5%、91.7%； 延胡索中甲哌鎓的檢出范圍為20.4～3 382.9 μg/kg，檢出率為28.1%； 板藍(lán)根和桔梗中未檢出甲哌鎓，見圖5。

圖5 樣品中植調(diào)劑檢測結(jié)果（n＝3）

目前，延胡索、板藍(lán)根和桔梗中矮壯素和甲哌鎓的最大殘留限量（MRL） 在GB 2763—2021 中并未明確規(guī)定，矮壯素在大麥等中的MRL 為2 000～10 000 μg/kg，甲哌鎓在小麥中的MRL 為500 μg/kg。參考?xì)W洲委員會法規(guī)No.396/2005 歐洲農(nóng)藥數(shù)據(jù)庫［19］，矮壯素和甲哌鎓在甘草、姜黃等中的MRL 均為50 μg/kg； 參考聯(lián)合國糧農(nóng)組織的國際食品標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)藥數(shù)據(jù)庫［20］，矮壯素在小麥等中的MRL 為2 000～6 000 μg/kg； 甲哌鎓無相關(guān)MRL。參考美國環(huán)境保護(hù)署聯(lián)邦法規(guī)［21-22］，矮壯素在燕麥、小麥等中的MRL 為2 000～40 000 μg/kg，甲哌鎓在棉花中的MRL 為2 000 μg/kg。

由圖5 可知，在延胡索、板藍(lán)根和桔梗部分樣品中檢出矮壯素，其中矮壯素含量及檢出率較高的為板藍(lán)根和桔梗。國家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的《中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》（2022 年第22 號） 附件中規(guī)定“禁止使用壯根靈、膨大素等生長調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)中藥材收獲器官生長”［23］。課題組在暗訪河南、安徽、山東等地的板藍(lán)根和延胡索種植基地發(fā)現(xiàn)，很多種植戶盲目地噴灑矮壯素等促進(jìn)根莖膨大的植調(diào)劑，快速促進(jìn)藥用部位生長，大幅縮短藥材的種植周期，甚至使藥材性狀發(fā)生了變化，可不同程度地影響中藥材的品質(zhì)。從分析的多批根莖類藥材中也可看出，矮壯素和甲哌鎓在中藥材種植過程中濫用較為明顯。

4 結(jié)論

本研究建立了QuPPe-LC-MS/MS 法同時測定3 種根莖類藥材中的矮壯素和甲哌鎓的殘留量?；?%甲酸甲醇-水（1 ∶1） 的提取體系，可以最大程度地提取藥材中的目標(biāo)化合物，同時利用分散固相萃取PXA 粉末，方便快捷且同時達(dá)到凈化藥材提取液和保持待測化合物較高回收率的目的。根據(jù)歐盟指南，從ME、線性關(guān)系、LOQ、LOD、準(zhǔn)確度和精密度等方面驗證了本研究新建方法的可行性。該方法符合指南的要求，可用于中藥樣品中矮壯素和甲哌鎓的殘留檢測。本研究為對極性較強的水溶性植調(diào)劑檢測的進(jìn)一步探索，為規(guī)范延胡索、板藍(lán)根和桔梗人工種植中植調(diào)劑的施用及保障藥材質(zhì)量與安全提供技術(shù)支持。