于海羅，肖調(diào)義，駱?biāo)囄?，王紅權(quán)，任 為，葉利海，章燕鈴

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南省特色水產(chǎn)資源利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410128；2.武漢正大水產(chǎn)有限公司，湖北 武漢 430070)

肌酸在機(jī)體能量代謝中發(fā)揮重要作用，其磷酸肌酸形式可提供高能磷酸鍵供二磷酸腺苷(ADP)生成三磷酸腺苷(ATP)，維持ATP 動(dòng)態(tài)平衡。肌酸可在機(jī)體內(nèi)自行合成，也可外源添加，但肌酸在飼料添加過程中存在不穩(wěn)定性。甘氨酸與L-精氨酸在精氨酸-甘氨酸脒基轉(zhuǎn)移酶(AGAT)作用下生成胍基乙酸(GAA)和鳥氨酸。GAA 是肌酸的合成前體物質(zhì)，GAA 在胍基乙酸脒基轉(zhuǎn)移酶(GAMT)作用下生成肌酸[1]。GAA 性質(zhì)穩(wěn)定，因此常用GAA 作為肌酸的補(bǔ)充源[2]。飼料中添加GAA 在畜禽上應(yīng)用廣泛，大量研究表明GAA 可以提高動(dòng)物的生長性能[3-5]，改善肌肉品質(zhì)和提高抗氧化能力[6-7]。目前GAA 在水產(chǎn)方面的研究報(bào)道相對(duì)較少，集中在眼斑擬石首魚(Sciaenops ocellatus)、美洲牛蛙(Lithobates catesbeianus)、草魚(Ctenopharygodon idella)和尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)[8-12]等種類，未見有關(guān)于GAA 對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰 (Ictalurus punctatus)生長、抗氧化能力及能量代謝影響的報(bào)道。

斑點(diǎn)叉尾鮰屬鲇形目(Siluriformes) 鮰科(Ictaluridae)，原產(chǎn)于北美洲大陸，分布范圍從加拿大南部到墨西哥北部，1984 年由湖北省水產(chǎn)科學(xué)研究所引進(jìn)至中國[13]。據(jù)2021 中國漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒數(shù)據(jù)顯示，斑點(diǎn)叉尾鮰2020 年養(yǎng)殖產(chǎn)量約30.85 萬t，加工量約為4.65 萬t，斑點(diǎn)叉尾鮰已逐漸成為消費(fèi)者喜愛的經(jīng)濟(jì)魚類。但近年來消費(fèi)者對(duì)魚肉品質(zhì)要求在不斷提高，而不同養(yǎng)殖模式[14]、飼料料型[15]以及暫養(yǎng)環(huán)境[16]等都會(huì)對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰肌肉品質(zhì)產(chǎn)生影響，因此改善斑點(diǎn)叉尾鮰肌肉品質(zhì)尤為重要。因此，本實(shí)驗(yàn)將驗(yàn)證GAA 對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰的生長性能、肌肉品質(zhì)、抗氧化能力和能量代謝的影響，以期為GAA 在水產(chǎn)上應(yīng)用提供更多參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 飼料配方與制作

實(shí)驗(yàn)飼料以國產(chǎn)魚粉、豬肉粉、豆粕和菜粕為蛋白源，豆油和魚油為脂肪源，面粉為糖源(原料均由武漢正大水產(chǎn)有限公司提供)。在基礎(chǔ)飼料中添加0、300、600 和900 mg/kg GAA(有效含量≥95%，湖北景瑞天恒生物科技有限公司)，配制成4 種等能等氮的實(shí)驗(yàn)飼料，基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)成分見表1。實(shí)驗(yàn)飼料在武漢正大水產(chǎn)有限公司研發(fā)中心實(shí)驗(yàn)室制作，所有原料粉碎后經(jīng)60 目分級(jí)篩，按配比混勻，少量組分逐級(jí)擴(kuò)大法混合，經(jīng)熟化和烘干制成直徑1.8 mm 的實(shí)驗(yàn)飼料，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 基礎(chǔ)飼料配方及常規(guī)成分(干物質(zhì))Tab.1 Formulation and proximate composition of the basal diet (air-dry basis) %

1.2 實(shí)驗(yàn)管理

實(shí)驗(yàn)斑點(diǎn)叉尾鮰由武漢正大水產(chǎn)有限公司提供，養(yǎng)殖地點(diǎn)為武漢正大水產(chǎn)有限公司實(shí)驗(yàn)車間。將實(shí)驗(yàn)斑點(diǎn)叉尾鮰置于網(wǎng)箱(2 m×2 m×1.6 m)中暫養(yǎng)2 周，暫養(yǎng)期間使用武漢正大水產(chǎn)有限公司專用斑點(diǎn)叉尾鮰料，每天分別在6: 30 和18: 00 飽食投喂進(jìn)行馴食。馴食完成后禁食24 h，挑選健康斑點(diǎn)叉尾鮰至體積為1 000 L 的實(shí)驗(yàn)桶中，24 h 后開始投喂實(shí)驗(yàn)料。實(shí)驗(yàn)共設(shè)4 個(gè)處理組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30 尾斑點(diǎn)叉尾鮰。養(yǎng)殖期間每天分別在6: 30 和18: 00飽食投喂；采用連續(xù)流水養(yǎng)殖，水源經(jīng)沙濾、曝氣和消毒，連續(xù)增氧保持溶解氧7.0 mg/L 以上；pH7.5～8.2，水溫25～30℃；水質(zhì)氨氮低于0.02 mg/L，亞硝酸鹽低于0.01 mg/L。光照為自然光源，養(yǎng)殖周期為8 周。本研究獲得了湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，過程中操作人員嚴(yán)格遵守湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)倫理規(guī)范，并按照湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)倫理委員會(huì)制定的規(guī)章制度執(zhí)行。

1.3 樣品制備與分析

生長性能與飼料利用 養(yǎng)殖結(jié)束時(shí)將斑點(diǎn)叉尾鮰饑餓24 h，對(duì)所有斑點(diǎn)叉尾鮰稱重并計(jì)數(shù)，計(jì)算增重率、成活率和飼料系數(shù)；每桶隨機(jī)取14尾吸干體表水分測(cè)量體重和體長，計(jì)算肥滿度；其中10 尾解剖取內(nèi)臟和肌肉，分別計(jì)重后將肝臟和肌肉保存于-80℃?zhèn)溆?；剩? 尾用于分析體常規(guī)營養(yǎng)成分。

全魚和飼料常規(guī)營養(yǎng)成分測(cè)定 采用乙醚抽提法(GB/T 6433—1994)測(cè)定全魚的粗脂肪，采用凱氏定氮法(GB/T 6432—1994)測(cè)定粗蛋白，采用馬弗爐550 °C 灼燒法(GB/T 6438—1992)測(cè)定粗灰分，采用105℃烘干恒重法測(cè)定水分含量。

組織的酶活性和肌糖原含量測(cè)定 肝臟或肌肉酶活性指標(biāo)和肌糖原含量測(cè)定，均使用南京建成生物工程研究所試劑盒測(cè)定。測(cè)定方法：肝臟總抗氧化能力(T-AOC，ABTS 法)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px，比色法)、丙二醛(MDA)TBA 法)、超氧化物歧化酶(SOD，羥胺法)、過氧化氫酶(CAT，比色法)、丙酮酸激酶(PK，紫外比色法)、琥珀酸脫氫酶(SDH，比色法)、肌酸激酶(CK，比色法)、羥脯氨酸(HYP，堿水解法)、肌糖原(比色法)，具體操作步驟參照說明書進(jìn)行。

肌肉氨基酸和脂肪酸測(cè)定 取肌肉樣品2.5 g，用鹽酸勻漿、超聲浸提等方法，使用氨基酸分析儀(L8900 日立)測(cè)定肌肉氨基酸組成。取肌肉樣品0.5 g 置于50 mL 離心管中，加入苯-石油醚混合溶劑密閉浸提，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(安捷倫7890A/5975C)測(cè)定脂肪酸組成。

1.4 計(jì)算公式

各個(gè)指標(biāo)計(jì)算公式：

式中，W0為體重(g)，W1為初始體重(g)，W2為終末體重(g)，Ct為每桶累計(jì)耗用飼料總重(g)，Lb為體長(cm)，Lw為肝臟重量(g)，Cw為內(nèi)臟重量(g)，Wf為腹部脂肪重量(g)，t為養(yǎng)殖周期(d)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用IBM SPSS 22.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，用Tukey 多重比較組間均值差異，P<0.05 表示差異顯著；數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示。

2 結(jié)果

2.1 飼料中GAA 水平對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰生長及飼料利用的影響

添加GAA 可顯著影響斑點(diǎn)叉尾鮰的形體指標(biāo)，與對(duì)照組相比，VSI 和IPF 在GAA300 組有下降趨勢(shì)(P>0.05)，隨著GAA 添加量的增加而升高，與GAA300 組相比，GAA900 組斑點(diǎn)叉尾鮰VSI 和IPF 顯著升高(P<0.05)(表2)。飼料中添加GAA 對(duì)FBW、WGR、SGR、FCR、HSI、CF和SR 無顯著影響(P>0.05)，F(xiàn)BW 和WGR 在GAA300 組最高(表2)。以IPF 為指標(biāo)通過二次函數(shù)分析，獲得最適IPF 的GAA 添加量為275 mg/kg(圖1)；以VSI 為指標(biāo)通過二次函數(shù)分析，獲得最適VSI 的GAA 添加量為150 mg/kg(圖2)。

圖1 飼料中GAA 水平對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰腹脂率的影響Fig.1 Effect of different dietary GAA supplementation on IPF of I.punctatus

圖2 飼料中GAA 水平對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰臟體比的影響Fig.2 Effect of different dietary GAA supplementations on VSI of I.punctatus

表2 飼料中GAA 水平對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰生長和飼料利用的影響Tab.2 Effect of different dietary GAA supplementation on growth performance and feed utilization of I.punctatus

2.2 飼料中GAA 水平對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰肌肉品質(zhì)的影響

添加GAA 對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰全魚水分、粗蛋白、粗脂肪和粗灰分含量均無顯著影響(P>0.05)(表3)。肌糖原含量隨著GAA 添加水平的增加有升高趨勢(shì)(P>0.05)；各添加組羥脯氨酸(HYP)含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(表4)。飼料GAA 水平對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰肌肉中游離氨基酸(表5)和脂肪酸(表6)含量均無顯著影響(P>0.05)。

表3 飼料中GAA 水平對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰體成分的影響Tab.3 Effect of different dietary GAA supplementation on body nutritional composition of I.punctatus

表4 飼料中GAA 水平對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰肌肉糖原和羥脯氨酸含量的影響Tab.4 Effect of different dietary GAA supplementation on glycogen and hydroxyproline in muscle of I.punctatus

表5 飼料中GAA 水平對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰肌肉氨基酸組成的影響Tab.5 Effect of different dietary GAA supplementation on free amino acid composition in muscle of I.punctatus (dry matter) μg/g

表6 飼料中GAA 水平對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰肌肉脂肪酸含量的影響Tab.6 Effect of different dietary GAA supplementation on the fatty acid (FA) of total FA in muscle of I.punctatus %

2.3 飼料中GAA 水平對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

添加GAA 顯著影響斑點(diǎn)叉尾鮰肝臟T-AOC、MDA 和SOD 抗氧化指標(biāo)(P<0.05)。GAA300 組T-AOC 顯著高于其他組(P<0.05)，其他組間無顯著差異(P>0.05)；與對(duì)照組相比，MDA 含量在GAA600 組顯著升高，在GAA900 組達(dá)到最大(P<0.05)；與對(duì)照組相比，GAA300 組和GAA600 組的SOD 活性顯著升高(P<0.05)，GAA900 組SOD 活性有升高趨勢(shì)(P>0.05)；各組間的GSHPx 和CAT 活性無顯著差異(P>0.05)，GSH-Px 活性在GAA300 組最高(表7)。

表7 飼料中GAA 水平對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰肝臟抗氧化指標(biāo)的影響Tab.7 Effect of different dietary GAA supplementation on hepatic antioxidant indices of I.punctatus

2.4 飼料中GAA 水平對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰肌肉能量代謝酶酶活的影響

隨著GAA 添加水平增加，肌肉CK 酶活性呈先上升后下降的趨勢(shì)，但各組間無顯著差異(P>0.05)；與對(duì)照組相比，肌肉中SDH 酶活性在GAA300 組顯著升高(P<0.05)；肌肉PK 酶活性隨GAA 添加水平的增加先上升后下降，其中GAA300 組和GAA600 組的PK 酶活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(表8)。

表8 飼料中GAA 水平對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰肌肉能量代謝酶的影響Tab.8 Effect of different dietary GAA supplementation on the activities of muscle energy enzymes of I.punctatus

3 討論

3.1 飼料中GAA 水平對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰生長性能的影響

研究表明，適宜的精氨酸可促進(jìn)生長[17]。GAA 由甘氨酸和L-精氨酸合成，添加外源性GAA 可作為精氨酸的有效替代物，促進(jìn)精氨酸用于蛋白質(zhì)合成代謝、信號(hào)傳導(dǎo)和激素釋放等；同時(shí)可直接提高磷酸肌酸ATP 值，提供更多ATP促進(jìn)肌纖維發(fā)育，改善動(dòng)物的生長性能[18]。但在本研究中添加GAA 對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰生長并無顯著的促進(jìn)作用，這與已有研究結(jié)果一致。洑琴等[19]在飼料中添加250、500 和1 000 mg/kg GAA 對(duì)建鯉(Cyprinus carpiovar.jian) FBW、SGR 和WGR均無改善作用。Stites 等[8]在眼斑擬石首魚飼料中添加GAA(0、5 和10 g/kg)和肌酸(0 和20 g/kg)發(fā)現(xiàn)，添加GAA 對(duì)FBW 和WGR 無促進(jìn)作用；但Lin 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，添加0.4 g/kg GAA 可顯著提高美洲牛蛙生長性能，造成這些結(jié)果差異可能的原因是不同的養(yǎng)殖動(dòng)物對(duì)精氨酸的需求量不同。有研究表明精氨酸可調(diào)節(jié)脂肪組織和肌肉組織之間的脂質(zhì)分布[20]。本研究中，隨著GAA 添加水平增加，斑點(diǎn)叉尾鮰IPF 呈現(xiàn)先下降后上升趨勢(shì)，在添加300 mg/kg 組最低。以IPF 為指標(biāo)通過二次函數(shù)分析，獲得最適IPF 的GAA 添加量為275 mg/kg，說明添加適量的GAA 可有效減少腹腔脂肪蓄積，間接調(diào)節(jié)脂質(zhì)分布。

3.2 飼料中GAA 水平對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰肌肉品質(zhì)的影響

膠原蛋白是反映肌肉品質(zhì)的重要指標(biāo)，膠原蛋白及其交聯(lián)結(jié)構(gòu)與肌肉硬度和質(zhì)地有關(guān)，魚類研究表明肌肉中膠原蛋白含量與硬度成正比[21]。李乃順等[22]研究綠原酸對(duì)草魚(Ctenopharyngodon idella)生長及肉質(zhì)的影響中也指出，當(dāng)添加量為0.02%時(shí)可顯著提高肌肉中膠原蛋白的含量，從而改善肌肉品質(zhì)。羥脯氨酸是膠原蛋白特有的氨基酸，補(bǔ)充適量羥脯氨酸可幫助體內(nèi)膠原蛋白的重建。劉云正[23]研究發(fā)現(xiàn)，高植物蛋白替代魚粉后添加羥脯氨酸對(duì)大菱鲆(Scophthalmus maximus)幼魚生長的影響，表明添加40 I 和50 I 羥脯氨酸可以顯著提高肌肉羥脯氨酸和膠原蛋白含量。本研究中，添加300～900 mg/kg GAA 可顯著提高肌肉羥脯氨酸含量，從而提高肌肉中膠原蛋白含量，改善肌肉品質(zhì)。動(dòng)物肌肉停止供氧后，通過無氧酵解產(chǎn)生乳酸導(dǎo)致pH 降低，進(jìn)而影響肉色、系水力等[1]。添加GAA可直接提高磷酸肌酸ATP 值，降低肌糖原作為能源物質(zhì)的分解，緩解肌肉無氧酵解和降低乳酸含量，從而改善肌肉品質(zhì)，所以肌糖原含量也可作為肌肉品質(zhì)評(píng)價(jià)指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中添加GAA 后，肌肉中肌糖原含量均有提高，有助于提升斑點(diǎn)叉尾鮰肌肉品質(zhì)。Yang 等[10]在植物蛋白飼料中添加0、150、300、450 和600 mg/kg GAA，通過60 d 養(yǎng)殖發(fā)現(xiàn)，添加300 mg/kg 組可顯著提高肌肉中EPA 和DHA 含量，并對(duì)游離氨基酸中必需氨基酸和氨基酸總量產(chǎn)生顯著影響。本實(shí)驗(yàn)中，添加GAA 對(duì)肌肉游離氨基酸和脂肪酸均無影響，可能是與養(yǎng)殖品種和養(yǎng)殖周期相關(guān)，具體原因還需進(jìn)一步研究。

3.3 飼料中GAA 水平對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

動(dòng)物機(jī)體抗氧化酶系包括SOD、GSH-Px、CAT 等，T-AOC 是反映機(jī)體總抗氧化機(jī)能的指標(biāo)。SOD 能夠清除細(xì)胞中多余的自由基()，抵抗過氧化物攻擊而保護(hù)細(xì)胞；GSH-Px 催化過氧化氫分解，降低過氧化物的含量，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整性，使機(jī)體不受氧化損害；CAT 將過氧化氫催化分解成水，解除自由基氧化造成的損害[24]。耿凱等[25]在育肥豬飼料中添加0.5% GAA 中藥制劑發(fā)現(xiàn)，添加0.5% GAA 中藥制劑可顯著提高肝臟T-AOC、SOD 和GSH-Px 含量，提高育肥豬的抗氧化能力。王子苑等[26]在肉?；A(chǔ)飼料中分別添加400 和800 mg/kg GAA，結(jié)果表明，添加400 mg/kgGAA 可顯著提高肝臟T-AOC 和內(nèi)源性抗氧化酶SOD、GSH-Px 酶活性，提高機(jī)體抗氧化能力。Zeng 等[27]發(fā)現(xiàn)，植物蛋白飼料中分別添加0.2、0.4、0.6 和0.8 g/kg GAA 對(duì)美國牛蛙(Rana catesbeiana)生長及抗氧化性能的影響，表明0.4～0.6 g/kg 組血清T-AOC 顯著高于對(duì)照組，CAT 與添加量呈正相關(guān)，在0.8 g/kg 添加量時(shí)達(dá)到最大值。本研究中，添加300 mg/kg GAA 可顯著提高斑點(diǎn)叉尾鮰肝臟T-AOC 和SOD 水平，分析可能是斑點(diǎn)叉尾鮰攝入適量GAA 有助于提高肌酸和磷酸肌酸含量，肌酸具有直接抗氧化作用，磷酸肌酸可抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)抗氧化酶系統(tǒng)[24]；當(dāng)GAA 添加量為600～900 mg/kg 時(shí)，斑點(diǎn)叉尾鮰肝臟抗氧化能力反而降低，可能是添加過量導(dǎo)致GAA 代謝紊亂或化合物大量積累，GAA 表現(xiàn)為強(qiáng)氧化劑，并誘導(dǎo)氧化應(yīng)激[28]，從本實(shí)驗(yàn)MDA 變化推測(cè)高劑量GAA 可導(dǎo)致斑點(diǎn)叉尾鮰呈氧化應(yīng)激狀態(tài)。

3.4 飼料中GAA 水平對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰能量代謝關(guān)鍵酶的影響

CK 將磷酸肌酸上磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到ADP 后合成ATP，因此肌酸激酶在能量代謝中起重要作用[1]；SDH 參與三羧酸循環(huán)，間接反映線粒體功能和組織供氧情況[18]。Azizaa 等[12]在尼羅羅非魚飼料中添加0.12%和0.18% GAA 均能顯著提高CK 活性；Lin 等[9]也證實(shí)添加0.4 和4 g/kg GAA 可顯著提高CK 活性。本實(shí)驗(yàn)中添加300～900 mg/kg GAA較對(duì)照組CK 活性和肌糖原含量均有提高趨勢(shì)，說明添加GAA 可能有助于減少糖類物質(zhì)分解，更多以糖原形式儲(chǔ)能。PK 是糖酵解限速酶之一，將磷酸烯醇式丙酮酸催化成丙酮酸并伴隨有ATP 生成，可反映糖酵解水平。本實(shí)驗(yàn)研究表明添加300 mg/kg GAA 顯著提高PK 活性，與前述部分研究證實(shí)GAA 可提高肌糖原含量的結(jié)果相對(duì)應(yīng)，說明添加GAA 可促進(jìn)糖酵解和能量代謝。這與李潔蕾等[29]研究結(jié)果一致；而王子苑等[26]在肉牛飼料中添加400 mg/kg GAA 和洑琴等[19]在建鯉飼料中添加250～1 000 mg/kg GAA 均顯著降低了PK 活性，推測(cè)可能是與養(yǎng)殖動(dòng)物種類相關(guān)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)條件下，斑點(diǎn)叉尾鮰飼料中添加適量的GAA(150～300 mg/kg)能降低腹部脂肪和臟體比，提高肝臟抗氧化能力和肌肉能量代謝。

（作者聲明本文無實(shí)際或潛在的利益沖突）