鄭雨欣,丁榆德,陳 楓,楊 帆

引導(dǎo)組織再生(guided tissue regeneration,GTR)在1976年由Melcher第一次提出,是一種能有效促進(jìn)牙周附著再生的技術(shù)[1]。在此基礎(chǔ)上,Buser等[2]于1993年又進(jìn)一步提出了引導(dǎo)骨再生(guided bone regeneration,GBR),從此開啟了種植骨再生領(lǐng)域的新篇章。在引導(dǎo)牙周組織或骨組織再生的過程中,屏障膜作為再生過程的必要條件之一,是目前研究的熱點(diǎn)。其中絲素蛋白(silk fibroin,SF)具有良好的生物相容性、優(yōu)異的強(qiáng)度和韌性以及可調(diào)節(jié)的降解率,備受關(guān)注[3-4]。

本文對(duì)絲素蛋白作為屏障材料在口腔組織再生方面的國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)作一綜述,探討絲素蛋白屏障材料在GTR/GBR中的研究現(xiàn)狀及前景。

1 GTR與GBR屏障膜

1.1 GTR

牙周炎作為臨床上最常見、最具破壞力的口腔疾病,最主要表現(xiàn)為牙周支持組織的喪失[5]。而GTR作為牙周組織再生的重要手段,是目前治療牙周炎的主要方式之一[6]。GTR治療主要使用屏障膜選擇性地引導(dǎo)目標(biāo)細(xì)胞增殖,阻止封閉環(huán)境外的牙齦上皮和結(jié)締組織的長(zhǎng)入,有利于牙周膜細(xì)胞遷移到牙周缺損部位,促進(jìn)新的組織和骨的形成,形成新的附著[7]。顯然,其中屏障膜的選擇和應(yīng)用是牙周再生的關(guān)鍵。因此,選擇和研發(fā)合適特性的屏障膜材料在牙周再生中尤為重要。

1.2 GBR

種植牙自1965年Br?nemark教授首次實(shí)施以來(lái),已成為口腔醫(yī)師修復(fù)缺失牙的首選[8]。其中,充足的骨量是種植成功的關(guān)鍵。但研究統(tǒng)計(jì)顯示,上前牙區(qū)常見牙槽骨骨量不足或骨質(zhì)欠佳,約90%患者存在頰側(cè)骨壁缺失或變薄的現(xiàn)象,需要在種植手術(shù)前施行骨增量手術(shù)[9-10]。

GBR作為臨床治療上應(yīng)用最廣泛的骨增量術(shù)式,其基本原理與GTR類似,通過屏障膜形成一個(gè)封閉環(huán)境,阻止該區(qū)域外的成纖維細(xì)胞及上皮細(xì)胞長(zhǎng)入,保證負(fù)責(zé)骨重建的成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞優(yōu)先定植,從而實(shí)現(xiàn)骨組織再生[11]。而對(duì)具有阻擋目標(biāo)細(xì)胞、維持成骨空間作用的屏障膜的研究,目前已成為GBR發(fā)展的關(guān)鍵之一。

1.3 屏障膜

目前國(guó)內(nèi)外各學(xué)者普遍認(rèn)可GBR/GTR中屏障膜的必要性,臨床最常用的屏障膜主要分為不可吸收膜和可吸收膜[12-13]。

不可吸收膜包括:膨脹型聚四氟乙烯膜(expanded-polytetrafluoroethylene,e-PTEF)以及鈦增強(qiáng)的聚四氟乙烯膜等[14-15],具有強(qiáng)度大、可個(gè)性化塑形等優(yōu)點(diǎn),適合于缺損類型較嚴(yán)重的骨缺損區(qū)修復(fù)。但因?yàn)樯锵嗳菪圆?早期易引起軟組織并發(fā)癥,暴露后容易感染導(dǎo)致成骨不佳甚至失敗,且需要二次手術(shù)取出,限制了其進(jìn)一步發(fā)展[16]。

可吸收膜包括牛、豬或者人的肌腱、真皮、皮膚、心包等天然來(lái)源的膠原膜以及聚乳酸(polylactic acid,PLA)、聚己內(nèi)酯(polycaprolactone,PCL)、聚乙醇酸(polyglycolic acid,PGA)等人工合成的聚合物膜[17-21]。其中膠原膜因具有較好的生物相容性、能快速血管化、免疫原性低、無(wú)需二次手術(shù)取出等優(yōu)點(diǎn),目前已成為屏障膜的首選;但它也存在機(jī)械強(qiáng)度不足、降解速度快、空間維持能力差、屏障作用時(shí)間短等缺點(diǎn),在治療較嚴(yán)重的骨缺損區(qū)時(shí),往往無(wú)法獲得滿意的臨床效果[22]。

結(jié)合目前各類屏障膜的優(yōu)缺點(diǎn)分析,優(yōu)秀的屏障膜應(yīng)具備以下特點(diǎn):具有良好的生物相容性、組織整合性、細(xì)胞封閉性、維持空間性及臨床可操作性等,研發(fā)合適的屏障膜材料已經(jīng)成為GBR/GTR進(jìn)一步發(fā)展的關(guān)鍵[23-24]。

2 絲素蛋白的結(jié)構(gòu)

絲素蛋白是從蠶絲中提取的一種獨(dú)特的天然蛋白,其主要來(lái)源為家蠶和柞蠶,由18種氨基酸組成,氨基酸序列由兩個(gè)不同的亞基構(gòu)成:一個(gè)輕鏈和一個(gè)重鏈,再通過一個(gè)二硫鍵相互連接,輕鏈由一個(gè)非重復(fù)的、親水的序列組成,而重鏈的氨基酸序列由重復(fù)的Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser和Gly-Ala/Ser/Tyr二肽的重復(fù)段構(gòu)成,形成了12個(gè)晶體結(jié)構(gòu)域[25]。這種高甘氨酸含量使重鏈緊密堆積成非常穩(wěn)定的β-sheet納米晶體,并通過氫鍵相互作用,提升了絲素蛋白的力學(xué)性能[26]。

3 絲素蛋白的生物特性及在口腔再生屏障材料中的應(yīng)用現(xiàn)狀

絲素蛋白具有優(yōu)良的生物相容性、生物降解性、生物可吸收性、低免疫原性和可調(diào)節(jié)的力學(xué)特性等優(yōu)點(diǎn),這也提示了絲素蛋白在組織再生領(lǐng)域的潛在用途[27-28]。

3.1 絲素蛋白屏障材料的生物相容性

生物相容性是屏障膜的基本要素,決定了細(xì)胞能否在屏障膜表面黏附、增殖和分化,以及后期人體對(duì)屏障膜是否會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的抗原反應(yīng)。

早在1993年,絲素蛋白的生物安全性與生物相容性就已經(jīng)被美國(guó)食品和藥物監(jiān)督管理局(FDA)認(rèn)可。絲素蛋白被廣泛用于縫合材料[29-30],目前,FDA已經(jīng)批準(zhǔn)了不同的絲基醫(yī)療設(shè)備,如長(zhǎng)期生物可吸收手術(shù)網(wǎng)片和絲素蛋白基韌帶移植物SeriACLTM。此外,絲素蛋白還被研究制備成用于傷口敷料的生物材料,臨床應(yīng)用的產(chǎn)品也正在開發(fā)中(Akeso生物醫(yī)學(xué)公司)[29,31]。

而作為屏障膜材料的研究,不論是體內(nèi)還是體外研究,均發(fā)現(xiàn)絲素蛋白沒有細(xì)胞毒性[32-34]。絲素蛋白在生物體內(nèi)GBR過程中引起的炎癥反應(yīng)程度與目前臨床最常應(yīng)用的膠原膜相似,其具有良好的生物相容性。Kim等[35]在兔顱骨缺損模型中應(yīng)用絲素蛋白納米纖維膜并評(píng)估其對(duì)骨再生的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)絲素蛋白納米纖維膜僅有輕微炎癥反應(yīng),具有良好的生物相容性和明顯的骨再生效果。同時(shí),Ha等[36]在顯微鏡下觀察到絲素膜周圍幾乎沒有炎癥細(xì)胞,且在骨再生的區(qū)域有一個(gè)組織良好的血管網(wǎng)絡(luò),證實(shí)了血管生成是加速絲素膜幫助骨愈合的關(guān)鍵因素。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,絲素膜能獲得理想的GBR效果,且骨增量高度高于膠原膜和聚四氟乙烯膜。Smeets等[37]制備了一種羥基磷灰石、β-磷酸三鈣改性后的絲素蛋白膜,通過兔顱骨缺損實(shí)驗(yàn)表明,與膠原膜相比,新型改性的絲素蛋白膜具有良好的生物相容性,在10周后更有利于支持骨形成,并能有效防止軟組織的長(zhǎng)入,起到屏障作用。Kim等[38]采用大鼠顱骨缺損模型證實(shí)了絲素蛋白膜與膠原膜相比沒有任何更為嚴(yán)重的炎癥反應(yīng),且獲得了良好的骨增量效果。這些研究結(jié)果均已證明絲素蛋白膜具有良好的生物相容性,可以用作GBR的屏障材料之一。

3.2 絲素蛋白屏障材料的生物可降解性

生物可降解性和生物可吸收性是可吸收屏障膜材料的另一重要特征。理想的可吸收屏障膜材料需要在植入一段時(shí)間后,能被患者自身的細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)逐漸取代。同時(shí),要確保生物降解的副產(chǎn)物是無(wú)毒的,在體內(nèi)代謝時(shí)不會(huì)干擾其他組織、器官和功能。根據(jù)GBR或GTR目標(biāo)組織的不同,理想的屏障膜需要以可控的速率降解,能提供足夠的屏障時(shí)間支持組織再生。因此,控制降解速率是可吸收屏障膜材料研究的主要目標(biāo)之一。

絲素蛋白作為一種酶降解聚合物,已被證明不會(huì)引起免疫原性反應(yīng),可以在體外或體內(nèi)被各種酶(如α-糜蛋白酶、蛋白酶ⅩⅣ和膠原酶ⅠA酶等)降解,其降解產(chǎn)物主要是氨基酸和肽,降解后在體內(nèi)容易被吸收,生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用潛力巨大[39-40]。

通過對(duì)絲素蛋白在生物體內(nèi)的降解速率研究,學(xué)者們發(fā)現(xiàn)其中降解速率可調(diào)的關(guān)鍵在于其二級(jí)β-sheet結(jié)構(gòu)的增減。Wang等[41]在Lewis大鼠中植入絲素蛋白多孔支架后,發(fā)現(xiàn)該支架在巨噬細(xì)胞的作用下8周開始降解,1年左右完全降解消失。但天然蠶絲纖維的降解速度就相對(duì)要慢得多,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),這是因?yàn)樘烊恍Q絲纖維的β-sheet二級(jí)結(jié)構(gòu)含量明顯高于絲素蛋白[42]。研究表明,絲素蛋白的降解受水不溶性silk-Ⅱ和水溶性silk-Ⅰ結(jié)構(gòu)含量的影響,隨著silk-Ⅱ數(shù)量的增加,β-sheet結(jié)構(gòu)量的增加,降解時(shí)間也增加。通過對(duì)β-sheet結(jié)構(gòu)量的增減,可以調(diào)控絲素蛋白降解速率至目標(biāo)材料所需的范圍[43-44]。例如,絲素蛋白薄膜通過乙醇處理,將水溶性silk-Ⅰ轉(zhuǎn)變?yōu)樗蝗苄詓ilk-Ⅱ結(jié)構(gòu),從而增加了更多的β-sheet結(jié)構(gòu),降解速率減慢[4]。相反,絲素蛋白薄膜通過緩慢的空氣干燥過程只含有較少的β-sheet結(jié)構(gòu),降解速率就會(huì)大大加快。此外,超聲治療也被證明可以將silk-Ⅱ轉(zhuǎn)化為silk-Ⅰ,從而促進(jìn)絲素蛋白的降解[45]。同時(shí),也有研究表明,將蛋白酶抑制劑整合到絲素蛋白基體系中,使得蛋白酶酶促降解反應(yīng)被抑制,可以大大降低絲素蛋白的降解速率[46]。這種增強(qiáng)的降解調(diào)控也為絲素蛋白在控制藥物釋放的應(yīng)用開辟了新的可能性。

而在絲素蛋白作為屏障材料的降解研究中,各學(xué)者也做了不同的嘗試。Ge?o等[47]對(duì)絲素蛋白膜的降解深入研究,通過熱退火法制備出具有高延展性的絲素蛋白/甘油混合膜,并將其與人牙周膜成纖維細(xì)胞一起培養(yǎng)7 d后,發(fā)現(xiàn)混合膜的降解能力優(yōu)于純絲素蛋白膜,并且具有較高的親水性,能大大增強(qiáng)細(xì)胞的黏附和活力,有望應(yīng)用于牙周再生。Ko等[48]應(yīng)用CF4氣體等離子處理獲得了一種同時(shí)具有疏水性和親水性的絲素蛋白膜,在有效阻擋軟組織入侵和促進(jìn)GBR的同時(shí),歷經(jīng)5個(gè)月的生物降解后,仍未發(fā)生明顯的收縮和變形,這為絲素蛋白作為GBR屏障材料提供了新的制備工藝參考。

3.3 絲素蛋白屏障材料的機(jī)械性能

在GTR或GBR中,屏障材料要求能夠抵抗外界的壓力,維持穩(wěn)定的支撐空間,并且在臨床操作時(shí)要具備一定的抗壓縮拉伸能力,因此對(duì)材料具有較高的力學(xué)性能要求。絲素蛋白具有優(yōu)異的力學(xué)性能,斷裂應(yīng)變率4%～26%,極限強(qiáng)度300～740 MPa,韌性70～78 MJ/m3,這為開發(fā)絲素蛋白基屏障材料提供了較大優(yōu)勢(shì)[49]。

盡管天然蠶絲具有優(yōu)異的力學(xué)性能,但大多數(shù)由再生絲素蛋白溶液直接制備獲得的材料都是弱而脆的,這主要是因?yàn)樵偕牧现腥狈m當(dāng)?shù)亩?jí)結(jié)構(gòu)和層次結(jié)構(gòu)[42]。因此,為了獲得更好的力學(xué)性能,研究者嘗試通過重組再生絲素蛋白的弱氫鍵,使絲素蛋白具有自組裝和自修復(fù)的能力,自組裝成更大的纖維結(jié)構(gòu),獲得更優(yōu)化的分子層次順序和更優(yōu)異的力學(xué)性能[26,43]。研究表明絲素蛋白的濃度、加工溫度、甲醇/鹽處理、水退火處理、孔徑、3D生物打印技術(shù)等各種處理都會(huì)影響絲素蛋白的力學(xué)性能,我們可以通過改變影響因素來(lái)增強(qiáng)絲素蛋白的力學(xué)性能[49]。考慮到絲素蛋白生物材料強(qiáng)大的力學(xué)性能,研究人員已經(jīng)將絲素蛋白應(yīng)用作為承載組織再生的支架材料,特別是在肌肉骨骼組織的再生中[28]。

3.4 絲素蛋白屏障材料的藥物傳遞作用

在口腔組織再生中,干細(xì)胞可以被招募并分化成成骨前細(xì)胞、前牙周膜細(xì)胞和成骨細(xì)胞是GTR的重要條件。其中,生長(zhǎng)因子在調(diào)節(jié)干細(xì)胞的歸巢和分化中至關(guān)重要。在GTR或GBR中,屏障膜通過釋放生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)干細(xì)胞從而提高組織增殖能力和骨再生能力。

由于其較慢的降解速率,絲素蛋白已被證明是生物活性藥物傳遞的載體,特別是在骨再生領(lǐng)域[27,52]。為了模仿生理上的骨骼層次,研究者已經(jīng)研究了各種形態(tài)的絲素蛋白,并應(yīng)用于輸送骨特異性生長(zhǎng)因子,如骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)、血小板生長(zhǎng)因子、基因和酶等[53-54]。

絲素蛋白目前已被用于輸送生物活性分子,特別是BMP-2,因?yàn)锽MP-2在促進(jìn)成骨方面起著關(guān)鍵作用。研究表明,負(fù)載BMP-2的絲素蛋白顆粒成功地誘導(dǎo)了大鼠異位骨的形成,隨著BMP-2的傳遞速率增加,骨密度也隨之增加,同時(shí)加載BMP-2的絲素蛋白組骨形成能力優(yōu)于單獨(dú)使用BMP-2組[55]。這強(qiáng)調(diào)了絲素蛋白作為一種有效的載體,在提高BMP-2作為藥物傳遞分子促進(jìn)骨再生的療效方面具有不可或缺的作用。

為了促進(jìn)成功的骨再生,有效的組織血管化也是一個(gè)重要條件。因此,除了BMP-2外,血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在骨再生中起著至關(guān)重要的作用。研究發(fā)現(xiàn),持續(xù)傳遞VEGF可以促進(jìn)新生血管的形成和成骨細(xì)胞的分化來(lái)幫助GBR[56]。Farokhi等[57]制備了一種負(fù)載VEGF的凍干絲素蛋白/磷酸鈣底物電紡絲聚(乳酸共乙醇酸)納米纖維,VEGF在體外28 d測(cè)量的釋放譜維持生物活性為83%,該傳遞系統(tǒng)在體外具有良好的細(xì)胞相容性,增強(qiáng)了成骨細(xì)胞的黏附、增殖和堿性磷酸酶活性。在兔顱骨缺損模型中誘導(dǎo)形成8 mm臨界大小的新骨,獲得了良好的骨再生效果。由于VEGF和BMP-2是參與血管生成和成骨的重要因素,也有學(xué)者將兩者結(jié)合并包裹負(fù)載,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,雖然BMP-2單獨(dú)介導(dǎo)了骨形成,而VEGF觸發(fā)了新生血管,但它們的相互作用促進(jìn)了術(shù)后12周的成骨和成血管[58]。

在GTR研究中,Song等[59]通過靜電紡絲法技術(shù)將明膠納米球合并到絲素蛋白納米纖維膜中,制備了一種不使用任何有機(jī)溶劑的新型纖維納米給藥系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)表明這種納米纖維膜對(duì)金黃色葡萄球菌具有良好且持久的抗菌作用,同時(shí)該膜能促進(jìn)牙周膜細(xì)胞的附著、擴(kuò)散和增殖,有望應(yīng)用于牙周再生。

4 總結(jié)與展望

絲素蛋白是一種獨(dú)特的兼具生物醫(yī)學(xué)和力學(xué)特性的天然生物材料。與目前臨床上使用的大多數(shù)生物可吸收膜相比,絲素蛋白材料生物相容性良好,且有可控的生物降解性,具有更好的組織愈合效果,在生物模型中顯示出良好的骨再生效果。然而,通過傳統(tǒng)方法制備得到的純絲素蛋白膜的力學(xué)性能可能無(wú)法滿足口腔生物膜的要求,這也阻礙了絲素蛋白作為屏障材料的應(yīng)用。我們可以通過改進(jìn)絲素蛋白的制備方法、結(jié)合其他材料優(yōu)化性能、對(duì)絲素蛋白進(jìn)行基因調(diào)控以及通過結(jié)合新型技術(shù)如3D生物打印來(lái)更好地克服這一缺點(diǎn)。例如,將絲素蛋白與其他材料如氧化鋅納米粒子、羥基磷灰石納米粒子混合,以及應(yīng)用靜電紡絲的方法使絲素蛋白膜具有良好的力學(xué)性能和適宜的降解率,從而更適合GTR/GBR的臨床應(yīng)用。

目前絲素蛋白屏障材料仍處于不斷探索和改進(jìn)的過程中,需要更多的實(shí)驗(yàn)研究來(lái)驗(yàn)證絲素蛋白改性的成果。當(dāng)然,在屏障膜中加入生長(zhǎng)因子可能是絲素蛋白作為GTR/GBR屏障材料的另一種改進(jìn)。但仍需要更多關(guān)于絲素蛋白膜載藥的研究,同時(shí)探討如何控制這些生物因子的釋放,從而驗(yàn)證其在GTR/GBR中的實(shí)際效果。

目前關(guān)于絲素蛋白屏障材料的研究并不全面,仍需要大量的生物學(xué)、臨床研究和進(jìn)一步的改性研究來(lái)解決當(dāng)前的問題。但是參考目前絲素蛋白的生物特性以及許多關(guān)于絲素蛋白屏障膜的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn),我們認(rèn)為絲素蛋白是一個(gè)很有潛力的蛋白質(zhì)基屏障材料,具有廣泛的口腔組織再生應(yīng)用前景。