笪 蔚,王 琴,魏安邦,張 浩, 汪任冰,劉 倩,周 強(qiáng)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)是DNA病毒科中一種嗜肝的、帶包膜的、部分雙鏈的 DNA病毒[1]。HBV感染是一個(gè)重要的全球性健康問題,據(jù)世衛(wèi)組織估計(jì),全球有2.57億人長期感染HBV,每年約有88.7萬人死于與HBV相關(guān)的并發(fā)癥[2]。血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1, HO-1)是血紅素降解的關(guān)鍵酶,打開血紅素的卟啉環(huán),并釋放等摩爾量的游離鐵、綠膽素(biliverdin, BV)和一氧化碳(carbon dioxide, CO)。HO-1是一種重要的應(yīng)激反應(yīng)蛋白,它具有抗氧化、抗凋亡和抗炎的作用,在生理和病理?xiàng)l件下均對機(jī)體起保護(hù)作用,也被認(rèn)為是一種細(xì)胞保護(hù)酶[3];在過去的10年中,HO-1已被成功探索出對多種病毒的抗病毒作用,并且對包膜病毒有選擇性,能引起病毒包膜的破壞和解離;如HIV、HCV、HBV、流感、登革熱、埃博拉、呼吸道合胞病毒、人類單純皰疹病毒等[4];被認(rèn)為是包膜病毒的通用殺病毒劑。在HBV感染中,Protzer et al[5]證明了HO-1可以通過降低HBV核心蛋白的穩(wěn)定性,直接抑制HBV在肝細(xì)胞中的復(fù)制,從而抑制HBV核心共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(HBV cccDNA)的產(chǎn)生,可見HO-1的誘導(dǎo)可能是治療乙型肝炎相關(guān)炎癥的新選擇,需要進(jìn)一步研究其抗病毒機(jī)制,該研究旨在探究HO-1能否聯(lián)合現(xiàn)有的抗HBV藥物IFN-α來發(fā)揮更強(qiáng)的抗病毒作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑HepG2、HepG2.2.15購自上海富源生物公司;HBV 1.3由安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科留存;si-HO-1質(zhì)粒、TRIzol、引物序列購自上海生工生物公司;DMEM、PBS購自上海培源生物科技公司;胎牛血清購自南京維森特生物技術(shù)有限公司;0.25%胰酶消化液、CCK-8試劑、雙抗、RIPA 裂解液、BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自上海碧云天生物有限公司;磷酸酶抑制劑購自上海陶術(shù)生物科技;HO-1抗體、MxA抗體購自英國 Abcam公司;p-IRF-3、IRF-3抗體、抗IRF-9、抗GAPDH、山羊抗兔(H+L) HRP和山羊抗鼠(H+L) HRP購自美國Affinity公司;Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑購自美國ThermoFisher公司;ECL底物發(fā)光試劑盒購自中國武漢Abbkine公司;RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光染料SYBR購自上海ToloScript公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物Hemin(批次號(hào)：52180;純度>96%)購自美國sigma公司,Hemin用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液充分溶解配成10 mmol/L的母液,-20℃保存;在實(shí)驗(yàn)前用配制好的細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋母液至所需使用的濃度。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 HepG2、HepG2.2.15 細(xì)胞培養(yǎng)：向DMEM培養(yǎng)基中加入10%FBS和1%的雙抗配制成新鮮培養(yǎng)基,對于HepG2.2.15細(xì)胞每100 ml培養(yǎng)基中加入320 ng遺傳霉素G418,然后在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱里培養(yǎng),待細(xì)胞生長至90%時(shí),用胰酶消化2 min,1 ∶2傳代培養(yǎng)。等細(xì)胞長到對數(shù)期進(jìn)行均勻鋪板,等細(xì)胞融合至60%～70%,用新鮮培養(yǎng)基換液后對細(xì)胞進(jìn)行藥物處理48 h后進(jìn)行qRT-PCR、Western blot 檢測,或進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染24 h,用藥物處理48 h后再進(jìn)行qRT-PCR、Western blot 檢測。

1.3.2CCK-8實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞株進(jìn)行傳代,離心后用配制的細(xì)胞培養(yǎng)基重懸,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),以5×103個(gè)/孔的密度鋪進(jìn)96孔板中。待細(xì)胞貼壁后,加入不同濃度的Hemin(0、5、10、20、50、75、100 μmol/L)置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)孵育6 d,每3 d換液1次。到待測時(shí)間后,以1 ∶10的比例將CCK-8試劑和提前配制的培養(yǎng)基混合,吸盡培養(yǎng)基,加入配好的溶液,1 h后酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度值。

1.3.3HBV相關(guān)指標(biāo)定量檢測 收集HepG2-HBV1.3經(jīng)過藥物處理48 h及轉(zhuǎn)染小干擾RNA(Si RNA)24 h后再經(jīng)過藥物處理后的細(xì)胞上清液;收集HepG2.2.15細(xì)胞經(jīng)過不同藥物處理2、4、6 d 后的細(xì)胞上清液,用美國雅培全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀i4000SR檢測上清液中的乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝e抗原(HBeAg)。

1.3.4實(shí)時(shí)定量PCR分析 通過使用兩步逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)定量分析來測量基因表達(dá)。通過TRIzol提取總RNA,在260 nm處評估提取的RNA的濃度;然后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,GAPDH被用作定量的內(nèi)參,引物設(shè)計(jì)序列見表1。然后進(jìn)行RT-qPCR測定,反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s,40個(gè)循環(huán)包括95 ℃、10 s,60 ℃、30 s,測定HO-1、IFN-β的mRNA表達(dá)水平。

表1 引物序列

1.3.5蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn) 加入裂解緩沖液(PIPA ∶PMSF ∶磷酸酶抑制劑=100 ∶1 ∶1)以裂解細(xì)胞并獲得全細(xì)胞蛋白質(zhì)裂解物。4℃離心去沉淀后,吸出細(xì)胞上清液。用BCA進(jìn)行蛋白定量。隨后以1 ∶4比例加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液,在100 ℃沸水的水浴鍋中水浴10 min使蛋白質(zhì)變性,隨后將蛋白質(zhì)信息轉(zhuǎn)至PVDF膜上,轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,進(jìn)行切膜,切分成所需的分子量條帶,再將條帶都放入快速封閉液中封閉1 h。封閉結(jié)束后多次洗膜。置條帶于HO-1抗體(兔源單抗1 ∶2 000)、MxA抗體(兔源單抗1 ∶1 000)、p-IRF-3(兔源單抗1 ∶1 000)、IRF-3抗體(兔源單抗1 ∶1 000)、IRF-9抗體(兔源單抗1 ∶1 000)、GAPDH(鼠源多抗1 ∶5000)一抗稀釋液中,搖床上4℃慢搖過夜,再用TBST緩沖液洗膜5次,每次5 min;根據(jù)一抗來源不同,分別放入山羊抗兔或鼠的二抗(1 ∶5 000)中室溫下孵育1 h,然后再TBST緩沖液洗膜;顯影液1 ∶1配制,滴于膜上,置于化學(xué)發(fā)光成像儀內(nèi)顯影。

2 結(jié)果

2.1 Hemin誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)實(shí)驗(yàn)中選擇了不同濃度Hemin作用于兩種細(xì)胞系2 d誘導(dǎo)HO-1,結(jié)果顯示,HO-1的表達(dá)水平以劑量依賴的方式增加(圖1)。為了測定Hemin藥物的細(xì)胞毒作用,通過CCK-8法對HepG2、HepG2.2.15細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測。結(jié)果顯示,濃度在5～50 μmol/L之間的Hemin持續(xù)作用細(xì)胞6 d后,對細(xì)胞不產(chǎn)生殺傷作用;而濃度在75 ～ 100 μmol/L之間的Hemin處理細(xì)胞會(huì)對細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒作用(圖2)。

圖1 不同濃度Hemin對HO-1的誘導(dǎo)

圖2 不同濃度的Hemin對HepG2、HepG2.2.15的生長抑制程度

2.2 HO-1對HBV的體外抗病毒活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示不同濃度Hemin處理HepG2.2.15細(xì)胞組的HBV-DNA、HBeAg、HBsAg與對照組相比表達(dá)降低(圖3A),并與Hemin濃度成反比,當(dāng)50 μmol/L Hemin濃度作用細(xì)胞時(shí),對HBV-DNA、HBeAg有明顯的抑制作用,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=24.19,P<0.001;F=33.37,P<0.001),而對HBsAg的抑制沒有HBV-DNA、HBeAg明顯;對HepG2-HBV1.3細(xì)胞同樣表現(xiàn)出HBV-DNA、HBeAg降低的抗病毒效應(yīng)(圖3B),當(dāng)50 μmol/L Hemin濃度作用細(xì)胞時(shí)同樣表現(xiàn)更明顯的抗病毒效應(yīng)(F=92.68,P<0.001;F=53.61,P<0.001)。

圖3 HO-1體外抗病毒效應(yīng)

2.3 HO-1通過增強(qiáng)I型干擾素反應(yīng)來發(fā)揮抗HBV作用不同濃度Hemin作用于HepG2-HBV1.3、HepG2.2.15細(xì)胞2 d,圖4顯示Hemin以劑量依賴的方式增強(qiáng)了IFN-β的mRNA表達(dá)以及HO-1、IRF-3、IRF-9及下游抗病毒蛋白MxA的表達(dá);在50 μmol/L Hemin濃度作用下IFN-β的表達(dá)量明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HepG2-HBV1.3：F=122.68,P<0.001;HepG2.2.15：F=289.3,P<0.001)(見圖4)。

圖4 Hemin誘導(dǎo)HO-1增強(qiáng)IFN反應(yīng)

2.4 Si-HO-1可以逆轉(zhuǎn)HO-1發(fā)揮的抗病毒作用為了確定HO-1誘導(dǎo)的I型干擾素上調(diào)和抗病毒作用是否涉及HO-1,設(shè)計(jì)HO-1 siRNA(si-HO-1)或NC-siRNA(si-NC)轉(zhuǎn)染HepG2-HBV1.3細(xì)胞后,再用Hemin刺激誘導(dǎo);不做處理的為空白對照組,Hemin誘導(dǎo)的為陰性對照,結(jié)果表明,與si-NC和陰性對照組相比,si-HO-1處理組的HBsAg、HBeAg的表達(dá)有所增高;HO-1、IFN-β的mRNA表達(dá)降低,IRF-3、IRF-9及下游的抗病毒蛋白MxA的分子表達(dá)均有所下降,說明si-HO-1處理組在一定程度上逆轉(zhuǎn)了Hemin抗病毒作用(圖5)。

2.5 HO-1可以增強(qiáng)IFN-α的抗病毒效應(yīng)IFN是一種具有免疫調(diào)節(jié)和抗病毒作用的細(xì)胞因子,是臨床治療慢性乙型肝炎的首選藥物之一;可以通過誘導(dǎo)具有抗病毒特性的ISG來增強(qiáng)免疫功能。然而,IFN治療有一些局限性,如成本過高、停藥后的反彈,大量患者在長期使用后出現(xiàn)耐藥性等副作用。因此,為進(jìn)一步證明了HO-1聯(lián)合現(xiàn)有的IFN-α發(fā)揮更強(qiáng)的抗病毒作用,設(shè)計(jì)Control、Hemin、IFN-α和Hemin+IFN-α組分別作用2、4、6 d,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組發(fā)揮更強(qiáng)的抗病毒作用,第6天時(shí)HBsAg、HBeAg較第2、4天更明顯,HBV-DNA也表現(xiàn)出相似的結(jié)果,可見聯(lián)合作用抗病毒效應(yīng)與時(shí)間有相關(guān)性(圖6)。

圖6 Hemin與IFN-α聯(lián)合作用于HepG2.2.15細(xì)胞的抗病毒效應(yīng)

3 討論

乙型肝炎病毒是世界范圍內(nèi)最常見的慢性病毒病原體,是已知最小的引起人類致病的DNA病毒之一,約3.2 kb,可通過血液或人體分泌物進(jìn)行傳播。病毒通過獨(dú)特的HBV pgRNA中間體進(jìn)行復(fù)制,最終在核內(nèi)轉(zhuǎn)化為共價(jià)閉合 DNA(cccDNA),利用不同的啟動(dòng)子,轉(zhuǎn)錄出4種mRNA,編碼多種不同病毒蛋白(HBsAg、HBeAg、HBcAg、RT等)并逆轉(zhuǎn)錄出 HBV DNA[6]。HBV標(biāo)志物是評估 HBV 感染、肝炎和其他疾病不可或缺的工具。HBV-DNA、HBsAg和HBeAg是最常用的診斷HBV感染及預(yù)測治療期間病情復(fù)發(fā)和確定何時(shí)結(jié)束治療的有效血清標(biāo)志物[7]。

HBV感染細(xì)胞后,會(huì)激活機(jī)體先天免疫系統(tǒng),宿主細(xì)胞釋放IFNs,IFNs介導(dǎo)的抗病毒作用及其重要。IFNs是一種分泌型蛋白,可以由細(xì)胞識(shí)別不同病原菌后產(chǎn)生。IFNs與細(xì)胞表面的受體結(jié)合,開始激活JAK-STATs通路;磷酸化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子1/2(signal transducer and activator of transcription1/2,STAT 1/2)與干擾素調(diào)節(jié)因子-9 (interferon regulatory factor-9,IRF-9)結(jié)合,形成復(fù)合物干擾素刺激基因因子-3 (IFN-stimulated gene factor-3,ISGF-3);進(jìn)一步,ISGF-3與核內(nèi)干擾素刺激反應(yīng)元件結(jié)合,誘導(dǎo)一系列干擾素刺激基因的表達(dá),如抗黏液病毒蛋白A(MxA)、2′,5′-寡腺苷酸合成酶(2′,5′-Oligoadenylate synthetase,OAS)、雙鏈RNA依賴的蛋白激酶(double-stranded RNA-dependent protein kinase,PKR);這些干擾素刺激基因通過多種機(jī)制在病毒復(fù)制的不同的階段阻止病毒的復(fù)制[8]。IFN-JAK-STAT軸是經(jīng)典的抗HBV信號(hào)通路;在病毒感染之前或期間激活,增強(qiáng)先天免疫反應(yīng)從而增強(qiáng)IFN的表達(dá)將有助于提高宿主對抗病毒的能力。因此誘導(dǎo)或恢復(fù)I型IFN產(chǎn)生和相應(yīng)抗病毒反應(yīng)的方法可能增強(qiáng)抑制宿主中的HBV復(fù)制。已知HO-1廣譜抗病毒作用主要涉及3個(gè)方面：HO-1及下游產(chǎn)物直接抑制病毒復(fù)制、增強(qiáng)宿主細(xì)胞I型IFN反應(yīng)間接抑制病毒復(fù)制、抑制病毒感染引發(fā)的炎癥損傷[9];實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,HO-1有效地抑制了HBV DNA、HBeAg、HBsAg的表達(dá),HO-1對HBeAg的抑制能力強(qiáng)于HBsAg,這可能與HO-1及其產(chǎn)物可以直接抑制HBV的核心蛋白及cccDNA相關(guān)[5]。研究[10]顯示通過激活HO-1介導(dǎo)的I型IFN反應(yīng)在抑制病毒復(fù)制中發(fā)揮重要作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示Hemin處理組的IFN-β也呈現(xiàn)高表達(dá);不同濃度的Hemin不僅劑量依賴性誘導(dǎo)HO-1并且劑量依賴性誘導(dǎo)JAK-STAT通路中的IRF-9、MxA;但對于HepG2.2.15細(xì)胞來說,MxA在此細(xì)胞系中表達(dá)并不明顯,這可能與外源性的病毒基因組的整合,導(dǎo)致細(xì)胞系的基因組重排和染色體變異有關(guān),從而影響基因的表達(dá)相關(guān)[11];而在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HBV-1.3的HepG2細(xì)胞中,MxA可以被輕易誘導(dǎo)。除了已被證明的HO-1及其產(chǎn)物可以通過降低HBV核心蛋白穩(wěn)定性從轉(zhuǎn)錄層面直接抑制病毒復(fù)制,猜測HO-1的另一部分抗病毒作用可能是通過激活I(lǐng)FN-JAK-STAT軸來誘導(dǎo)ISG來發(fā)揮的。Lazear et al[12]研究認(rèn)為IRF-3對響應(yīng)病毒感染產(chǎn)生I型IFN和IFN刺激基因(ISG)至關(guān)重要。MA et al[13]也證明了IRF-3上有HO-1的特異性受體,HO-1可以與IRF-3特異性結(jié)合,并能促進(jìn)其進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)行磷酸化誘導(dǎo)I型干擾素的產(chǎn)生來激活JAK-STAT通路。這表示HO-1可通過與IRF3的相互作用對IFN-β誘導(dǎo)來發(fā)揮抗病毒作用。

本實(shí)驗(yàn)中,si-HO-1組能逆轉(zhuǎn)Hemin處理組HO-1誘導(dǎo)的抗病毒效應(yīng)及相關(guān)分子的表達(dá);并且si-HO-1組IFN-β mRNA表達(dá)也低于Hemin誘導(dǎo)組,推測Hemin發(fā)揮的抗HBV效應(yīng)是通過HO-1來實(shí)現(xiàn)的;但是否也存在依賴IRF-3磷酸化及核轉(zhuǎn)位誘導(dǎo)I型IFN有待進(jìn)一步研究。

HO-1不僅可以發(fā)揮一定的抗病毒作用,在細(xì)胞的抗炎、抗氧化、抗凋亡等細(xì)胞保護(hù)作用方面也被廣泛研究。研究較多的是Nrf2/HO-1信號(hào)通路,揭示了HO-1在減輕氧化應(yīng)激和組織保護(hù)中發(fā)揮作用[14]。HO-1誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷保護(hù)作用和多重抗病毒能力的結(jié)合,讓HO-1成為一個(gè)潛在的臨床抗HBV藥物。再者HO-1相關(guān)的誘導(dǎo)劑(如血紅素、環(huán)氧合酶抑制劑、他汀類藥物或雷帕霉素等)已是被批準(zhǔn)用于治療人類疾病的藥物[15]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明聯(lián)合Hemin與現(xiàn)有的抗HBV藥物IFN-α發(fā)揮出更好的抗HBV作用,值得注意的是,本身實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在HepG2.2.15細(xì)胞系中,低濃度的IFN-α在不同時(shí)間作用下并不能降低HBsAg、HBeAg、HBV-DNA的表達(dá),后期實(shí)驗(yàn)使用高濃度的IFN-α作用于HepG.2.15細(xì)胞表現(xiàn)出了抗病毒性。低濃度的IFN-α在體內(nèi)能發(fā)揮抗病毒作用得益于人體強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)功能,離開機(jī)體后,缺乏這種先天免疫,很難發(fā)揮抗病毒效應(yīng)[16],有研究[17]顯示HBV的抗原或其核心蛋白等能夠抑制重要的抗病毒蛋白MxA來拮抗IFN-α的抗病毒作用。而HO-1與IFN-α聯(lián)合作用時(shí),HO-1能夠降低核心蛋白的穩(wěn)定性的表達(dá),可能在一定程度上恢復(fù)了IFN-α的抗病毒活性,聯(lián)合作用時(shí)發(fā)揮了更強(qiáng)的抗病毒作用。

綜上所述,本研究闡明了Hemin誘導(dǎo)的HO-1表達(dá)與HBV復(fù)制之間的相關(guān)性。HO-1的上調(diào)以劑量依賴的方式抑制HBV-DNA復(fù)制及HBsAg、HBeAg的分泌,可能是通過促進(jìn)IRF-3的磷酸化來增加I型干擾素的表達(dá)從而激活JAK-STAT通路來發(fā)揮抗病毒效應(yīng);并且聯(lián)合現(xiàn)有的抗病毒藥物IFN-α能發(fā)揮更強(qiáng)的抗病毒作用,HO-1具有顯著的治療潛力,可能有助于肝炎患者的治療,但需要進(jìn)一步研究。