王 彥,周 淑,于 萍,余 建,張瑞琪

(1.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院 中國出生缺陷監(jiān)測中心,四川 成都,610000;2.四川錦欣婦女兒童醫(yī)院 產(chǎn)科,四川 成都,610000)

妊娠期糖尿病(GDM)是妊娠期間常見并發(fā)癥,全球GDM的發(fā)生率為2%～38%[1]。GDM患者母體血糖升高可導(dǎo)致胎兒血糖升高,容易誘發(fā)子代心臟發(fā)育異常,從而導(dǎo)致胎兒心臟畸形,嚴(yán)重危害胎兒和母體健康,加重家庭和社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。臨床采用孕期超聲篩查胎兒心臟畸形,但因胎兒心臟病理解剖相對復(fù)雜,搏動速度過快,導(dǎo)致超聲檢查容易出現(xiàn)漏診和誤診現(xiàn)象,且超聲檢查主要是用于診斷已發(fā)生的胎兒心臟畸形,無法提前篩選出存在高風(fēng)險(xiǎn)的胎兒[3]。因此,尋找可靠有效的生物標(biāo)志物,及早發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險(xiǎn)胎兒并采取預(yù)防手段,對降低新生兒出生缺陷,提高出生人口質(zhì)量具有重要意義。微小RNA(miRNA)在各種疾病的病理生理過程中均發(fā)揮重要作用。研究[4]報(bào)道m(xù)iRNA與GDM的發(fā)病機(jī)制有關(guān),并可作為診斷新生兒出生缺陷的生物標(biāo)志物。研究[5]發(fā)現(xiàn)miR-15a過表達(dá)可參與調(diào)控心臟纖維化的發(fā)生發(fā)展,可作為診斷心肌纖維化的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。血清miR-15a異常高表達(dá)與2型糖尿病的疾病進(jìn)展密切相關(guān)[6]。但miR-15a在GDM患者血清中的表達(dá)情況及其與胎兒心臟畸形的關(guān)系尚鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過探討GDM患者血清miR-15a表達(dá)與胎兒心臟畸形的關(guān)系,旨在為臨床早期防治提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入標(biāo)準(zhǔn):① 疾病組均符合GDM相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[7],空腹血糖≥5.1 mmol/L,若空腹血糖在4.4～5.1 mmol/L,則行75 g口服葡萄糖耐量試驗(yàn); ②健康組均經(jīng)孕檢確診身體健康; ③ 均為自然受孕、單胎妊娠者; ③ 確診孕周≥24周者; ④ 均意向在本院進(jìn)行后續(xù)產(chǎn)檢、生產(chǎn)者; ⑤ 均簽署知情同意書者。

排除標(biāo)準(zhǔn):① 孕早期發(fā)現(xiàn)胎兒心臟畸形流產(chǎn)者; ② 孕期接觸過藥物、輻射、寵物、裝修、酒精、吸煙等致畸因素者; ③ 既往存在胎兒畸形者; ④ 合并其他妊娠期疾病者; ⑤ 嚴(yán)重心、肝、腎等功能障礙者,精神認(rèn)知障礙者; ⑥ 合并惡性腫瘤者; ⑦ 子宮畸形、胎位異常、產(chǎn)道異常、宮內(nèi)感染者; ⑧ 血液、免疫系統(tǒng)疾病者; ⑨ 孕期有呼吸道感染疾病史患者; ⑩ 甲狀腺、腎上腺疾病者。

脫落標(biāo)準(zhǔn):① 依從性差者; ② 主動退出者; ③ 失訪者; ④ 對于引產(chǎn)或死產(chǎn)的胎兒家屬不同意進(jìn)行尸體解剖者。

1.2 方法

血清miR-15a的檢測方法:疾病組于治療前、健康組于體檢當(dāng)天均采集清晨空腹靜脈血5 mL,置于無菌抗凝管,4 000轉(zhuǎn)/min離心10 min分離血清,取上清液置于-80 ℃冰箱中保存待測。采用TRIzol裂解法提取總RNA,并檢測RNA的濃度和純度(紫外分光光度計(jì)法)。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增條件:96 ℃ 5 min,95 ℃ 10 s、66 ℃ 30 s,71 ℃ 30 s,共40個循環(huán),為減少誤差每個反應(yīng)均重復(fù)3次以上,采用2-△△Ct方法計(jì)算miR-15a表達(dá)。miR-15a引物序列:正向引物5′-TAGCAGCACATAATGGTTTGTG-3′,反向引物5′-GCCTCTAACATTGACAGC-3′; 內(nèi)參U6正向引物5′-CCATGCTCTTCTACTCCT-3′,反向引物5′-CACTGATGTCGGTTAGTT-3′。

所有患者均進(jìn)行跟蹤隨訪至妊娠結(jié)束,其中針對引產(chǎn)或死產(chǎn)的胎兒,經(jīng)家屬同意后進(jìn)行尸體解剖,以確診胎兒心臟畸形; 持續(xù)妊娠者,在胎兒娩出后,通過超聲檢查和實(shí)驗(yàn)室檢查明確心臟情況。根據(jù)GDM患者是否發(fā)生胎兒心臟畸形將其分為畸形組和非畸形組。

收集患者的一般資料,包括年齡、確診孕周、孕前體質(zhì)量指數(shù)、文化程度、不良孕產(chǎn)史(不明原因的自然流產(chǎn)、胚胎停育、產(chǎn)后大出血、難產(chǎn)、死胎和死產(chǎn))、產(chǎn)婦類型、血糖控制情況(空腹血糖≤5.3 mmol/L、餐后2 h血糖≤6.7 mmol/L記為血糖控制良好,空腹血糖>5.3 mmol/L、餐后2 h血糖>6.7 mmol/L記為血糖控制不良)、妊娠早期是否規(guī)律服用葉酸和鈣鐵等。另根據(jù)確診孕周不同,將疾病組患者分為A組(565例,確診孕周≤32周)和B組(270例,確診孕周>32周)[8]; 根據(jù)空腹血糖升高程度將血糖控制不良的190例患者分為C組(105例,空腹血糖5.3～6.1 mmol/L)和D組(85例,空腹血糖≥6.1 mmol/L)[9]。

1.3 觀察指標(biāo)

比較疾病組和健康組血清miR-15a表達(dá)水平; 統(tǒng)計(jì)胎兒心臟畸形的發(fā)生情況,并比較畸形組和非畸形組血清miR-15a表達(dá)水平及一般資料。比較不同確診孕周患者血清miR-15a表達(dá)水平與胎兒心臟畸形發(fā)生率。比較不同空腹血糖升高程度患者血清miR-15a表達(dá)水平與胎兒心臟畸形發(fā)生率。分析GDM患者發(fā)生胎兒心臟畸形的影響因素。分析血清miR-15a表達(dá)水平對GDM患者胎兒心臟畸形的預(yù)測價(jià)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 疾病組和健康組血清miR-15a表達(dá)

疾病組血清miR-15a表達(dá)水平為(2.07±0.48),高于健康組的1.00,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 畸形組和非畸形組血清miR-15a表達(dá)及一般資料比較

835例GDM患者中發(fā)生胎兒心臟畸形24例,發(fā)生率為2.87%(24/835)?；谓M和非畸形組確診孕周、文化程度、產(chǎn)婦類型、妊娠早期規(guī)律服用鈣鐵比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); 畸形組血清miR-15a表達(dá)水平、年齡、孕前體質(zhì)量指數(shù)和不良孕產(chǎn)史、血糖控制不良占比均高于非畸形組,妊娠早期規(guī)律服用葉酸占比低于非畸形組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 畸形組和非畸形組血清miR-15a表達(dá)及一般資料比較

2.3 A組和B組的血清miR-15a表達(dá)與胎兒心臟畸形發(fā)生率比較

A組、B組的血清miR-15a表達(dá)及胎兒心臟畸形發(fā)生率比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 A組和B組血清miR-15a表達(dá)與胎兒心臟畸形發(fā)生率比較

2.4 C組和D組血清miR-15a表達(dá)與胎兒心臟畸形發(fā)生率比較

D組的血清miR-15a表達(dá)水平、胎兒心臟畸形發(fā)生率高于C組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 C組和D組血清miR-15a表達(dá)與胎兒心臟畸形發(fā)生率比較

2.5 GDM患者胎兒心臟畸形的多因素分析

將上述表2中有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的臨床資料進(jìn)行賦值,年齡(實(shí)測值)、孕前體質(zhì)量指數(shù)(實(shí)測值)、不良孕產(chǎn)史(有=1,無=0)、血糖控制情況(良好=0,不良=1)、妊娠早期規(guī)律服用葉酸(有=0,無=1)、血清miR-15a表達(dá)(實(shí)測值)作為自變量,以胎兒心臟畸形作為因變量(發(fā)生=1,未發(fā)生=0)。進(jìn)行多因素Logistic回歸分析法(逐步向前法)結(jié)果顯示,血清miR-15a表達(dá)、年齡、血糖控制不佳均是GDM患者胎兒心臟畸形的影響因素(P<0.05)。見表4。

表4 影響GDM患者胎兒心臟畸形的多因素分析

2.6 血清miR-15a表達(dá)對GDM患者胎兒心臟畸形的預(yù)測價(jià)值

ROC曲線分析結(jié)果顯示,血清miR-15a表達(dá)預(yù)測GDM患者胎兒心臟畸形的Cut-off值、靈敏度、特異度、AUC分別為2.34、87.50%、73.24%、0.827(95%CI:0.799～0.852)。見圖1。

圖1 血清miR-15a表達(dá)對GDM患者胎兒心臟畸形的預(yù)測ROC曲線

3 討 論

GDM是導(dǎo)致子代畸形的常見母體疾病,胎兒心臟畸形是子代畸形中比較常見的一種先天性畸形疾病[10]。近年來,隨著人們生活水平提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變,GDM發(fā)病率呈逐年上升趨勢,胎兒心臟畸形的發(fā)生率也明顯增加,其已經(jīng)成為導(dǎo)致死胎和嬰兒死亡的主要原因[11]。本研究結(jié)果顯示,835例GDM患者中發(fā)生胎兒心臟畸形24例,總發(fā)生率為2.87%,稍高于張亮等[12]報(bào)道的2.17%,這可能與選取樣本的個體差異性有關(guān),但均證實(shí)了GDM患者胎兒心臟畸形的發(fā)生率較高。因此,積極探尋GDM患者胎兒心臟畸形影響因素,對指導(dǎo)臨床制定干預(yù)對策,預(yù)防胎兒心臟畸形、降低新生兒死亡率具有重要意義。

本研究結(jié)果顯示,疾病組血清miR-15a表達(dá)高于健康組,提示血清miR-15a表達(dá)可能與GDM的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。miRNA可通過抑制或降解調(diào)控基因表達(dá),參與細(xì)胞增殖、分化、死亡、糖脂代謝等多種生物學(xué)過程,與GDM的發(fā)病機(jī)制和胰島素抵抗之間存緊密聯(lián)系。miR-15a表達(dá)在糖尿病患者血漿中異常升高,且與病情嚴(yán)重程度相關(guān),其在胰島β細(xì)胞分泌胰島素的過程中起到重要作用[13]。研究[14]報(bào)道,GDM患者血清miR-15a表達(dá)高于健康孕婦,本研究報(bào)道與之相符。研究[15]發(fā)現(xiàn),GDM患者骨骼肌中miR-15a過表達(dá)能夠改變胰島素信號通路蛋白表達(dá),從而影響胰島素分泌。由此可見,miR-15a表達(dá)可能參與了GDM的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果顯示,畸形組血清miR-15a表達(dá)高于非畸形組,且經(jīng)多因素Logistic回歸分析法分析顯示,血清miR-15a高表達(dá)是GDM患者胎兒心臟畸形的影響因素,提示血清miR-15a表達(dá)與GDM患者胎兒心臟畸形的發(fā)生密切相關(guān)。miRNA參與胚胎心臟的發(fā)育過程,在心臟形態(tài)形成、心肌細(xì)胞生長分化的過程中有至關(guān)重要的作用。研究[16]發(fā)現(xiàn),胎兒臍帶血中的miRNA可作為先天性心臟病產(chǎn)前篩查工具。miR-15a過表達(dá)可通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激,影響心肌細(xì)胞的增殖與分化,導(dǎo)致心肌纖維肥大、增生、排列紊亂,血管內(nèi)皮生成和心臟發(fā)育規(guī)律異常,進(jìn)一步導(dǎo)致法洛四聯(lián)癥、室間隔缺損等胎兒心臟異常情況出現(xiàn)。研究[17]發(fā)現(xiàn),下調(diào)miR-15a能夠激活2型糖尿病心臟中的纖維化信號,這可能成為治療或預(yù)防2型糖尿病誘導(dǎo)的心臟纖維化重塑的潛在靶點(diǎn)。另有研究[18]指出,通過抑制miR-15a-5p表達(dá)可抑制細(xì)胞凋亡,從而達(dá)到保護(hù)心肌的目的。因此,GDM患者血清miR-15a異常高表達(dá)時(shí),可能影響胎兒心臟發(fā)育,導(dǎo)致胎兒心臟畸形發(fā)生。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),D組血清miR-15a表達(dá)與胎兒心臟畸形發(fā)生率均高于C組,說明空腹血糖水平升高程度越高,患者病情越嚴(yán)重,血清miR-15a表達(dá)越高,胎兒心臟畸形發(fā)生率也就越高。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn),不同確診孕周患者血清miR-15a表達(dá)與胎兒心臟畸形發(fā)生率均基本一致,這可能是因?yàn)橹型砥谠袐D更加注重自身和胎兒身體健康,嚴(yán)格按時(shí)體檢,能夠及時(shí)發(fā)現(xiàn)GDM并給予控制血糖水平,從而降低胎兒心臟畸形發(fā)生率。

本研究通過ROC曲線進(jìn)一步分析顯示,血清miR-15a表達(dá)預(yù)測GDM患者胎兒心臟畸形的靈敏度、特異度、AUC分別為87.50%、73.24%、0.827,表明血清miR-15a表達(dá)對GDM患者胎兒心臟畸形具有一定的預(yù)測價(jià)值。故建議GDM患者定期檢測血清miR-15a表達(dá),以指導(dǎo)臨床及時(shí)采取措施干預(yù),降低胎兒心臟畸形的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),年齡、血糖控制不良是GDM患者胎兒心臟畸形的影響因素。高齡GDM患者卵巢功能和卵巢質(zhì)量下降,影響卵巢細(xì)胞正常分裂,染色體異常概率增加,容易增加胎兒心臟畸形的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。研究[19]報(bào)道,年齡≥35歲是胎兒先天性心臟病的高危因素。血糖控制不良的GDM患者高血糖水平能夠通過胎盤破壞卵黃囊的發(fā)育,影響胚胎的增殖分化,導(dǎo)致胎兒心臟氧化應(yīng)激損傷或生長發(fā)育異常,從而增加胎兒心臟畸形的發(fā)生率。既往研究[20]報(bào)道,GDM孕婦血糖控制情況與胎兒畸形發(fā)生率有關(guān)。此外,本研究結(jié)果顯示,畸形組孕前體質(zhì)量指數(shù)、不良孕產(chǎn)史雖均高于非畸形組,妊娠早期規(guī)律服用葉酸雖低于非畸形組,但上述因素均并非胎兒心臟畸形的危險(xiǎn)因素,與既往研究報(bào)道[21]不一致,原因可能是:近年來隨著人們生活水平和醫(yī)療保健水平提高,孕產(chǎn)婦及其家屬孕期健康認(rèn)知水平也逐漸增強(qiáng),產(chǎn)前檢查、孕期積極鍛煉、規(guī)律服用葉酸等的依從性均顯著增強(qiáng),且GDM患者存在個體差異,均可影響研究結(jié)果。本研究存在一定的不足之處:首先,血清miR-15a表達(dá)與GDM患者胎兒心臟畸形的具體發(fā)病機(jī)制尚為完全闡明; 其次,如何利用該指標(biāo)指導(dǎo)臨床治療方案的制定也有待商榷。今后可在此基礎(chǔ)上進(jìn)行更深入的探討。

綜上所述,GDM患者血清miR-15a異常高表達(dá),其表達(dá)升高可增加胎兒心臟畸形的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),且對GDM患者胎兒心臟畸形具有一定的預(yù)測價(jià)值。年齡、血糖控制不佳是GDM患者胎兒心臟畸形的影響因素,建議臨床根據(jù)以上因素進(jìn)行早期預(yù)防,以降低GDM患者胎兒心臟畸形的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。miR-15a表達(dá)在GDM患者血清中異常升高,在胎兒心臟畸形患者血清中表達(dá)更高,且與GDM患者胎兒心臟畸形的發(fā)生密切相關(guān),并對該不良事件具有一定預(yù)測價(jià)值,可幫助臨床早期篩查胎兒心臟畸形,為臨床治療提供重要指導(dǎo)。