王亞琪 徐海風(fēng) 李曙光 傅蒙蒙 余希文 趙志鑫 楊加銀,* 趙團(tuán)結(jié)

大豆類(lèi)病變皺葉突變體遺傳分析和2對(duì)基因定位

王亞琪1徐海風(fēng)1李曙光1傅蒙蒙1余希文1趙志鑫1楊加銀1,*趙團(tuán)結(jié)2,*

1江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所 / 淮安市農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淮河下游種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇淮安 223001;2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所/ 國(guó)家大豆改良中心(南京) / 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部大豆生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(綜合) / 作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇南京 210095

通過(guò)研究類(lèi)病變突變體, 挖掘抗病基因, 利用分子設(shè)計(jì)育種的方法快速培育優(yōu)良抗病大豆新品種, 可減輕化學(xué)農(nóng)藥對(duì)環(huán)境的污染, 降低病害的抗藥性。本研究以60Coγ誘變獲得的類(lèi)病變皺葉突變體為父本, 分別與W82、KF1和KF35進(jìn)行雜交, 構(gòu)建了F2和F2:3分離群體, 通過(guò)SSR標(biāo)記和SNP分析, 將目標(biāo)基因1 ()縮小到18號(hào)染色體937 kb區(qū)間內(nèi), 包含66個(gè)候選基因, 將目標(biāo)基因2 ()縮小到8號(hào)染色體130 kb區(qū)間內(nèi), 包含15個(gè)候選基因。接著, 本研究利用基因芯片技術(shù)對(duì)近等基因系進(jìn)行了基因表達(dá)譜研究, 得到了差異表達(dá)基因參與的KEGG調(diào)控通路。另外對(duì)8號(hào)染色體的15個(gè)候選基因進(jìn)行半定量與熒光定量RT-PCR表達(dá)分析發(fā)現(xiàn), 只有基因在突變體與野生型中的差異達(dá)到了4倍, 推測(cè)基因是突變體的候選基因。

大豆; 類(lèi)病變突變體; 皺葉; 基因表達(dá)譜

大豆含有豐富優(yōu)質(zhì)的蛋白和油脂, 是重要的糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物, 在我國(guó)糧食和飼料結(jié)構(gòu)中占有重要位置。而我國(guó)大豆生產(chǎn)正面臨嚴(yán)峻的形勢(shì), 隨著對(duì)大豆需求逐年增加, 供求矛盾日益突出, 如今已經(jīng)成為世界最大的大豆進(jìn)口國(guó)[1-2]。病害嚴(yán)重影響大豆產(chǎn)量和品質(zhì), 培育優(yōu)良抗病品種, 既節(jié)約了資源, 又可減少化學(xué)農(nóng)藥對(duì)環(huán)境的污染, 還能降低病害的抗藥性。而分子設(shè)計(jì)育種是解決這一困境的重要途徑, 加強(qiáng)基礎(chǔ)研究, 挖掘重要性狀的關(guān)鍵基因及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò), 是分子設(shè)計(jì)育種的關(guān)鍵。

近年來(lái)的許多研究表明, 類(lèi)病變突變體病斑的形成與過(guò)敏反應(yīng)及程序性細(xì)胞死亡有關(guān), 是研究植物抗病分子機(jī)制的良好材料。類(lèi)病變突變體是指植物組織上自發(fā)形成細(xì)胞死亡, 與外部環(huán)境的脅迫沒(méi)有直接關(guān)系, 往往形成病斑或過(guò)敏反應(yīng)[3-4]。1997年, 研究人員首先在玉米和擬南芥中鑒定到了控制類(lèi)病變性狀的基因[5-6], 后來(lái)在番茄和水稻中也鑒定到了類(lèi)病變的候選基因[7-8]。Wang等[9]通過(guò)圖位克隆的方法從大豆類(lèi)病變突變體中鑒定出候選基因脂氫過(guò)氧化物裂解酶HPL, 能夠響應(yīng)病蟲(chóng)害脅迫。Ma等[10]鑒定出一個(gè)大豆光依賴(lài)的類(lèi)病變突變體, 其候選基因編碼一種共型卟啉原III氧化酶GmLMM2, 參與四吡咯生物合成, 突變體增強(qiáng)了對(duì)大豆疫霉的抗性。這些研究揭示了大多數(shù)類(lèi)病變突變體能夠激活防御反應(yīng)、甚至增強(qiáng)了對(duì)病原菌的抗性, 這些基因涉及多個(gè)途徑: 如抗病信號(hào)途徑、植物激素及防衛(wèi)信號(hào)分子、程序性細(xì)胞死亡失控、葉綠素合成和脂類(lèi)代謝等。

類(lèi)病變皺葉突變體主要特點(diǎn)為葉脈與葉肉細(xì)胞發(fā)育不協(xié)調(diào), 產(chǎn)生與病毒感染相似的形態(tài)特征, 葉面積大大減小, 結(jié)實(shí)率降低, 而大豆中的研究并不深入。Stephens等[11]從再生植株中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)不穩(wěn)定遺傳的皺葉突變體, 后代分離不穩(wěn)定, 屬于細(xì)胞質(zhì)遺傳, 往往出現(xiàn)嵌合體。Wilcox和Abney[12]從M2中鑒定到一個(gè)隱性遺傳的葉寬變窄的皺葉突變體, 遺傳解析表明由單基因控制。聶智星等[13]從60Coγ誘變的大豆突變體庫(kù)中篩選到一個(gè)皺葉突變體, 葉緣卷曲, 類(lèi)似花葉病毒感染。在普通菜豆(L.)中, 異源雜交后代出現(xiàn)了雙隱性基因控制的皺葉突變體[14]。Song等[15]鑒定到一個(gè)大豆皺葉突變體, 小葉頂端壞死, 而小葉其他部分繼續(xù)生長(zhǎng), 葉面積和葉片干重顯著降低。Ochar等[16]報(bào)道了一個(gè)EMS誘變的大豆皺葉突變體, 編碼具有CCT結(jié)構(gòu)域的B-box型鋅指蛋白突變導(dǎo)致葉片皺縮, 株高降低。

基因重復(fù)或多倍化在植物進(jìn)化過(guò)程中普遍存在,且不同的進(jìn)化階段都有發(fā)生。全基因組復(fù)制是重復(fù)基因最重要的來(lái)源之一, 其中一部分基因消亡, 一部分基因被保留但功能發(fā)生了變化, 這些對(duì)進(jìn)化起了重要作用[17]。大豆基因組在過(guò)去的6000萬(wàn)年時(shí)間里至少經(jīng)歷了2輪全基因組復(fù)制, 存在大量的重復(fù)序列, 研究者推測(cè)這些重復(fù)基因的功能也發(fā)生了變化[18], 研究重復(fù)基因的功能對(duì)研究進(jìn)化起到了重要作用。之前的研究中, 我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的類(lèi)病變突變體, 葉片皺縮, 株高降低, 對(duì)F2代和F2:3家系的遺傳分析表明該性狀被2對(duì)隱性基因控制, 功能冗余, 并且將這2對(duì)基因定位在18號(hào)和8號(hào)染色體上。

本研究將目標(biāo)基因1 ()縮小到18號(hào)染色體937 kb區(qū)間, 目標(biāo)基因2 ()縮小到8號(hào)染色體130 kb區(qū)間, 包含15個(gè)候選基因。為進(jìn)一步縮小候選基因的范圍, 本研究對(duì)8號(hào)染色體的15個(gè)候選基因進(jìn)行半定量與實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)分析發(fā)現(xiàn), 只有基因在突變體與野生型中的差異達(dá)到了4倍, 推測(cè)基因是突變體的候選基因。

1 材料與方法

1.1 遺傳材料獲得與構(gòu)建

大豆品種玉譽(yù)(Tamahomore)、Williams 82 (W82)、科豐1號(hào)(Kefeng 1, KF1)、科豐35 (Kefeng 35, KF35)等種植資源均來(lái)自于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家大豆改良中心。突變體來(lái)自于60Coγ誘變的玉譽(yù)[19],并經(jīng)過(guò)多代回交及自交, 得到近等基因系的野生型(wild type, WT)和突變型(mutant type, MT)。然后分別以W82、KF1和KF35為母本, 以為父本構(gòu)建雜交群體, W82×雜交組合F2代分離群體共1912株, F2:3代株系共156行; KF1×雜交組合F2代分離群體共451株, F2:3代株系共182行; KF35×雜交組合F2代分離群體共362株, F2:3代株系共176行。

1.2 石蠟切片觀察葉脈結(jié)構(gòu)

在V4至V5時(shí)期, 采集野生型和突變體植株頂部比較幼嫩的葉片, 采用常規(guī)石蠟切片法制片。用手術(shù)刀片切成大小0.5～1.0 cm左右的組織, FAA固定液固定, 保證組織表面無(wú)氣泡, 1 d后轉(zhuǎn)移至70%乙醇中, 按照不同濃度的乙醇脫水, 然后用二甲苯透明劑透明, 用石蠟浸蠟和包埋, 切片機(jī)切片, 粘附劑粘片與烤片, 再用二甲苯脫蠟, 不同濃度梯度的酒精復(fù)水, 用番紅-固綠對(duì)染, 再經(jīng)過(guò)不同濃度梯度的酒精脫水、二甲苯透明和中性樹(shù)膠封固, 在LEICA DMLB型顯微鏡下觀察并照相。

1.3 目的基因定位

對(duì)于質(zhì)量性狀, 根據(jù)孟德?tīng)栠z傳定律來(lái)進(jìn)行遺傳分析。由于突變體第1片三出復(fù)葉就表現(xiàn)皺葉, 肉眼很容易分辨, 因此, 用肉眼觀測(cè)進(jìn)行表型調(diào)查。調(diào)查F1、F2和F2:3代(F2單株衍生的株行)的表型, 統(tǒng)計(jì)其性狀分離比, 用卡平方適合性測(cè)驗(yàn)計(jì)算其顯著性。以隱性遺傳為例, 如果F1代單株全部表現(xiàn)為正常, F2代單株出現(xiàn)正常︰皺葉=3︰1, 表現(xiàn)正常F2單株衍生的F2:3代株行正常不分離行︰分離行=1︰2, 則為隱性單基因遺傳。如果F1代單株全部表現(xiàn)為正常, F2代單株出現(xiàn)正常︰皺葉=15︰1, 表現(xiàn)正常F2單株衍生的F2:3代株行正常不分離行︰分離行=7︰8, 則為隱性雙基因遺傳。

采用SSR標(biāo)記和SNP連鎖定位的方法進(jìn)行基因定位。對(duì)F2和F2:3群體, V3至V4期突變體皺葉表型出現(xiàn)時(shí), 調(diào)查表型并取頂部幼嫩葉片, 用CTAB法提取DNA。根據(jù)Song等[20]開(kāi)發(fā)的大豆全基因組微衛(wèi)星標(biāo)記(SSR)對(duì)初定位區(qū)間進(jìn)行標(biāo)記加密, 當(dāng)定位區(qū)間還有交換單株時(shí), 就要開(kāi)發(fā)新的SSR標(biāo)記, 進(jìn)一步縮小定位區(qū)間。方法如下: 在SoyBase (https:// soybase.org/)中下載W82參考基因組目標(biāo)區(qū)段序列, 利用SSRHunter[21]篩選SSR標(biāo)記, 參數(shù)設(shè)置優(yōu)先選擇3～6個(gè)堿基的重復(fù)序列, 并根據(jù)軟件所給的結(jié)果, 利用NCBI Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih. gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome)在上下游150 bp內(nèi)設(shè)計(jì)引物, 保證擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度在100～300 bp之間, 上下游引物m值相差不大于5℃, 由通用生物(安徽)股份有限公司合成。PCR擴(kuò)增利用2×Master Mix (P112-01, 諾唯贊生物科技股份有限公司, 南京)進(jìn)行, 用8%的聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)和銀染顯色[19]。

1.4 基因表達(dá)譜試驗(yàn)流程及數(shù)據(jù)分析

當(dāng)突變體出現(xiàn)皺葉表型時(shí), 混樣取野生型和突變體的葉片, 迅速裝入凍存管, 并置于液氮中, 以備提取大豆總RNA, 野生型和突變體各3個(gè)生物學(xué)重復(fù), 送上海伯豪生物公司進(jìn)行基因表達(dá)譜分析。流程是: 首先, 將檢測(cè)合格的RNA樣本進(jìn)行純化, 再反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈、第2鏈cDNA, 然后利用雙鏈cDNA合成生物素標(biāo)記的aRNA, 純化后與芯片雜交,進(jìn)行測(cè)序分析。

1.5 候選基因預(yù)測(cè)及半定量、定量RT-PCR檢測(cè)

在SoyBase網(wǎng)站下載定位區(qū)間內(nèi)的所有基因ID, 根據(jù)Phytozome (http://phytozome-next.jgi.doe.gov/)和SoyKB (https://soykb.org/)網(wǎng)站的基因功能注釋, 預(yù)測(cè)候選基因, 并下載基因組及轉(zhuǎn)錄組的序列, 利用NCBI Primer-BLAST設(shè)計(jì)半定量和實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物(附表1), 檢測(cè)定位區(qū)間內(nèi)基因的表達(dá)水平。V3至V4時(shí)期, 取頂部完全展開(kāi)的嫩葉(每個(gè)材料3個(gè)生物學(xué)重復(fù)), 迅速放入液氮冷凍, 再用總RNA提取試劑盒(DP419, 天根生化科技有限公司, 北京)提取總RNA, 檢測(cè)其濃度及質(zhì)量, 并稀釋至終濃度為5 ngmL–1, 用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(R223, 諾唯贊生物科技股份有限公司, 南京)將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA。半定量RT-PCR以cDNA為模板, 在普通PCR儀進(jìn)行, 根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果確定了內(nèi)參基因和目的基因以26個(gè)循環(huán)為最佳。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)以cDNA為模板, 用染料法試劑盒(Q311, 諾唯贊生物科技股份有限公司, 南京), 在Roche Light Cycler 480 II上進(jìn)行, 相對(duì)表達(dá)量采用2–ΔΔCt計(jì)算方法。半定量和熒光定量RT-PCR每個(gè)樣本3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體NT301的形態(tài)特點(diǎn)與遺傳分析

之前的研究已經(jīng)詳細(xì)報(bào)道了突變體的形態(tài)特征[19], 該突變體植株矮小, 結(jié)實(shí)率低, 葉片表現(xiàn)出感染花葉病毒癥狀(圖1-B, D), 種子大小與野生型無(wú)明顯差異, 石蠟切片顯示皺葉葉片橫切面的內(nèi)部結(jié)構(gòu)(圖1-F)。突變體表皮細(xì)胞排列紊亂, 不規(guī)則凸起, 致使表面形成褶皺, 表皮細(xì)胞和維管束之間的厚角組織層數(shù)增多, 導(dǎo)致葉脈寬度變窄, 木質(zhì)部細(xì)胞變小, 葉肉細(xì)胞單位面積的細(xì)胞數(shù)目異常增多, 柵欄組織和海綿組織連在一起, 中間幾乎沒(méi)有空隙。田間調(diào)查雜交組合后代表型并進(jìn)行遺傳分析。由表1可知, KF1×群體F1代葉片形態(tài)表現(xiàn)正常, F2代451個(gè)單株中, 有430株表現(xiàn)正常, 21株表現(xiàn)皺葉, 卡方測(cè)驗(yàn)符合15︰1的分離比(=0.48), F2:3代182個(gè)株系中, 有88個(gè)株系表現(xiàn)正常不分離, 94個(gè)株系出現(xiàn)分離, 卡方測(cè)驗(yàn)符合7︰8的分離比(=0.70)。KF35×群體F1代葉片形態(tài)表現(xiàn)正常, F2代362個(gè)單株中, 有342株表現(xiàn)正常, 20株表現(xiàn)皺葉, 卡方測(cè)驗(yàn)符合15︰1的分離比(=0.80), F2:3代176個(gè)株系中, 有87個(gè)株系表現(xiàn)正常不分離, 89個(gè)株系出現(xiàn)分離, 卡方測(cè)驗(yàn)符合7︰8的分離比(=0.51)。已報(bào)道過(guò)W82×群體F2代單株正常︰皺葉符合15︰1的分離比(=0.57), F2:3代株系正常不分離︰分離符合7︰8的分離比(=0.84)[19]。表明皺葉性狀受2對(duì)隱性基因控制。

圖1 突變體NT301的形態(tài)特征

A: 苗期野生型植株; B: 苗期植株; C: 開(kāi)花期野生型植株; D: 開(kāi)花期植株; E: 野生型葉片橫切面; F:葉片橫切面。標(biāo)尺: 1 cm (A, B); 5 cm (C, D); 200 μm (E, F)。p: 柵欄組織; s: 海綿組織; vb: 維管束。

A: wild-type plants at seedling stage; B: mutantat seedling stage; C: wild-type plants at flowering stage; D: mutantatflowering stage; E: the transverse section of wild-type leaves; F: the transverse section ofleaves. Bar: 1 cm (A, B); 5 cm (C, D); 200 μm (E, F). p: palisade parenchyma; s: spongy parenchyma; vb: vascular bundle.

2.2 突變體NT301皺葉基因定位

在之前的報(bào)道中, 將的目標(biāo)基因定位在了18號(hào)染色體BARCSOYSSR_18_0415和BARCSOYSSR_18_0485兩個(gè)SSR標(biāo)記之間, 物理距離1.85 Mb, 將目標(biāo)基因定位在了8號(hào)染色體BARCSOYSSR_08_1700和Satt409之間, 物理距離1.18 Mb。為了進(jìn)一步精細(xì)定位, 利用KF1×群體F2:3家系277個(gè)隱性單株在18號(hào)染色體定位區(qū)間內(nèi)加密了3個(gè)標(biāo)記, 分別是18_0419、18_0444和18_0481, 用這3個(gè)標(biāo)記分別檢測(cè)出了10個(gè)、5個(gè)和3個(gè)交換單株; 利用W82×群體F2:3家系327個(gè)隱性單株加密了2個(gè)標(biāo)記, 分別是18_0419和18_0430, 并檢測(cè)了標(biāo)記18_0485, 用這3個(gè)標(biāo)記分別檢測(cè)出了9個(gè)、3個(gè)和17個(gè)交換單株, 綜合2個(gè)群體的定位結(jié)果, 將定位在了18_0444和18_0481之間, 物理距離937 kb。利用KF1×群體F2:3家系262個(gè)隱性單株在8號(hào)染色體定位區(qū)間內(nèi)加密了3個(gè)標(biāo)記, 分別是08_1724、08_1736和08_1753, 并檢測(cè)了標(biāo)記08_1800, 用這4個(gè)標(biāo)記分別檢測(cè)出了52個(gè)、33個(gè)、9個(gè)和23個(gè)交換單株; 利用W82×群體F2:3家系315個(gè)隱性單株加密了5個(gè)SSR標(biāo)記和3個(gè)SNP變異位點(diǎn), 分別是08_1724、08_1738、08_1748、SSR18、SSR40和SNP1、SNP2、SNP3, 用這些標(biāo)記分別檢測(cè)出了10個(gè)、10個(gè)、10個(gè)、2個(gè)、2個(gè)和2個(gè)、1個(gè)、2個(gè)交換單株, 綜合2個(gè)群體的定位結(jié)果, 將定位在了SNP2和SNP3之間, 物理距離130 kb (圖2)。根據(jù)SoyBase和Phytozome網(wǎng)站的基因注釋信息, 18號(hào)和8號(hào)染色體目標(biāo)區(qū)段內(nèi)分別有66個(gè)和15個(gè)候選基因。

2.3 突變體NT301皺葉候選基因參與的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

利用大豆Affymetrix基因組芯片檢測(cè)皺葉突變體與野生型葉片組織的表達(dá)差異, 該芯片包含37,500個(gè)大豆()的轉(zhuǎn)錄本, 背景值小于100, 檢出率為40%以上表明芯片、樣本及操作均達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)。在本研究中, 野生型樣品1-1、1-2、1-3和突變體樣品2-1、2-2、2-3的探針檢出率均大于40% (表2), 表明試驗(yàn)數(shù)據(jù)比較可靠。

采用隨機(jī)方差模型對(duì)差異基因進(jìn)行篩選, 共獲得了3568個(gè)差異表達(dá)基因, 其中上調(diào)2337個(gè), 下調(diào)1231個(gè)。采用選擇Cluster 3.0軟件對(duì)差異基因進(jìn)行聚類(lèi), 將功能顯著差異的600個(gè)基因使用hierarchical, average linkage算法進(jìn)行分析(圖3), 野生型和突變體能夠明顯分為2類(lèi), 說(shuō)明芯片數(shù)據(jù)的重復(fù)性較好。

圖2 突變體NT301 2對(duì)候選基因定位

A: 18號(hào)染色體定位; B: 8號(hào)染色體精細(xì)定位。

A: mapping ofon chromosome 18; B: fine mapping ofon chromosome 8.

整合SoyBase、Phytozome等數(shù)據(jù)庫(kù)中的大豆基因組和蛋白組信息, 結(jié)合eggNOG-mapper (http:// eggnog-mapper.embl.de/)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行Pathway注釋, 利用KEGG (https://www.genome. jp/kegg/)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行富集分析, 篩選出差異基因顯著影響的Pathway (圖4)。上調(diào)基因所顯著參與的合成代謝通路共15個(gè)(<0.05, 圖4-A), 包括9個(gè)代謝通路、5個(gè)合成通路和1個(gè)植物與病原菌互作通路, 前5條通路達(dá)到了極顯著水平(0.01)。谷胱甘肽代謝通路基因功能集中在谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶, 如谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶18/20/22、類(lèi)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶1; 苯丙素生物合成和苯丙氨酸代謝通路基因功能集中在類(lèi)過(guò)氧化物酶, 如類(lèi)過(guò)氧化物酶4/12/52/73, 有一些涉及病原菌誘導(dǎo); 纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解通路基因功能集中在?；o酶A; 氮代謝通路基因功能集中在谷氨酰胺合成酶。下調(diào)基因所顯著參與的合成代謝通路共有10個(gè)(<0.05, 圖4-B), 包括8個(gè)代謝通路和2個(gè)合成通路, 前6條代謝通路達(dá)到了極顯著水平。卟啉和葉綠素代謝通路基因功能集中在卟啉原脫氨酶、脫羧酶和氧化酶等; 氨基糖和核苷酸糖代謝通路基因功能集中在葉綠體戊糖、己糖激酶、糖苷酶等; 次生代謝產(chǎn)物的生物合成基因功能集中在葉綠體卟啉脫羧酶、轉(zhuǎn)移酶, 糖基合酶、轉(zhuǎn)移酶等, 轉(zhuǎn)移酶、氨酰-tRNA合成基因功能集中在氨酰-tRNA合成酶, 淀粉和蔗糖代謝基因功能集中在葉綠體半乳糖醛酸海藻糖磷酸合酶、果膠酯酶等; 糖酵解/糖異生代謝通路基因功能集中在己糖激酶。

圖3 突變體NT301與野生型差異表達(dá)基因的聚類(lèi)圖

橫坐標(biāo)代表樣品名稱(chēng)及樣品的聚類(lèi)結(jié)果, 縱坐標(biāo)代表差異基因及基因的聚類(lèi)結(jié)果。S1為突變體, S2為野生型, 各3個(gè)重復(fù), 不同的行代表不同的基因。顏色代表了基因在樣品中的表達(dá)量水平。

The horizontal axis represents the sample names and clustering results of the samples, while the vertical axis represents the differentially expressed genes and clustering results of the genes. S1 represents the mutant, and S2 represents the wild type, three times repeat. Different rows represent different genes. Color represents the relative expression level of genes in the samples.

2.4 突變體NT301皺葉候選基因預(yù)測(cè)

根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測(cè), 18號(hào)和8號(hào)染色體目標(biāo)區(qū)段內(nèi)分別有66個(gè)和15個(gè)候選基因, Phytozome網(wǎng)站上對(duì)8號(hào)染色體的候選基因功能注釋如表3所示。為了進(jìn)一步預(yù)測(cè)候選基因, 取V3至V4時(shí)期大豆葉片, 提取總RNA, 做半定量和熒光定量PCR, 比較分析候選基因在野生型和突變體葉片中的表達(dá)水平。結(jié)果如圖5所示, 只有基因在突變體與野生型中的差異達(dá)到了4倍, 推測(cè)基因是突變體的候選基因, 功能注釋為UDP糖基轉(zhuǎn)移酶超家族蛋白。將18號(hào)和8號(hào)染色體定位區(qū)間內(nèi)所有基因的氨基酸序列做了聚類(lèi)分析, 結(jié)果顯示8號(hào)染色體候選基因與18號(hào)染色體聚類(lèi)在一起, 序列相似度最高, 推測(cè)是18號(hào)染色體定位區(qū)間內(nèi)的候選基因(附圖1)。

在擬南芥中的同源基因是, 編碼UDP鼠李糖-花青素-3-葡萄糖苷鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶, 是類(lèi)黃酮合成通路的下游基因, 能夠催化花青素苷生成花色素類(lèi), 進(jìn)而在谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的作用下生成花青素谷胱甘肽。研究認(rèn)為, 類(lèi)黃酮基因的表達(dá)與生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸呈負(fù)相關(guān), 抑制了生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在芽和莖中的表達(dá), 從而抑制了腋芽的生長(zhǎng)[22]。突變體候選基因的高表達(dá)導(dǎo)致下游谷胱甘肽也隨之升高, 這與表達(dá)譜芯片的結(jié)果一致, 由此影響了上游類(lèi)黃酮基因的表達(dá), 使生長(zhǎng)素運(yùn)輸受到影響, 最終導(dǎo)致葉脈與葉肉細(xì)胞發(fā)育不協(xié)調(diào), 形成皺葉的表型。

表1 雜交組合F2和F2:3群體野生型和突變體植株分離率適合性檢驗(yàn)

表2 芯片試驗(yàn)質(zhì)控情況

Beta-actin 3￠/5￠*與GAPDH 3￠/5￠*: 管家基因3￠端信號(hào)與5￠端信號(hào)比值至少有一個(gè)不大于3, 此標(biāo)準(zhǔn)僅適用于以下8種表達(dá)譜芯片: 人、小鼠、大鼠、斑馬魚(yú)、線蟲(chóng)、果蠅、酵母和大腸桿菌表達(dá)譜芯片。檢出率Detection rate (%)*: 檢出點(diǎn)總數(shù)與全部探針數(shù)的比值為該芯片的檢出率。

Beta-actin 3￠/5￠* and GAPDH 3￠/5￠*: the ratio of the 3' ends signal to the 5' ends signal of the housekeeping genes should not exceed 3. This standard only applies to the following 8 expression profile chips: human, mouse, rat, zebrafish, nematode, fruit fly, yeast, andexpression profile chips. Detection rate (%)*: the ratio of the total number of detected probes to the total number of probes is the detection rate of the chip.

表3 rl2位點(diǎn)候選基因功能注釋

(圖4)

A: 上調(diào)基因富集的KEGG通路; B: 下調(diào)基因富集的KEGG通路。圖中–log10越大, 表示該通路越顯著。橫坐標(biāo)表示富集值, 縱坐標(biāo)表示富集的通路。圓圈大小表示基因數(shù)量。

A: the enrichment of upregulated genes in the KEGG; B: the enrichment of downregulated genes in the KEGG. The figure shows that the –log10is greater, the pathway is more significant. The horizontal axis represents the enrichment value, and the vertical axis represents the pathway of enrichment. The size of the circle indicates the number of genes.

圖5 8號(hào)染色體定位區(qū)間內(nèi)基因的表達(dá)分析

A: 8號(hào)染色體定位區(qū)間內(nèi)基因半定量PCR分析; B: 8號(hào)染色體定位區(qū)間內(nèi)基因熒光定量PCR分析。紅色方框表示野生型和突變體表達(dá)量差異最大的基因, 采用學(xué)生測(cè)驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)(**:≤ 0.01), 誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差(= 3)。

A: the semi quantitative PCR analysis of genes in the mapping interval of chromosome 8; B: the quantitative RT-PCR analysis of genes in the mapping interval of chromosome 8. The red box indicates the most differentially expressed gene between wild type and mutant. The significant test was carried out by the student’s-test (**:≤ 0.01). The error bars indicate the SDs (= 3).

3 討論

葉片皺縮受2對(duì)隱性基因的控制, 分別位于18號(hào)和8號(hào)染色體上, 只有2對(duì)基因同時(shí)突變?yōu)殡[性時(shí), 才出現(xiàn)類(lèi)似花葉病毒感染的特征, 其中任何一對(duì)基因?yàn)轱@性時(shí), 都不出現(xiàn)花葉病毒的癥狀, 所以推測(cè)這2對(duì)基因是同源基因且功能冗余。根據(jù)SoyBase網(wǎng)站參考基因組的序列信息, 18號(hào)染色體定位區(qū)間內(nèi)有兩段序列的重復(fù)序列剛好位于8號(hào)染色體的定位區(qū)間之內(nèi), 且此區(qū)域內(nèi)8號(hào)染色體的基因密度大于18號(hào)染色體。根據(jù)前人的研究結(jié)果, 由于不對(duì)稱(chēng)進(jìn)化, 18號(hào)染色體著絲粒及周?chē)鷧^(qū)域與8號(hào)染色體短臂有大量的同源基因, 全基因組復(fù)制事件之后, 這些基因經(jīng)歷了從常色狀態(tài)到異色狀態(tài)的完全或部分切換, 或者剛好相反[23], 因此推測(cè)和基因也是由同源基因進(jìn)化而來(lái)的。

在大豆基因組測(cè)序沒(méi)有完成之前, 研究者利用經(jīng)典遺傳學(xué)中同源基因的遺傳特性及基因定位能夠推斷其同源連鎖群, 這對(duì)于研究大豆的進(jìn)化是十分有利的。Lohnes等[24-25]揭示了和位點(diǎn)共同調(diào)控子葉顏色的遺傳機(jī)制, 只有2個(gè)位點(diǎn)都為隱性即時(shí), 子葉為綠色, 其余基因型都為黃色, 并且驗(yàn)證了和所在連鎖群為部分同源連鎖群。Fang等[26]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),和與擬南芥和水稻中的SGR (STAY-GREEN)基因是同源基因, 與本研究不同的是,與在衰老早期均抑制了葉綠素的降解, 但在衰老后期的抑制作用沒(méi)有強(qiáng)烈, 表明基因與基因的功能并非完全冗余。

為適應(yīng)進(jìn)化, 多倍體植物中重復(fù)基因可能發(fā)生假基因化、亞功能化或新功能化[27], Ji等[28]認(rèn)為染色體或片段重復(fù)在基因家族的擴(kuò)張過(guò)程中起到了重要作用。重復(fù)基因往往在轉(zhuǎn)錄水平上有差異, 從而引起表型的變化[29]。大豆生長(zhǎng)習(xí)性基因()有4個(gè)同源基因, 但功能已經(jīng)發(fā)生了變化, 它們?cè)诓煌l(fā)育階段有不同的表達(dá)模式, 而且在群體中的變異位點(diǎn)也是不同的[30]。多倍體由于增加了遺傳變異和復(fù)制基因的緩沖作用, 對(duì)極端環(huán)境具有更強(qiáng)的耐受性, Chen等[31]篩選到一個(gè)新的既受到除草劑選擇也發(fā)生了多倍化擴(kuò)增的基因, 并驗(yàn)證了該基因與氰氟草酯和惡唑酰草胺的結(jié)構(gòu)相互作用, 從分子水平揭示了多倍體雜草具有更強(qiáng)的除草劑適應(yīng)性的原因。

到目前為止, 大豆中對(duì)于類(lèi)病變皺葉突變體相關(guān)基因挖掘較少, 其所在代謝通路上下游關(guān)系還不明確。而擬南芥中研究較多, 如過(guò)表達(dá)或者下調(diào)其靶基因, 影響茉莉酸合成通路, 促進(jìn)細(xì)胞增殖或者葉片皺縮[32]。擬南芥膽色素原脫氨酶缺失導(dǎo)致葉片發(fā)育畸形, 細(xì)胞壞死, 生長(zhǎng)受到抑制, 開(kāi)花延遲, 并觸發(fā)植物防御機(jī)制激活[33]。擬南芥突變體葉脈扭曲并開(kāi)叉形成雙脈, 并且側(cè)根異常彎曲, 細(xì)胞非正常擴(kuò)張, 游離生長(zhǎng)素水平正常, 但是運(yùn)輸受到損害[34]。擬南芥和突變體葉脈不能形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu), 變成沿主脈的狹長(zhǎng)一條, 且形狀不規(guī)則, 葉緣有缺刻, 作者推測(cè)是由于生長(zhǎng)素分布不均勻?qū)е碌腫35]。葉脈與葉肉發(fā)育不協(xié)調(diào), 葉緣形成不規(guī)則褶皺, 葉面積大大減小, 而葉肉細(xì)胞密度大大增加, 推測(cè)可能跟生長(zhǎng)素分配不均有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究利用大豆類(lèi)病變皺葉突變體與W82、KF1、KF35構(gòu)建的F2、F2:3雜交群體, 用SSR和SNP等分子標(biāo)記進(jìn)行基因定位, 將目的基因1 ()縮小到18號(hào)染色體937 kb區(qū)間內(nèi), 包含66個(gè)候選基因, 將目的基因2 ()縮小到8號(hào)染色體130 kb區(qū)間內(nèi), 包含15個(gè)候選基因, 并根據(jù)表達(dá)譜芯片和qPCR的結(jié)果, 推測(cè)是候選基因。

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附表1 本研究所用到的引物

Table S1 Primers used in this study

引物名稱(chēng)Primer name正向引物Forward primer (5￠-3￠)反向引物Reverse primer (5￠-3￠) BARCSOYSSR_18_0415GCTTGGCGAATTCCATCTAAATTCATTTCACATCCCAGGC BARCSOYSSR_18_0419TTTATTATGGGGATCAAATTAAAACTTCGGAGTTAGCCAAATCAAAT BARCSOYSSR_18_0485AAGGATTGGCAAAGCGATTAAAAAACAGGGTTTGGTGGGT BARCSOYSSR_18_0444TTGACGGCCTTATTTTGGACGGTGGCTGAATCCAAGACAT BARCSOYSSR_18_0481ATCTCAAGGATCTGGCAAGCAATATTCTTTGGCGGTGGTG BARCSOYSSR_08_1700CCTTTAATCAACTCTGTGAGATCGGCATAATGCTATTCTCCGCA BARCSOYSSR_08_1800ACAAGGAGATTTGGCTTTGCCCGGAGATCGATAAGTTGCT BARCSOYSSR_08_1724CATTGGAGCTTGGTAAGGGAGGGAGCAGAGAACTTGAGCA BARCSOYSSR_08_1736TCCTTTTTGAAAACGAAATTCAGAGTACATTGGAATAACTGTGCAA BARCSOYSSR_08_1724CATTGGAGCTTGGTAAGGGAGGGAGCAGAGAACTTGAGCA BARCSOYSSR_08_1738TGTTAGGGACACACTCAACCCCCACGAGATAAGACGAGCAA BARCSOYSSR_08_1753CCAGCCACTTCACAGACTGATTGGGTTATCTGTTTGCTTTGTT SSR18GGCTTGACTCTCTGAATCTGTTTAAACAACTTTGAGCCAACGGC SSR40ACAAACCTGGTTCGGCTATGTTTACCAAAGCAGTGGGAGCC Satt409CCTTAGACCATGAATGTCTCGAAGATACTTAAGGACACGTGGAAGATGACTAC SNP1TTCGAAGGAACTTACTCATTACCAACATTCTCAAGCCCAAGG SNP2AGCACGATTCTACCTCCGAATGGTAGGCAATCTGAACTCATCA SNP3AGGGATATGGTTCATCTTTCATCTATGATGTGTTATGTGCATAT Glyma.08g332000QRTGGCGTCCAGGATTTACAAAGTTGATATTGCACCAGGCTTTGA Glyma.08g332100QRTCATGGCTGGCTTTAAGAGGAAGTATCAAAGAAGGAGCCGTT Glyma.08g332200QRTACTACGGTGCATCAGAGATTCTCAGTGCAATCATAACTGTGGTA Glyma.08g332300QRTGGCCGCTACCATCAACTTCAAGCTCTAGTGAACTACGGCATT Glyma.08g332400QRTTGCCTTCACACATTATAAACAGGTATGGTTTCCACTTCCGACCC Glyma.08g332500QRTAATGAGAGAACAAAGGGAAGAGGGAGTCACAAAGCAACCCACAG Glyma.08g332600QRTGATGTGGTGCAGAGCAAACCCACCATCGTCAAGTTGTGGC Glyma.08g332700QRTTGGTGATGAAGAACAACAGCACAAGAAGTCCTGGCCTAGC Glyma.08g332800QRTTGCTGAATCTGGCATGAACCGACGGATGGCGCAAAACAAG Glyma.08g332900QRTTTGTTGACAGTGGTATTGGCAAACCCCACACCAAACTGTCC Glyma.08g333000QRTCGGTTTGTCTATATTGTTGAAGGTTTCTCCACTGAACTGGTCCAC Glyma.08g333100QRTCCGCCCAAACCTCTGAAGATCAGACTGGAAGTTGCCAGGTA Glyma.08g333200QRTCAAGAACTGCAACTGAAAATGGTTGCATGCCAAAACTGTACACATCAC Glyma.08g333300QRTCGCCAGAACTTTGCAAGGAAACCCGAACCATTCACGACTT Glyma.08g333400QRTTGAAGCATGGCGAAGCAGTACGAACACGTGGGTCATGGAA GmActinGGTGGTTCTATCTTGGCATCCTTCGCTTCAATAACCCTA

附圖1 突變體18號(hào)和8號(hào)染色體定位區(qū)間內(nèi)候選基因氨基酸序列聚類(lèi)分析

Fig. S1 Clustering analysis of amino acid sequences of candidate genes within the mapping intervals on chromosomes 18 and 8 in the mutant

紅色方框表示8號(hào)染色體表達(dá)量差異最大的基因和18號(hào)染色體的同源基因。

The red box indicates the most differentially expressed geneon chromosome 8 and its homologous geneon chromosome 18.

Genetic analysis and two pairs of genes mapping in soybean mutantwith disease-like rugose leaf

WANG Ya-Qi1, XU Hai-Feng1, LI Shu-Guang1, FU Meng-Meng1, YU Xi-Wen1, ZHAO Zhi-Xin1, YANG Jia-Yin1,*, and ZHAO Tuan-Jie2,*

1Huaiyin Institute of Agricultural Sciences of Xuhuai Region in Jiangsu / Huai’an Key Laboratory for Agricultural Biotechnology / Key Laboratory of Germplasm Innovation in Lower Reaches of the Huaihe River, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Huai’an 223001, Jiangsu, China;2Soybean Research Institute, Nanjing Agricultural University / National Center for Soybean Improvement (Nanjing) / Key Laboratory for Biology and Genetic Improvement of Soybean (General), Ministry of Agriculture and Rural Affairs / National Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing 210095, Jiangsu, China

Research on lesion mimic mutant, mining resistance genes, and developing superior disease-resistant new soybean varieties by molecular design breeding methods can contribute to the alleviating the environmental pollution caused by chemical pesticides and drug resistance to disease. In this study, the disease-like rugose leaf mutantobtained by60Coγ mutagenesis as the male parent was crossed with W82, KF1, and KF35, respectively, to construct F2and F2:3segregating populations. Using SSR and SNP markers, target gene 1 () was narrowed to 937 kb on chromosome 18 with 66 genes and target gene 2 () was narrowed to 130 kb on chromosome 8 with 15 genes. The gene expression patterns of the wild type andwere compared using gene chip technology, and the KEGG pathways of the differentially expressed genes were assessed. Moreover, semi quantitative and quantitative RT-PCR methods were used to analyze the relative expression levels of candidate genes on chromosome 8. The results showed that the relative expression level ofinwas four times higher than the wild type. In contrast, the expression levels of other genes showed no more than double difference. Therefore, we suggest thatmay be a candidate gene for.

soybean; disease-like mutant; rugose leaf; gene expression profiles

10.3724/SP.J.1006.2024.34106

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(32201729), 淮安市自然科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(聯(lián)合專(zhuān)項(xiàng), HABL202120), 淮安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院高層次引進(jìn)人才科研啟動(dòng)發(fā)展基金(0112023014B), 淮安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院科研發(fā)展基金(HNY202221), 江蘇省種業(yè)振興揭榜掛帥項(xiàng)目(JBGS[2021]057)和江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目(JCIC-MCP)資助。

The study was supported by the National Natural Science Foundation of China (32201729), the Natural Science Research Program of Huai’an (Joint Special Project, HABL202120), the Scientific Research Fund of Startup and Development for Introduced High-level Talents, Huai’an Academy of Agricultural Sciences (0112023014B), the Research and Development Fund Project of Huai’an Academy of Agricultural Sciences (HNY202221), the Core Technology Development for Breeding Program of Jiangsu Province (JBGS[2021]057), and the Jiangsu Collaborative Innovation Center for Modern Crop Production (JCIC-MCP) Program.

趙團(tuán)結(jié), E-mail: tjzhao@njau.edu.cn; 楊加銀, E-mail: hynksyjy@163.com

E-mail: yqwang_01@126.com

2023-06-27;

2023-10-23;

2023-11-14.

URL: https://link.cnki.net/urlid/11.1809.S.20231113.1429.005

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