張 敏, 王錦平, 何 勇

(四川省遂寧市中心醫(yī)院 手麻部, 四川 遂寧, 629000)

心肌損傷主要見于各種原因?qū)е碌男募∑髻|(zhì)性病變,最常見的是心肌炎。青年多見于心肌細(xì)胞被病毒侵犯,從而出現(xiàn)胸悶、心慌、氣短等癥狀,中老年患者多見于冠心病、心肌缺血、心肌細(xì)胞受損?；颊呖杀憩F(xiàn)為活動(dòng)后的心前區(qū)疼痛,持續(xù)性的心前區(qū)疼痛見于心肌梗死、心肌缺血、心肌細(xì)胞壞死[1-2]。研究[3-4]表明,缺氧、復(fù)氧會(huì)引起心肌細(xì)胞損傷。利多卡因是可卡因的一種衍生物,是目前防治急性心肌梗死及各種心臟病并發(fā)快速室性心律失常的藥物[5-6]。微小RNA-181a(miR-181a)是一個(gè)功能miRNA, 研究[7]表明,下調(diào)miR-181a-5p可減輕冠狀動(dòng)脈微栓塞引起的心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。miR-181a通過調(diào)節(jié)AKT信號(hào)通路影響大鼠心肌缺血再灌注損傷[8]。但miR-181a是否參與利多卡因在心肌損傷中的作用尚未見報(bào)道。本研究主要探討利多卡因通過調(diào)控miR-181a對(duì)缺氧/復(fù)氧(H/R)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9C2損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料

心肌細(xì)胞H9C2購自中科院上海細(xì)胞庫; DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購于美國Sigma公司; 胰蛋白酶購于美國Hyclone公司; MTT試劑購自北京百奧萊博生物科技有限公司; Annerxin V/FITC試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所; BCA試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司; 于武漢博士德生物工程有限公司購置一抗和HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗; 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)所有試劑盒購自大連寶生物科技有限公司; 丙二醛(MDA)、乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒購自南京建成生物工程研究所; 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞處理與分組: H9C2細(xì)胞在含100 mL/L的FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),置于體積分?jǐn)?shù)為50 mL/L CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底80%～90%時(shí),用胰蛋白酶進(jìn)行消化,進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞,在95% N2、5% CO2的培養(yǎng)箱缺氧培養(yǎng)6 h, 更換正常培養(yǎng)基,培養(yǎng)4 h, 建立H/R模型,作為H/R組; 正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照(Con)組。基于先前的研究[9], 使用1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L利多卡因處理H/R誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞,并分別設(shè)為1.0 μmol/L組、2.5 μmol/L組、5.0 μmol/L組、10.0 μmol/L組和20.0 μmol/L組; 將anti-miR-NC、anti-miR-181a分別轉(zhuǎn)染至H/R誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞,記為H/R+anti-miR-NC組、H/R+anti-miR-181a組; 將miR-NC、miR-181a分別轉(zhuǎn)染至H/R誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞,再用20 μmol/L利多卡因處理,分別記為H/R+miR-NC+20 μmol/L組、H/R+miR-181a+20 μmol/L組。

1.2.2 MTT實(shí)驗(yàn): 在96孔板中,每孔20 μL MTT溶液(5 mg/mL)被添加到H9C2細(xì)胞溫育4 h, 棄上清后, 加入150 μL二甲基亞砜,于震蕩儀上震蕩反應(yīng)10 min,待結(jié)晶物完全溶解后,依據(jù)全自動(dòng)酶標(biāo)儀各孔A值被評(píng)估于490 nm處。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù): 磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌,胰蛋白酶消化, 1 000轉(zhuǎn)/min轉(zhuǎn)速離心5 min后,收集的細(xì)胞用PBS洗滌,加入結(jié)合緩沖液100 μL重懸,隨后添加5 μL Annexin V-FITC。上機(jī)檢測(cè)前混合5 μL PI, 室溫靜置20 min后,基于流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡(Western blot): 用RIPA蛋白裂解液提取H9C2細(xì)胞總蛋白,采用BCA統(tǒng)一定量。通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后,樣本被轉(zhuǎn)膜、封閉,加入半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)(1∶1 000)一抗稀釋液, 4 ℃孵育過夜,洗膜緩沖液(TBST)洗滌,隨后在(1∶2 000)二抗稀釋液中室溫浸泡 1 h, 暗室曝光顯影。最后,采用Quantityone軟件分析條帶灰度值。

1.2.5 RT-qPCR 檢測(cè)miR-181a表達(dá): 采用TRIzol試劑從各組細(xì)胞中提取總RNA, 使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Real-time PCR試劑盒分別執(zhí)行反轉(zhuǎn)錄和RT-qPCR。程序?yàn)?5 ℃ 5 min, 95 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 共循環(huán)40次。此外, miR-181a上游引物5′-GGGCAGCCTTAAGAGGA-3′, 下游引物5′-CAGTGCGTGTCGTGGA-3′;U6上游引物5′-TTGGTATCGTGGAA-GGACTCA-3′, 下游引物5′-TGTCATCATATTTGGCAGGTT-3′。采用 2-△△Ct法計(jì)算miR-181a相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 試劑盒檢測(cè)MDA含量及LDH、SOD活性: 收集各組細(xì)胞,提取上清液,使用試劑盒檢測(cè)MDA含量及LDH、SOD活性,實(shí)驗(yàn)步驟按照操作說明書進(jìn)行。

1.2.7 ELISA檢測(cè)炎性因子水平: 收集各組細(xì)胞, PBS清洗2次后充分裂解細(xì)胞, 3 500轉(zhuǎn)/min離心10 min。取上清液,使用ELISA試劑盒檢測(cè)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 利多卡因?qū)/R誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞活性的影響

與Con組相比, H/R組的細(xì)胞活性降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與H/R組相比, 1.0、2.5 μmol/L組的細(xì)胞活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 5.0、10.0、20.0 μmol/L利多卡因處理的細(xì)胞活性提高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 且呈劑量依賴性。因此,后續(xù)以20.0 μmol/L利多卡因進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。見表1。

表1 利多卡因?qū)/R誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞活性的影響 %

2.2 利多卡因?qū)/R誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡的影響

與Con組相比, H/R組細(xì)胞凋亡率、Caspase-3蛋白表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與H/R組相比, 20.0 μmol/L組細(xì)胞凋亡率、Caspase-3蛋白表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2、圖1。

A: 凋亡圖; B: 蛋白條帶圖。

表2 利多卡因?qū)/R誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡的影響

2.3 利多卡因?qū)/R誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎性因子的影響

與Con組相比, H/R組細(xì)胞MDA含量、LDH活性以及炎性因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)水平升高, SOD活性降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與H/R組相比, 20.0 μmol/L組MDA含量、LDH活性以及炎性因子水平降低, SOD活性提高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 利多卡因?qū)/R誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎性因子的影響

2.4 抑制miR-181a表達(dá)對(duì)H/R誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡的影響

與H/R+anti-miR-NC組相比, H/R+anti-miR-181a組細(xì)胞miR-181a表達(dá)、凋亡率、Caspase-3蛋白表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2、表4。

圖2 蛋白條帶圖

表4 利多卡因?qū)/R誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡的影響

2.5 抑制miR-181a表達(dá)對(duì)H/R誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎性因子的影響

與H/R+anti-miR-NC組相比, H/R+anti-miR-181a組的細(xì)胞miR-181a表達(dá)、MDA含量、LDH活性以及TNF-α、IL-1β、IL-6降低, SOD活性升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表5 抑制miR-181a表達(dá)對(duì)H/R誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎性因子的影響

2.6 過表達(dá)miR-181a逆轉(zhuǎn)利多卡因?qū)/R誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞損傷的影響

與H/R+miR-NC+20 μmol/L組相比,H/R+miR-181a+20 μmol/L組細(xì)胞凋亡率、Caspase-3蛋白表達(dá)升高, MDA含量、LDH活性以及TNF-α、IL-1β、IL-6升高, SOD活性降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3、表6。

圖3 蛋白圖

表6 過表達(dá)miR-181a逆轉(zhuǎn)利多卡因?qū)/R誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎性因子的影響

3 討 論

心肌細(xì)胞損傷一般表現(xiàn)為心肌細(xì)胞缺血以及炎癥、肥大、壞死等情況。造成心肌細(xì)胞損傷的原因有很多,包括缺氧、生物因素、物理因素、化學(xué)因素、營養(yǎng)失衡、神經(jīng)內(nèi)分泌因素、免疫因素、遺傳缺陷以及社會(huì)心理因素等[10-14]。

利多卡因是最常用的局部麻醉劑之一,也是多種心臟病的抗心律失常藥物。研究[9, 15]表明,利多卡因還具有多種藥理作用,包括抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤和抗氧化作用。目前,已經(jīng)有許多研究報(bào)道利多卡因?qū)π呐K疾病具有良好效果。研究[16]表明,患者應(yīng)用利多卡因可減輕心肌細(xì)胞損害,通過調(diào)控LDH、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和α-羥丁酸脫氫酶(α-HBDH), 且麻醉時(shí)間快,維持時(shí)間長,效果良好。研究[17]表明,在成人單純二尖瓣置換術(shù)中應(yīng)用利多卡因,可以提高心臟手術(shù)中的心臟停搏效果。研究[18]表明,利多卡因?qū)夏晷呐K手術(shù)患者具有較好的麻醉效果,具有一定的心肌保護(hù)作用; 研究[19]表明,利多卡因預(yù)處理促進(jìn)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的活性,可抑制凋亡; 研究[20]表明,利多卡因預(yù)處理通過影響時(shí)鐘基因BMAL1, 改善甲基乙二醛培養(yǎng)的H9C2心肌細(xì)胞的H/R損傷。本研究發(fā)現(xiàn), H/R誘導(dǎo)后心肌細(xì)胞活性顯著降低,但利多卡因可以顯著提高細(xì)胞活性。H/R誘導(dǎo)后心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高,但20.0 μmol/L利多卡因可顯著降低細(xì)胞凋亡率。H/R誘導(dǎo)后心肌細(xì)胞MDA含量、LDH活性以及TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著升高, SOD活性顯著降低; 但20.0 μmol/L利多卡因顯著降低MDA含量、LDH活性以及TNF-α、IL-1β、IL-6水平,顯著升高SOD 活性。由此說明,利多卡因可以降低心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激和炎癥水平,從而保護(hù)細(xì)胞免受低氧誘導(dǎo)的損傷。

miRNAs已被證實(shí)參與調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的損傷。miR-488-3p通過靶向ZNF791抑制急性心肌梗死誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[21]。miR-542-5p通過抑制自噬,加重缺氧/再氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷[22]。本研究表明,抑制miR-181a表達(dá)可顯著降低心肌細(xì)胞凋亡率、MDA含量、LDH活性以及TNF-α、IL-1β、IL-6水平,顯著升高SOD活性,說明抑制miR-181a表達(dá),降低了細(xì)胞的氧化應(yīng)激和炎癥水平,表明miR-181a能夠加重氧化應(yīng)激條件下心肌細(xì)胞損傷。重要的是,與H/R+anti-miR-NC+20 μmol/L組相比, H/R+anti-miR-181a+20 μmol/L組細(xì)胞凋亡率、Caspase-3蛋白表達(dá)顯著升高, MDA含量、LDH活性以及TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著升高, SOD活性顯著降低,說明利多卡因通過干擾miR-181a表達(dá)抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。

綜上所述,利多卡因通過抑制miR-181a表達(dá),進(jìn)而抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9C2損傷,這為利多卡因治療心肌損傷提供了理論基礎(chǔ)。