張峰程，張 君，李 凡，郭 維

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，北京 100193)

玉米不僅是中國的主要糧食作物之一，也是重要的飼料原料和工業(yè)原料，在國民經(jīng)濟(jì)中發(fā)揮著重要作用。隨著全球氣候變暖、秸稈還田、栽培模式的改變和品種的更換，玉米病蟲害在中國呈持續(xù)高發(fā)趨勢，已成為制約中國玉米高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的重要限制性因素之一[1]。玉米莖、穗腐病是一種在全球范圍內(nèi)普遍發(fā)生的病害，擬輪枝鐮孢菌(Fusarium verticillioides)是引起該病害的主要病原菌之一，該菌可以在玉米整個(gè)生育期進(jìn)行侵染。擬輪枝鐮孢菌可以通過帶菌種子或土壤中的病菌進(jìn)入初生根，從地下部開始侵染，并向上進(jìn)入植株莖基部[2-3]；其分生孢子也可以通過氣流到達(dá)花絲進(jìn)而侵染玉米穗部，或落到葉鞘縫隙處侵染玉米莖節(jié)或葉鞘組織[4]。擬輪枝鐮孢菌在造成玉米減產(chǎn)的同時(shí)還產(chǎn)生多種真菌毒素，在玉米生產(chǎn)、收獲、儲(chǔ)藏、加工和運(yùn)輸過程中持續(xù)為害，嚴(yán)重威脅糧飼安全。因此，了解擬輪枝鐮孢菌侵染玉米的過程對(duì)玉米莖、穗腐病的防控具有重要意義。

綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)和紅色熒光蛋白(red fluorescent protein，RFP)是最常見的標(biāo)記蛋白，RFP 變種mCherry 是一種作為示蹤劑的紅色熒光染料，它們均具有穩(wěn)定、使用方便、無物種專一性、易于在活細(xì)胞中觀察等優(yōu)點(diǎn)。熒光蛋白標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，如研究蛋白的定位及時(shí)空示蹤、基因表達(dá)、微生物與寄主的相互作用等過程[5-7]。目前，熒光蛋白標(biāo)記已經(jīng)應(yīng)用于研究尖孢鐮孢菌(F.oxysporum)[8]、禾谷鐮孢菌(F.graminearum)[9]、稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)[10]、黃曲霉(Aspergillus flavus)[11]等病原菌的侵染過程和有性生殖等，但鮮有關(guān)于擬輪枝鐮孢菌的研究。擬輪枝鐮孢菌是異宗配合子囊菌，只有在2 種不同交配型(MAT-1和MAT-2)的菌株間才可以進(jìn)行有性生殖[12-13]。因此，本研究通過聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法分別將eGFP和mCherry熒光蛋白基因?qū)氲讲煌慌湫偷臄M輪枝鐮孢菌菌株FvLNF15-11 和Fv-SHF19-37 中，以期為研究擬輪枝鐮孢菌的侵染過程、有性生殖和致病機(jī)制提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料、試劑和儀器

1.1.1 供試材料

供試植物材料為對(duì)擬輪枝鐮孢菌引起的玉米莖、穗腐病表現(xiàn)感病的玉米自交系B73 植株，種子由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所惠贈(zèng)。供試擬輪枝鐮孢菌菌株FvLNF15-11 和FvSHF19-37 分別分離自遼寧和上海采集的玉米病樣；供試質(zhì)粒包括pMD18T-TrpCP、pMD18T-TrpCT、pMD18-T-eGFP、pMD18T-mCherry 和pCOM；菌株和質(zhì)粒均由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全收貯運(yùn)管控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑

PCR 高保真DNA 聚合酶(P520-01)、膠回收試劑盒(DC301-01)、質(zhì)粒小提試劑盒(DC201-01)和無縫克隆試劑盒(C113)均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。供試溶菌肉湯培養(yǎng)基(luria-bertani medium，LB)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar medium，PDA)、酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(yeast extract peptone dextrose medium，YEPD)、完全培養(yǎng)基(complete medium，CM)和胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基(carrot agar medium，CA)為微生物常用培養(yǎng)基，再生液體培養(yǎng)基(regeneration liquid medium，RLM)和再生瓊脂培養(yǎng)基(regeneration agar medium，RAM)的配制參考RIDENOUR 等[14]的方法。試驗(yàn)所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.1.3 主要儀器

艾本德臺(tái)式高速離心機(jī)(Eppendorf 5810 R)；伯樂PCR 儀(C1000)；北京六一瓊脂糖水平電泳儀(DYCP-31DN)；上海勤翔凝膠成像分析系統(tǒng)(GeneSons 2000)；奧林巴斯光學(xué)顯微鏡(CX23)；激光共聚焦顯微鏡(蔡司LSM 880)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 擬輪枝鐮孢菌交配類型鑒定

采用十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyltrimethy ammonium bromide，CTAB)法提取菌株基因組[15]，使用MAT-1基因座和MAT-2基因座特異性引物(表1)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增以確定擬輪枝鐮孢菌FvLNF15-11 和FvSHF19-37 的交配型[16]。

表1 本研究所使用的引物Tab.1 Primer sequences used in this study

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和酶切

以質(zhì)粒pMD18T-TrpCP 和pMD18T-TrpCT 為模板，通過引物TrpCPF/TrpCPR 和TrpCTF/Trp-CTR (表1)分別擴(kuò)增構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)trpC基因啟動(dòng)子TrpCP 和終止子TrpCT 序列片段，利用無縫克隆的方法[17]將上述片段構(gòu)建到質(zhì)粒p-COM 中得到載體pCOM-TrpCP-TrpCT。以質(zhì)粒pMD18T-eGFP 和pMD18T-mCherry 為模板，通過引物TeGFPF/TeGFPR 和TmCherryF/TmCherryR (表1)分別擴(kuò)增eGFP和mCherry基因片段，利用無縫克隆的方法[17]將上述片段構(gòu)建到pCOMTrpCP-TrpCT 載體，得到質(zhì)粒pCOM-eGFP 和pCOM-mCherry，以G418 抗生素作為篩選標(biāo)記。用限制性內(nèi)切酶HindⅢ對(duì)質(zhì)粒pCOM-eGFP 和pCOM-mCherry 進(jìn)行酶切，使其線性化。

1.2.3 PEG 介導(dǎo)的擬輪枝鐮孢菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化

將從PDA 平板上收集到的擬輪枝鐮孢菌分生孢子接種于YEPD 培養(yǎng)基中，搖培過夜使孢子萌發(fā)為幼殖體。2 500 r/min 離心5 min 收集幼殖體，用20 mL 0.7 mol/L NaCl 重懸和清洗幼殖體2 次，2 500 r/min 離心5 min 后棄上清；用10 mL 0.7 mol/L NaCl 重懸幼殖體，加入酶解液(0.1 g 溶壁酶和0.1 g 崩潰酶溶解于10 mL 0.7 mol/L Na-Cl 中) 10 mL，于28 ℃、150 r/min 條件下酶解3 h，然后在4 ℃、2 500 r/min 條件下離心5 min 收集原生質(zhì)體；經(jīng)預(yù)冷的0.7 mol/L NaCl 溶液重懸和清洗后，再用預(yù)冷的0.7 mol/L NaCl 溶液500 μL重懸原生質(zhì)體。取HindⅢ線性化的質(zhì)粒pCOMeGFP 和pCOM-mCherry 10 μL 分別加入100 μL FvLNF15-11 和FvSHF19-37 的原生質(zhì)體中，冰上靜置30 min 后加入40% PEG 溶液100 μL，室溫放置20 min；加入RLM 培養(yǎng)基800 μL，在25 ℃、100 r/min 搖床中搖培過夜。將復(fù)壁后的溶液加到含有100 μg/mL G418 抗生素的RAM 培養(yǎng)基50 mL中，混勻后倒板，在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～4 d 后進(jìn)行轉(zhuǎn)化子篩選鑒定[14]。

1.2.4 轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證及遺傳穩(wěn)定性

以轉(zhuǎn)化子的基因組為模板，用eGFP基因、m-Cherry基因和抗性基因neo的特異性引物(表1)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增以驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子，利用激光共聚焦顯微鏡對(duì)PCR 驗(yàn)證到的陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行熒光檢測；觀察到熒光的轉(zhuǎn)化子在無G418 抗生素的PDA 培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)5 代，再轉(zhuǎn)接到含有G418 抗生素的PDA 培養(yǎng)基上，觀察菌株能否正常生長，以確認(rèn)eGFP基因和mCherry基因在轉(zhuǎn)化子中的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.5 熒光標(biāo)記菌株生長特性的觀察

(1)菌落形態(tài)觀察及生長速率測定

GFP 標(biāo)記菌株FvLNF15-11-eGFP、mCherry標(biāo)記菌株FvSHF19-37-mCherry 和相應(yīng)的野生型菌株分別在PDA 培養(yǎng)基活化5 d，用直徑為1 cm的吸頭打邊緣菌餅并轉(zhuǎn)接到新的PDA 培養(yǎng)基上；在25 ℃培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)6 d 后，在2 個(gè)垂直方向上測量菌落直徑并拍照，每個(gè)處理重復(fù)3 次[18]。

(2)產(chǎn)孢量統(tǒng)計(jì)和孢子形態(tài)觀察

用直徑為1 cm 的吸頭打1 個(gè)邊緣菌落至1 mL ddH2O 中，旋渦振蕩2 min，用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)孢子數(shù)量并觀察孢子形態(tài)，每個(gè)處理統(tǒng)計(jì)3 次[18]。

1.2.6 熒光標(biāo)記菌株的致病性測定

(1)孢子懸浮液的制備

將待測菌株接種于CM 液體培養(yǎng)基中，于25 ℃、150 r/min 條件下?lián)u培3 d，使用滅菌的3 層擦鏡紙過濾菌液，收集分生孢子，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并調(diào)節(jié)孢子懸浮液密度為1×106mL-1[18]。

(2)玉米莖稈的接種

玉米自交系B73 種子消毒后種植于溫室，待玉米長到10 葉期時(shí)，挑選長勢一致的玉米進(jìn)行接種。用滅菌牙簽在玉米第2、3 莖稈中間扎孔，用注射器接種孢子懸浮液，再用滅菌紗布包裹接種處，期間用ddH2O 保濕2 次；接種7 d 后，沿接種處縱向劈開玉米莖稈并拍照，利用ImageJ 統(tǒng)計(jì)病斑面積。以接種ddH2O 作為陰性對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3 次[18]。

1.2.7 熒光標(biāo)記菌株間的雜交及子囊殼產(chǎn)生情況

將菌株FvLNF15-11 和FvLNF15-11-eGFP 作為母本培養(yǎng)于CA 培養(yǎng)基，菌株SHF19-37 和SHF19-37-mCherry 作為父本培養(yǎng)于CM 固體培養(yǎng)基，于25 ℃條件下培養(yǎng)7 d 后，用2.5%吐溫60沖洗父本菌株菌落并收集分生孢子，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并調(diào)節(jié)孢子懸浮液密度為1×108mL-1。吸取父本孢子懸浮液1 mL 均勻涂布于母本菌株表面制成雜交平板，再將平板置于25 ℃、黑光燈條件下進(jìn)行光照12 h/黑暗12 h 的循環(huán)誘導(dǎo)[13,19]，培養(yǎng)4 周后觀察子囊殼的產(chǎn)生情況。以FvLNF15-11 與FvSHF19-37 菌株的雜交結(jié)果作為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬輪枝鐮孢菌的交配類型

由圖1 可知：使用MAT-1基因座和MAT-2基因座特異性引物從菌株FvLNF15-11 和FvSHF19-37 的基因組中分別擴(kuò)增出800 和250 bp 的片段，表明菌株FvLNF15-11 為MAT-2型，菌株FvSHF-19-37 為MAT-1型。

圖1 野生型菌株FvLNF15-11 和FvSHF19-37 的交配類型Fig.1 Mating types of the wild-type strains FvLNF15-11 and FvSHF19-37

2.2 質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化子的篩選與鑒定

利用無縫克隆的方法成功構(gòu)建了pCOM-eGFP 和pCOM-mCherry 載體(圖2a)。通過PEG 介導(dǎo)的原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化后，利用eGFP基因和neo基因特異性引物從FvLNF15-11-eGFP 轉(zhuǎn)化子中分別擴(kuò)增出650 和795 bp 的片段(圖2b～c)；利用m-Cherry基因和neo基因特異性引物從FvSHF19-37-mCherry 轉(zhuǎn)化子中分別擴(kuò)增出711 和795 bp 的片段(圖2d～e)。PCR 擴(kuò)增的片段大小與預(yù)期一致，表明eGFP基因和mCherry基因已分別整合到FvLNF15-11 和FvSHF19-37 菌株的基因組中。

圖2 質(zhì)粒圖譜及熒光標(biāo)記轉(zhuǎn)化子PCR 鑒定的電泳圖Fig.2 Plasmid map and electrophoresis image for PCR identification of fluorescently labeled transformants

2.3 熒光標(biāo)記菌株的熒光觀察及遺傳穩(wěn)定性

熒光檢測結(jié)果(圖3)顯示：菌株FvLNF15-11-eGFP 的分生孢子和菌絲中觀察到綠色熒光，菌株FvSHF19-37-mCherry 的分生孢子和菌絲中觀察到紅色熒光，而野生型菌株中未觀察到熒光，表明eGFP基因和mCherry基因在相應(yīng)的菌株中成功表達(dá)。熒光標(biāo)記菌株繼代培養(yǎng)5 代后轉(zhuǎn)接到含G418 抗生素的PDA 平板上繼續(xù)培養(yǎng)，菌株能正常生長，表明eGFP基因和mCherry基因能夠穩(wěn)定遺傳。

2.4 熒光標(biāo)記菌株的生長特性

由圖4 可知：熒光標(biāo)記菌株的菌落形態(tài)、孢子形態(tài)、生長速率和產(chǎn)孢量與野生型菌株無明顯差異，表明eGFP基因和mCherry基因的插入不影響熒光標(biāo)記菌株FvLNF15-11-eGFP 和FvSHF19-37-mCherry 的生長發(fā)育。

圖4 熒光標(biāo)記擬輪枝鐮孢菌的生長特性Fig.4 Growth characteristics of fluorescently labeled F.verticillioides

2.5 熒光標(biāo)記菌株的致病性

熒光標(biāo)記菌株和野生型菌株接種玉米莖稈后，玉米莖稈組織均出現(xiàn)褐色病斑及腐爛，而接種無菌水的對(duì)照未觀察到癥狀(圖5a)；熒光標(biāo)記菌株的病斑面積與野生型菌株的病斑面積差異不顯著(圖5b)，表明熒光標(biāo)記菌株能侵染玉米并造成玉米莖腐病，且致病力與野生型菌株相似。

圖5 熒光標(biāo)記擬輪枝鐮孢菌的致病性Fig.5 Pathogenicity of fluorescently labeled F.verticillioides

2.6 熒光標(biāo)記菌株的有性生殖能力

由圖6 可知：通過黑光燈誘導(dǎo)后，熒光標(biāo)記菌株產(chǎn)生的子囊殼數(shù)量與野生型菌株相近，表明eGFP基因和mCherry基因不影響標(biāo)記菌株FvLNF15-11-eGFP 和FvSHF19-37-mCherry 的有性生殖能力。

圖6 熒光標(biāo)記擬輪枝鐮孢菌的有性生殖能力Fig.6 Sexual reproduction ability of fluorescently labeled F.verticillioides

3 討論

熒光標(biāo)記技術(shù)被廣泛運(yùn)用于研究病原菌的侵染過程、致病機(jī)制等[5-7]，本研究通過PEG 介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法成功構(gòu)建了不同交配型擬輪枝鐮孢菌的熒光標(biāo)記菌株FvLNF15-11-eGFP 和FvSHF19-37-mCherry，eGFP和mCherry基因在相應(yīng)菌株的菌絲和孢子中能穩(wěn)定表達(dá)。在真菌的遺傳轉(zhuǎn)化中，外源基因隨機(jī)整合到基因組中可能會(huì)影響真菌的生長發(fā)育[20]，但本研究中熒光標(biāo)記菌株的菌落形態(tài)和孢子形態(tài)與野生型菌株十分相似，且兩者的生長速率和產(chǎn)孢量無明顯差異，表明eGFP基因和mCherry基因不影響熒光標(biāo)記菌株FvLNF15-11-eGFP 和FvSHF19-37-mCherry 的 生長發(fā)育，這與WU 等[21]的研究結(jié)果相似。由于鐮孢菌通過有性生殖產(chǎn)生子囊孢子越冬完成病害循環(huán)[22]，本研究對(duì)熒光標(biāo)記菌株的有性生殖進(jìn)行測定，結(jié)果顯示熒光標(biāo)記菌株產(chǎn)生的子囊殼數(shù)量與野生型菌株相近，表明eGFP基因和mCherry基因不影響熒光標(biāo)記菌株FvLNF15-11-eGFP 和Fv-SHF19-37-mCherry 的有性生殖能力，這一結(jié)果與LUIS 等[11]的研究報(bào)道一致。本研究表明：接種擬輪枝鐮孢菌后，玉米莖稈組織出現(xiàn)褐色病斑及腐爛的發(fā)病癥狀，且熒光標(biāo)記菌株與野生型菌株的病斑面積差異并不顯著，表明熒光標(biāo)記菌株保持了與野生型菌株相似的致病力；GAI 等[23]研究顯示：eGFP 標(biāo)記的擬輪枝鐮孢菌與野生型菌株對(duì)玉米病害病情指數(shù)的影響無明顯差異，但eGFP 標(biāo)記擬輪枝鐮孢菌的毒力明顯弱于野生型菌株，這可能是由于eGFP基因隨機(jī)整合到基因組中影響某些功能基因的表達(dá)。因此，本研究構(gòu)建的熒光標(biāo)記菌株FvLNF15-11-eGFP 和FvSHF19-37-mCherry 可以更好地用于研究擬輪枝鐮孢的侵染和有性生殖等過程。

4 結(jié)論

本研究通過PEG 介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法成功將熒光蛋白基因eGFP和mCherry分別導(dǎo)入到不同交配型的擬輪枝鐮孢菌中，獲得帶有熒光標(biāo)記的FvLNF15-11-eGFP 和FvSHF19-37-mCherry 菌株。該熒光標(biāo)記不會(huì)影響擬輪枝鐮孢菌的生長發(fā)育、有性生殖以及致病力。研究結(jié)果為后續(xù)擬輪枝鐮孢菌的侵染過程、有性生殖和致病機(jī)制研究提供了材料。