李俊逸，矣曉翠，劉福翠，姚 遙，祝春月，劉一依，尹麗肖，肖關(guān)麗

(云南農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學與生物技術(shù)學院，云南 昆明 650201)

馬鈴薯塊莖蛾[Phthorimaea operculella(Zeller)]隸屬于鱗翅目(Lepidoptera)麥蛾科(Gelechiidae)，是一種寡食性害蟲，也是世界范圍內(nèi)茄科(Solanaceae)作物的主要害蟲[1-4]，在田間取食馬鈴薯葉和莖，可使馬鈴薯減產(chǎn)20%～30%[5]；在儲藏期，鉆蛀取食薯塊，引起馬鈴薯塊莖干癟或腐爛，非低溫儲藏時馬鈴薯為害率高達100%[3,6]。近年來，隨著氣候環(huán)境條件及種植結(jié)構(gòu)的變化，該蟲已成影響馬鈴薯生產(chǎn)的重要因素[7-8]，使用化學農(nóng)藥仍是防治該蟲的主要措施[7,9]。探索利用不同馬鈴薯品種對馬鈴薯塊莖蛾的抗蟲性及脅迫響應調(diào)控該蟲為害已引起許多學者的關(guān)注[4-5,10-12]，對于科學制定防控措施具有重要意義。

根際微生物在植物保護及植物生命活動中發(fā)揮著重要作用，其組成結(jié)構(gòu)及多度的變化能反映植物健康狀況[11-14]。不同植物的根際微生物群落組成結(jié)構(gòu)不同，且隨著植物的生長發(fā)育，根際微生物群落也隨之發(fā)生變化。植物根際微生物除促進植物的正常生長發(fā)育、協(xié)助植物應對包括干旱、鹽分、水、溫度等非生物脅迫外[15]，還誘導植物抵抗植物病原體和植食性昆蟲等生物脅迫[13,16-17]。MUKHTAR 等[18]對鹽水和非鹽水土壤樣品進行高通量測序分析，結(jié)果表明：土壤鹽度會影響根際微生物，且放線菌在鹽漬土樣品中占主導地位，蛋白桿菌在非鹽漬土壤樣品中占主導地位；GOODWIN[19]研究指出：多種人參根際微生物具有提高人參產(chǎn)量的潛力；馮丹等[20]研究表明：蠟狀芽孢桿菌CLY07 對南方紅豆杉有明顯促生長作用，能顯著改善其幼苗生長狀況，提高養(yǎng)分代謝能力。植物—害蟲—根際微生物互作是目前國際上研究的重點和熱點[11,13]，監(jiān)測健康和受脅迫根際的微生物群落種群和多度的變化過程，通過合理補充微生物種群可以調(diào)節(jié)重要農(nóng)作物微生態(tài)平衡，實現(xiàn)單個或簡單復配菌株無法實現(xiàn)的生態(tài)功能，從而提高農(nóng)作物的產(chǎn)量、質(zhì)量及抗病蟲害能力。植物根際微生物引起植物防御反應功能從而協(xié)助植物對抗咀嚼式昆蟲或病原微生物危害的報道較多[21-23]，一些有益根際微生物可以協(xié)助植物抵御病蟲害脅迫，如MAO 等[24]通過分析馬鈴薯黑脛病、疑似馬鈴薯黑脛病和健康環(huán)境馬鈴薯根際微生物，發(fā)現(xiàn)馬鈴薯黑脛病與根際微生物種群的組成密切相關(guān)；IDRISSI 等[25]分離篩選了不同地區(qū)的馬鈴薯塊莖和根際微生物，發(fā)現(xiàn)有多種菌株對馬鈴薯黑脛病和塊莖軟腐病表現(xiàn)出不同程度的抑制作用；馬鈴薯地上葉片通過調(diào)節(jié)MDA、H2O2和可溶性糖的含量以及SOD 和POD活性對馬鈴薯塊莖蛾取食脅迫表現(xiàn)出明顯的生理響應[5,26]。

根際微生物在馬鈴薯抵御病蟲害脅迫時發(fā)揮著重要作用[4,10]，但目前鮮有關(guān)于蛀食性害蟲取食脅迫后馬鈴薯根際細菌群落組成結(jié)構(gòu)的研究，馬鈴薯根際細菌對馬鈴薯塊莖蛾取食脅迫的響應尚不清楚。因此，本研究通過室內(nèi)分離馬鈴薯塊莖蛾取食脅迫后的馬鈴薯根際土壤，分析其中細菌微生物的組成結(jié)構(gòu)和多樣性，探究害蟲取食脅迫對馬鈴薯根際細菌群落組成結(jié)構(gòu)的影響，可為進一步篩選馬鈴薯根際有益微生物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試馬鈴薯品種為青薯9 號；供試馬鈴薯塊莖蛾為云南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院昆蟲學實驗室長期飼養(yǎng)建立的穩(wěn)定種群。

供試LB 培養(yǎng)基：參考昌艷萍等[27]的方法配制，配方包括胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，瓊脂15 g，水1 000 mL，調(diào)整pH 值為 7.0～7.2。

主要試劑及儀器：細菌通用引物27F (5 ′ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ′)和1492R (5 ′ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3 ′)、TaqPCR Mix(擎科生物科技有限公司)；LDZX-0L-I 立式高壓蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)、2-16R 型離心機(湖南恒諾儀器設備有限公司)、Mastercycler?nexus 型PCR 儀(德國 Eppendorf 公司)和DYY-2C型電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集和處理

采用云南農(nóng)業(yè)大學后山農(nóng)田土壤進行室內(nèi)盆栽(10 cm×20 cm)種植青薯9 號馬鈴薯，待馬鈴薯第5 枝側(cè)枝長出時進行馬鈴薯塊莖蛾脅迫試驗。接蟲前對馬鈴薯塊莖蛾3 齡幼蟲進行饑餓處理12 h，之后在馬鈴薯每一側(cè)枝接種馬鈴薯塊莖蛾1 頭，每株馬鈴薯接種5 頭，每組設置3 個重復。取食脅迫3、7 和14 d 時，對接蟲處理的馬鈴薯及空白對照組進行取樣。

取樣時將馬鈴薯整株挖出，抖落根際大塊土壤，將馬鈴薯根收集到加有生理鹽水25 mL的50 mL 無菌離心管中，劇烈搖動30 s，以12 377 r/min 離心10 min，去除上清液；用無菌鑷子去除根組織，沉淀即為根際土壤[28]；于-80 °C冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細菌分離培養(yǎng)和純化

采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法進行分離培養(yǎng)。在超凈工作臺上稱取馬鈴薯根際土樣 1.0 g，加入含有無菌水 9 mL 的離心管中充分振蕩稀釋，得到10-1土壤稀釋液，并依次稀釋至10-4、10-5和10-6，每個梯度 3 個處理。用移液槍吸取土壤稀釋液50 μL涂布于LB 培養(yǎng)基，再將LB 培養(yǎng)基置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d 后觀察長出的菌落[29]，并每天定時觀察菌落顏色、形態(tài)、表面光滑度等，用無菌接種環(huán)將所有菌落挑取在新的LB 平板上進行純化，反復純化2～3 次得到單菌落。

1.2.3 細菌菌種鑒定

形態(tài)學鑒定：觀察并記錄菌落的形狀和顏色、細胞大小等培養(yǎng)性狀，并使用革蘭氏染色法對所分離的細菌進行染色觀察，記錄細胞的形態(tài)及革蘭氏陰性或陽性。

分子鑒定：采用凍溶法[30]提取所有分離純化得到的根際土壤細菌菌株的基因組 DNA。分別從純化的 LB 平板中挑取單菌落加入有無菌水500 μL 的2 mL 無菌離心管中，充分振蕩，直至菌體與水混勻，將混勻的菌懸液置于液氮冰凍10 min，再沸水浴5 min，于12 000 r/min 下離心2 min，上清液即可作為PCR 模板備用。反應體系為25.0 μL，包括細菌16S rRNA 基因擴增通用引物27F 和1492R 各1.0 μL，細菌上清液1.0 μL，2×TaqPCR Mastermix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR 儀設置反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，32個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。吸取 PCR 產(chǎn)物3 μL進行凝膠電泳檢測，將合格的 PCR 產(chǎn)物送至上海生物工程股份有限公司進行雙向測序。使用 CExpress 軟件對測序結(jié)果進行比對和拼接，再將拼接后的序列提交到NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov) 查找相似性最高的典型菌株并下載序列；使用MEGA 7 軟件的鄰位相連法和 Kimura 雙參數(shù)矯正模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以重復抽樣1 000 次進行 Bootstrap 驗證，分析評估系統(tǒng)進化樹拓撲結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

根據(jù)培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌株的數(shù)量，并依據(jù)細菌形態(tài)學和分子學鑒定結(jié)果去除、整合重復的細菌菌株，按公式計算各菌株的相對多度：相對多度=單個菌株的菌落數(shù)/總菌落數(shù)×100%。采用Origin 2021 進行相對多度繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯根際土壤可培養(yǎng)細菌的種類組成

根據(jù)菌落形態(tài)特征及鑒定結(jié)果去除重復菌株，得到馬鈴薯根際細菌菌株24 株(表1)，分屬于4 門11 科15 屬22 種。脅迫3 d 時，馬鈴薯根際土壤細菌有8 種，分別為滋養(yǎng)節(jié)桿菌(Arthrobacter pascens)、大洋沉積物纖維芽孢桿菌(Cytobacillus oceanisediminis)、硝基愈創(chuàng)木膠類節(jié)桿菌(Paenarthrobacter nitroguajacolicus)、菜豆萎蔫病菌 (Curtobacterium flaccumfaciens)、稻殼羅塞略莫拉氏菌(Rossellomorea oryzaecorticis)、海水羅塞略莫拉氏菌(R.aquimaris)、長孢黃色鏈霉菌(Streptomyces longisporoflavus)和阿爾及利亞微桿菌(Microbacterium algeriense)，其中處理組特有菌株為海水羅塞略莫拉氏菌、長孢黃色鏈霉菌和阿爾及利亞微桿菌；脅迫7 d 時，馬鈴薯根際土壤細菌有8 種，分別為滋養(yǎng)節(jié)桿菌、硝基愈創(chuàng)木膠類節(jié)桿菌、菜豆萎蔫病菌、稻殼羅塞略莫拉氏菌、馬氏副球菌(Paracoccus marcusii)、加德那氏鏈霉菌 (Streptomyces gardneri)、葉片微桿菌(M.foliorum)和布魯氏菌根瘤菌(Brucella rhizospha)，其中處理組特有菌株為稻殼羅塞略莫拉氏菌和馬氏副球菌；脅迫14 d 時，馬鈴薯根際土壤細菌有7 種，分別為滋養(yǎng)節(jié)桿菌、硝基愈創(chuàng)木膠類節(jié)桿菌、菜豆萎蔫病菌、產(chǎn)吲哚金黃桿菌(Chryseobacterium indologenes)、長孢黃色鏈霉菌、布魯氏菌根瘤菌和阿氏普里斯特氏菌(Priestia aryabhattai)，其中處理組特有菌株為產(chǎn)吲哚金黃桿菌和布魯氏菌根瘤菌。

表1 馬鈴薯根際細菌菌落形態(tài)及種類組成Tab.1 Morphology and species composition of potato rhizosphere bacterial colonies

2.2 馬鈴薯根際可培養(yǎng)細菌的系統(tǒng)發(fā)育樹

由圖1 可知：系統(tǒng)發(fā)育樹可聚為4 大支，第1 大支由放線菌門(Actinobacteria)短桿菌屬(Brevibacterium)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、細桿菌屬(Microbacterium)、類節(jié)桿菌屬(Paenarthrobacter)、短小桿菌屬(Curtobacterium)和節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)組成，第2 大支由厚壁菌門(Firmicutes)細胞桿菌屬(Cytobacillus)、Rossellomorea和芽孢桿菌屬(Bacillus)組成，第3 大支由變形菌門(Proteobacteria)產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)、生絲菌屬(Hyphomicrobiales)、假單胞桿菌屬(Pseudomonas)和副球菌屬(Paracoccus)組成，擬桿菌門(Bacteroidetes)金黃桿菌屬(Chryseobacterium)為第4 大支。其中，M1 和M4 分別與其模式菌株聚為1 小支后再聚為1 大支，M2 和M8 分別與其模式菌株聚為1 小支后再聚為1 大支，說明它們雖然不屬于同一屬但2 種菌之間親緣關(guān)系較近；M12、M18 和M17 分別與其模式菌株聚為1 小支后再聚為1 大支，說明根際可培養(yǎng)細菌中的這些鏈霉菌屬菌株親緣關(guān)系較近。

圖1 基于16S rRNA 序列構(gòu)建馬鈴薯根際可培養(yǎng)細菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of culturable rhizosphere bacteria under normal potato growth based on 16S rRNA sequence

2.3 馬鈴薯塊莖蛾取食脅迫下馬鈴薯根際細菌的相對多度

由圖2 可知：在門水平上，隨著馬鈴薯塊莖蛾脅迫時間的延長，根際細菌主要優(yōu)勢菌門均為放線菌門、變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門。與對照組相比，取食脅迫3、7 和14 d 時放線菌門細菌相對多度分別增加23.49%、12.56%和28.06%，其中在脅迫第3 天時放線菌門細菌相對多度最高。

圖2 對照組 (左) 和處理組 (右) 馬鈴薯根際細菌在門水平上的相對多度Fig.2 Relative abundance of potato rhizosphere bacteria at the phylum level in control group (left) and treatment group (right)

在科水平上，馬鈴薯塊莖蛾取食脅迫影響了馬鈴薯根際可培養(yǎng)細菌的相對多度和多樣性(圖3)。與對照組相比，馬鈴薯塊莖蛾脅迫后馬鈴薯根際細菌中微球菌科(Micrococcaceae)的相對多度增加，取食脅迫3、7 和14 d 時分別增加84.31%、70.78%和80.02%；微桿菌科(Microbacteriaceae)的相對多度在脅迫3 和7 d 時分別減少59.20%和35.20%。此外，馬鈴薯根際可培養(yǎng)細菌在科水平上的菌株多樣性受馬鈴薯塊莖蛾取食脅迫的影響有所降低，在處理第3 天時效果最為明顯，隨著脅迫時間的延長，該影響逐漸趨于平緩。

圖3 對照組 (左) 和處理組 (右) 馬鈴薯根際細菌在科水平上的相對多度Fig.3 Relative abundance of potato rhizosphere bacteria at the family level in control group (left) and treatment group (right)

在屬水平上，馬鈴薯塊莖蛾取食脅迫改變了馬鈴薯根際細菌的優(yōu)勢菌屬(圖4)。與對照組相比，取食脅迫后馬鈴薯根際細菌中節(jié)桿菌屬的相對多度增加，在脅迫3、7 和14 d 時分別增加103.50%、65.37%和28.57%；短小桿菌屬的相對多度在脅迫3 和7 d 時分別減少69.49%和32.03%，在脅迫14 d 時增加63.64%。此外，取食脅迫降低了馬鈴薯根際細菌在屬水平上的細菌多樣性。

圖4 對照組 (左) 和處理組 (右) 馬鈴薯根際細菌在屬水平上的相對多度Fig.4 Relative abundance of potato rhizosphere bacteria at the genus level in control group (left) and treatment group (right)

綜上所述，馬鈴薯塊莖蛾取食脅迫第3 天時馬鈴薯根際細菌相對多度變化最明顯，隨著處理時間的延長，影響效果逐漸減弱；脅迫14 d時，馬鈴薯塊莖蛾取食脅迫與對照組之間的差異最小。

3 討論

根際是植物與土壤接觸的直接區(qū)域，生存著大量的微生物和無脊椎動物，其環(huán)境具有高度復雜的特點。植物根系通過分泌物吸引大量特定的土壤微生物，了解根際生態(tài)獨特的動態(tài)變化過程有助于更好地進行馬鈴薯田間栽培管理[31]。本研究發(fā)現(xiàn)：馬鈴薯塊莖蛾脅迫后，馬鈴薯根際細菌優(yōu)勢菌門均為放線菌門、厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門。高天鵬等[32]以堿蓬和駱駝蓬為試驗材料，通過高通量測序技術(shù)分析可知：植物根際細菌中變形菌門、厚壁菌門、放線菌門和酸桿菌門為優(yōu)勢菌門；王莉莉等[33]發(fā)現(xiàn)：干旱脅迫前后，馬鈴薯冀張薯8 號和夏波蒂苗期根際細菌優(yōu)勢菌門均為變形菌門、放線菌門、酸桿菌門、綠彎菌門和擬桿菌門；李華偉等[34]對閩薯2 號的研究顯示：晚疫病改變了馬鈴薯根際細菌的相對多度，但對其組成結(jié)構(gòu)影響不大，本研究也得到相似結(jié)果?？梢姡R鈴薯塊莖蛾取食脅迫后，馬鈴薯根際微生物主要組成趨于一致，但相對多度存在差異，反映了馬鈴薯對馬鈴薯塊莖蛾取食危害的脅迫響應與其他植物相近，但相對多度的差異是否也是馬鈴薯對塊莖蛾的抗性機理之一還需要進一步研究。此外，本研究僅測定了馬鈴薯根際可培養(yǎng)細菌組成結(jié)構(gòu)及多樣性的變化，其根際不可培養(yǎng)細菌組成結(jié)構(gòu)及多樣性的變化也有待進一步研究。

有研究指出：放線菌門細菌是田間土壤中的典型有益細菌種群，其含有大量的植物促生功能菌和病原拮抗菌，為植物獲取生長發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)提高了效率，對植物生長起促進作用，同時還能抑制土傳病原微生物侵染，在生物防治方面有大量的應用[35-37]。本研究中，馬鈴薯塊莖蛾取食脅迫增加了根際細菌中放線菌門的相對多度，但隨著處理時間的延長，放線菌門相對多度的增加效果逐漸減弱，這可能是馬鈴薯植株在受到害蟲脅迫時，通過某種途徑捕獲了對植物有促生作用的放線菌門菌株，從而提高了馬鈴薯對馬鈴薯塊莖蛾取食脅迫的抗性。從馬鈴薯塊莖蛾取食脅迫下馬鈴薯根際土壤中可培養(yǎng)細菌的屬水平看，正常生長和馬鈴薯害蟲脅迫后的馬鈴薯根際可培養(yǎng)細菌的組成和相對多度均存在明顯差異，說明馬鈴薯塊莖蛾脅迫對其產(chǎn)生了影響。有研究指出：根系分泌物是植物調(diào)控根際微生物組成結(jié)構(gòu)的主要方式[38-39]，而生物脅迫又會使植物向根際土壤中釋放多種生物活性化合物來抵御食草動物侵害[40]，推測馬鈴薯塊莖蛾的取食脅迫影響了馬鈴薯根系分泌物，從而進一步改變了其根際微生物的組成結(jié)構(gòu)。

已有研究表明：節(jié)桿菌屬的多種菌株對植物生長有促生作用。VANISSA 等[41]研究表明：對玉米接種節(jié)桿菌屬細菌后，限制了植物對鈉離子的吸收，增加了對鉀離子的吸收，促進了植株生長；KIM 等[42]研究表明：土壤節(jié)桿菌屬細菌增強了水稻的耐寒性。本研究中，馬鈴薯塊莖蛾取食脅迫使馬鈴薯根際細菌中節(jié)桿菌屬相對多度明顯增加，隨著處理時間的延長，增加的節(jié)桿菌屬相對多度逐漸降低，這可能是馬鈴薯植株在受到馬鈴薯塊莖蛾取食脅迫后吸引了具有促生作用的根際節(jié)桿菌屬來抵御脅迫，增強了對馬鈴薯塊莖蛾取食脅迫的抗性。植物根際中放線菌門和節(jié)桿菌屬菌株對增強植物抗逆性及促生作用的機制值得深入研究。

4 結(jié)論

馬鈴薯塊莖蛾取食脅迫后，馬鈴薯植株根際可培養(yǎng)細菌的組成結(jié)構(gòu)及物種多樣性與正常生長的植株有明顯差異，改變了放線菌門和節(jié)桿菌屬菌株的相對多度。研究結(jié)果為系統(tǒng)研究馬鈴薯—根際細菌—馬鈴薯塊莖蛾的互作關(guān)系及馬鈴薯抗蟲機理提供了依據(jù)。