李艷艷,高亞偉,王靖萱,熊蘇悅,于婉真,陳銘堅(jiān)
(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院,江蘇 泰州 225300;2.安徽省碭山縣畜牧獸醫(yī)水產(chǎn)服務(wù)中心,安徽 碭山 235300;3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué),江蘇 南京 210000)
金黃色葡萄球菌(SA)簡(jiǎn)稱金葡菌,是引起奶牛乳房炎的主要致病菌。金葡菌引起的奶牛乳房炎具有病程長(zhǎng)、傳播速度快、反復(fù)發(fā)作、治愈率低等特點(diǎn),可對(duì)產(chǎn)奶腺體組織造成不可逆的損傷,導(dǎo)致奶牛生產(chǎn)性能和奶質(zhì)顯著下降。
1.1 免疫學(xué)診斷
1.1.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)使用酶標(biāo)記的抗體或抗原進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定,使對(duì)應(yīng)的抗原或抗體產(chǎn)生強(qiáng)烈的顯色反應(yīng),通過(guò)底物的顏色反應(yīng)來(lái)判定有無(wú)相應(yīng)的免疫反應(yīng)。該法使用方便,具有較好的靈敏度和特異性,適用于大量樣本的檢測(cè)。
采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附方法既可以檢測(cè)牛奶中是否含有金葡菌,也可以診斷金葡菌性乳房炎。
1.1.2 免疫熒光標(biāo)記技術(shù) 該技術(shù)需要建立針對(duì)專門(mén)結(jié)合到A蛋白的免疫熒光探針,使用帶有熒光標(biāo)記的抗體,以此捕獲釋放到樣品中的病原,通過(guò)特殊儀器測(cè)定熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析。
該方法具有快速、靈敏度高的特點(diǎn),但是成本較高,并且對(duì)檢測(cè)人員的專業(yè)性有較高要求。
1.1.3 免疫層析檢測(cè)技術(shù) 免疫層析檢測(cè)技術(shù)是一種基于免疫膠體金技術(shù)的快速診斷方法。該方法以抗原-抗體免疫學(xué)反應(yīng)和層析反應(yīng)為基礎(chǔ),通過(guò)毛細(xì)管作用使樣品在層析條上運(yùn)動(dòng),進(jìn)而使其與受體結(jié)合產(chǎn)生免疫反應(yīng)。
該方法操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速,能夠直接診斷奶牛是否患有乳房炎。
1.2 分子生物學(xué)診斷 分子生物學(xué)用于金葡菌性奶牛乳房炎的診斷已經(jīng)越來(lái)越普遍,檢測(cè)方法包括普通PCR法、多重PCR法、實(shí)時(shí)定量PCR法、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)等。PCR方法與常規(guī)檢測(cè)手段相比,具有特異性強(qiáng)、敏感性高的特點(diǎn),并能確定對(duì)應(yīng)的基因型和抗生素耐藥基因的存在,尤其是多重PCR可以同時(shí)進(jìn)行多種病原篩查,其臨床應(yīng)用廣泛。
1.3 細(xì)菌培養(yǎng) 細(xì)菌的分離鑒定與培養(yǎng)是診斷細(xì)菌性疾病的常用方法。
金葡菌在血平板上培養(yǎng)24 h 后,會(huì)形成厚的、有光澤的、隆起的,直徑為1~2 mm 的金黃色菌落,并出現(xiàn)β溶血現(xiàn)象,即在菌落周?chē)型该鞯娜苎h(huán)。革蘭氏染色后,可在顯微鏡下觀察到紫色葡萄串狀的球菌。在細(xì)菌生化反應(yīng)中,金葡菌觸酶試驗(yàn)、血漿凝固酶試驗(yàn)及甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)均為陽(yáng)性。
1.4 Accumast 快速診斷培養(yǎng)皿 Accumast 快速診斷培養(yǎng)皿由美國(guó)康奈爾大學(xué)Bicalho教授研發(fā),可在現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行快速診斷。
此培養(yǎng)基中添加了特殊顯色劑,不同病原菌的不同代謝產(chǎn)物可在平板上顯出不同色彩。Ganda等以實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)診斷方法來(lái)評(píng)估Accumast診斷培養(yǎng)皿對(duì)金葡菌的鑒定效果,其靈敏性、特異性分別為100%、99.8%。
1.5 試管凝固酶試驗(yàn) 試管凝固酶試驗(yàn)是診斷金葡菌常用的生化試驗(yàn)。
金葡菌能產(chǎn)生血漿凝固酶,使血漿中纖維蛋白原變?yōu)椴蝗苄岳w維蛋白,附于細(xì)菌表面,生成凝塊,因而具有抗吞噬的作用。該法巧妙利用了金葡菌此特性進(jìn)行特異性診斷,具有經(jīng)濟(jì)、高效、可靠且快速的特點(diǎn),在生產(chǎn)實(shí)際中,常采用玻片法、試管法進(jìn)行凝固酶試驗(yàn)。
1.6 其他實(shí)驗(yàn)室診斷 甘露醇鹽瓊脂測(cè)試和脫氧核糖核酸酶測(cè)試能夠快速診斷出奶牛乳汁中的金葡菌。Bi-plate 和Tri-plate 培養(yǎng)系統(tǒng)也可用于金葡菌的快速檢測(cè)。乳汁體細(xì)胞計(jì)數(shù)可用于評(píng)估乳腺狀態(tài)和奶?;窘】禒顩r,而乳汁電導(dǎo)率檢查和pH值檢查可以對(duì)奶牛乳汁的理化性質(zhì)進(jìn)行分析,可用于本病的綜合性診斷。
目前基于表型和基因分型方法的分子技術(shù)為診斷本病提供了快速和特異的鑒定方法。中國(guó)農(nóng)科院智慧畜牧業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)利用表面增強(qiáng)拉曼納米標(biāo)簽改進(jìn)的免疫滲濾裝置,實(shí)現(xiàn)了高靈敏度奶牛乳腺炎癥因子白介素-6的檢測(cè),為及早發(fā)現(xiàn)和診斷奶牛乳腺炎提供了新方法。
2.1 耐藥性 隨著抗生素的廣泛使用,金葡菌對(duì)多種抗生素產(chǎn)生了耐藥性,金葡菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥的耐藥機(jī)制包括產(chǎn)生有水解作用的β-內(nèi)酰胺酶、主動(dòng)外排系統(tǒng)、耐藥基因以及細(xì)胞膜對(duì)藥物通透性降低等。
金葡菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物的耐藥機(jī)制是通過(guò)修飾核糖靶位點(diǎn),以此影響大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物對(duì)核糖亞基的親和力。主動(dòng)外排系統(tǒng)是細(xì)菌的正常生理結(jié)構(gòu),存在于敏感菌株中,但當(dāng)細(xì)菌被環(huán)境中的底物長(zhǎng)時(shí)間誘導(dǎo)時(shí),其編碼基因的外排系統(tǒng)會(huì)被激活和表達(dá),使得外排藥物的能力顯著增強(qiáng),從而導(dǎo)致耐藥性。金葡菌的tet(K)基因是其主要耐藥基因,該基因編碼的主動(dòng)外排機(jī)制能將四環(huán)素類抗菌藥物泵出細(xì)胞外,從而產(chǎn)生耐藥性。
由于金葡菌多樣化的耐藥機(jī)制,使得乳源金葡菌的耐藥性不斷加強(qiáng)。耐甲氧西林金葡菌株(MRSA)是一種耐多藥的“超級(jí)細(xì)菌”,其對(duì)包括治療金葡菌性奶牛乳房炎的常規(guī)抗生素均有耐藥性。MRSA 等耐藥菌株的出現(xiàn),給本病的治療帶來(lái)了全新的挑戰(zhàn)。
2.2 抗生素治療 抗生素療法是國(guó)內(nèi)外普遍采用的治療奶牛乳房炎的常用方法,由于臨床用藥不規(guī)范等原因,使得金葡菌成為較難根治的乳房炎病原之一。同時(shí),由于其獨(dú)特的發(fā)病機(jī)制、傳染性、環(huán)境持久性、對(duì)皮膚及黏膜的強(qiáng)大粘附能力,使用β-內(nèi)酰胺類抗生素治療的有效性已近耗竭。
隨著抗生素耐藥性、藥物殘留和公共衛(wèi)生問(wèn)題的日益突出,抗生素的應(yīng)用受到了諸多限制。因此,尋求新的乳房炎預(yù)防和治療策略已成為當(dāng)下之需。
2.3 替代療法 針對(duì)金葡菌的替代治療方法包括使用細(xì)菌素、益生菌、噬菌體和生物活性植物化學(xué)物質(zhì)。大量實(shí)驗(yàn)證明,噬菌體可以有效提高感染細(xì)菌動(dòng)物的存活率,與抗生素相比,噬菌體制劑特異性高、自我增殖快、開(kāi)發(fā)時(shí)間短。另外,益生菌也極具治療前景,過(guò)氧化乳桿菌、乳酸乳球菌和干酪類乳桿菌在體外對(duì)抗幾種引起乳房炎的病原體有良好的效果,它們可以刺激奶牛的免疫應(yīng)答,去除金葡菌生物膜,調(diào)節(jié)病原體在宿主細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)化。
有研究證明包括藍(lán)桉、黃芪、柴胡、洋甘菊、薄荷、金銀花、羅勒、蒺藜、艾葉等多種中草藥的提取物具有顯著抑菌效果。中藥消除細(xì)菌耐藥性的作用機(jī)制主要是抑制β-內(nèi)酰胺酶的作用、抑制主動(dòng)外排泵、抑制細(xì)菌生物膜及細(xì)菌耐藥質(zhì)粒形成等。
2.4 納米制劑療法 納米顆粒的開(kāi)發(fā)為金葡菌性乳房炎的治療提供了新的思路。納米顆??商岣哂行лd荷藥物在細(xì)胞內(nèi)的穿透和積累,降低細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性和防止其生物膜形成的能力。
納米抗菌藥物具有廣譜、親水和環(huán)保等許多特性,并且使用天然礦物,無(wú)耐藥性產(chǎn)生。
一些納米載體可通過(guò)與多種抗菌藥物偶聯(lián)或結(jié)合來(lái)促進(jìn)對(duì)金葡菌的藥理活性,因此,納米顆粒給藥被認(rèn)為是抑制金葡菌感染的較理想工具。納米顆??梢栽鰪?qiáng)藥物在細(xì)胞內(nèi)的滲透性,其主要通過(guò)增加釋放藥物向主要靶點(diǎn)的擴(kuò)散和被細(xì)胞攝取的能力,以及改善包被或吸附納米顆??股氐尼尫?,增強(qiáng)抗生素對(duì)細(xì)胞內(nèi)金葡菌感染的抗菌活性。
脂質(zhì)體也被認(rèn)為是抗菌藥物在細(xì)胞內(nèi)分布的可能載體,這歸因于其磷脂雙層結(jié)構(gòu),大單片脂質(zhì)體可作為鏈霉素的載體對(duì)抗金葡菌的細(xì)胞內(nèi)感染。使用克拉霉素和達(dá)托霉素負(fù)載脂質(zhì)體的最佳比例也驗(yàn)證了阿奇霉素負(fù)載脂質(zhì)體對(duì)MRSA具有更高的殺菌作用。
2.5 中草藥療法 作為我國(guó)傳統(tǒng)的醫(yī)藥資源,中草藥具有提高非特異性免疫力和抗菌力的作用,近年來(lái)在奶牛乳房炎上應(yīng)用研究也越來(lái)越多。
研究表明中草藥提取物,如黃芪多糖,以及中草藥組方制劑對(duì)包括金葡菌性奶牛乳房炎具有明顯的治療效果。除了抑菌和抗炎作用,中草藥還能通過(guò)活血、化瘀、消腫、散癰等作用改善乳房局部的血液循環(huán),調(diào)節(jié)乳腺血液供應(yīng),進(jìn)而修復(fù)乳腺組織,達(dá)到治愈乳房炎的目的。
3.1 抗病育種 早期的抗乳房炎育種研究主要集中在測(cè)定臨床乳房炎、乳汁體細(xì)胞計(jì)數(shù)及乳房表型等性狀的遺傳參數(shù)方面。不同奶牛品種之間存在著遺傳差異,可以微妙地影響奶牛的生產(chǎn)性能和疾病抗性,從而使人們能夠選擇具有乳房炎抗性遺傳特征的奶牛進(jìn)行繁育。
近年來(lái),隨著分子生物學(xué)尤其是基因組學(xué)以及生物信息學(xué)的迅速發(fā)展,以功能基因組、轉(zhuǎn)基因?yàn)榇淼姆肿佑N技術(shù)已成為抗乳房炎育種的發(fā)展方向,乳房炎抗性相關(guān)候選基因的研究也取得重大進(jìn)展。如BTA22 基因編碼的乳鐵蛋白具有抑菌和殺菌的作用,BTA23可通過(guò)誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)獲得性免疫應(yīng)答來(lái)發(fā)揮其在預(yù)防乳房炎中的作用,而β-防御素基因可在乳腺等組織中受病原的誘導(dǎo)而表達(dá),對(duì)金葡菌等乳房炎致病菌有抗菌活性。
3.2 疫苗預(yù)防 免疫疫苗是控制和終結(jié)大多數(shù)傳染病的首選方法。
市場(chǎng)上也已生產(chǎn)出了多款針對(duì)金葡菌性乳房炎的疫苗,如西班牙歐杰諾的MASTIVAC 牛乳房炎滅活疫苗、德國(guó)勃林格的Lysigin多價(jià)裂解疫苗、西班牙海博萊用的Startvac 多價(jià)疫苗。市售疫苗具有一定的保護(hù)效力,能在一定程度上降低臨床型乳房炎的發(fā)病率。
在一些發(fā)達(dá)國(guó)家,對(duì)乳房炎自家苗的研究也已開(kāi)展起來(lái)。針對(duì)金葡菌性乳房炎的感染,國(guó)外許多農(nóng)場(chǎng)開(kāi)始使用自家苗,這些疫苗具有很高的畜群特異性,且抗原濃度通常較高,為金葡菌性乳房炎的防治提供了一種新的思路。
3.3 信息化監(jiān)測(cè)管理 定期對(duì)泌乳期奶牛進(jìn)行乳房炎監(jiān)測(cè)是防治和控制乳房炎蔓延的有力措施。
通用信息技術(shù)的不斷發(fā)展進(jìn)步為現(xiàn)代化乳制品行業(yè)提供了新的技術(shù)支持,同時(shí)也建立了一系列乳房炎防控的信息體系,如使用適配并可連接到智能手機(jī)應(yīng)用程序的納米生物傳感器,可快速檢測(cè)牛奶樣本中的病原體,數(shù)字化的擠奶機(jī)控制系統(tǒng)也降低了機(jī)械控制故障而導(dǎo)致的臨床乳房炎的發(fā)病率。不同的傳感器系統(tǒng)可以測(cè)量每頭奶牛的生理、行為和生產(chǎn)指標(biāo)。
信息化監(jiān)測(cè)管理有助于對(duì)金葡菌性乳房炎進(jìn)行監(jiān)測(cè)、防控和診斷,并統(tǒng)計(jì)建立出金葡菌性乳房炎的特征性診斷標(biāo)準(zhǔn),同時(shí)也為收集不同類型乳房炎的流行病學(xué)數(shù)據(jù),以進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查提供了便利。