■ 章祥勝 楊景豐 吳 釗 贠 彪 錢雪橋 姜冬火 袁瑞敏 姜瑞麗 王 勝
(廣東海大集團股份有限公司,廣東 廣州 511400)
糖類物質(zhì)作為三大營養(yǎng)素之一,飼料中添加適當水平的糖類物質(zhì)不僅可以降低水產(chǎn)飼料的成本[1],還能提高動物的生長性能[2-3]。與哺乳動物相比(如小鼠[4]、豬[5]和羔羊[6]),水生動物不能有效利用糖類物質(zhì)[7],尤其是甲殼類動物[8]。在甲殼類動物中,糖類不是必需的營養(yǎng)物質(zhì),因為它們只提供能量,甲殼類動物可以從蛋白質(zhì)和脂類中獲得能量[9]。糖類物質(zhì)攝入過多會降低生長速度,影響糖脂代謝,導致死亡率高[3,10-11]。因此,在保證動物健康生長的同時,降低水產(chǎn)飼料成本和提高生長性能,確定合適的糖水平是非常重要的。
糖類物質(zhì)為人類和大多數(shù)養(yǎng)殖動物的飲食提供了大部分能量,當分解代謝時,不同形式的可用多糖完全水解成葡萄糖并被各種器官吸收[12-13]。盡管其他單糖,如果糖、半乳糖和木糖,也可能以少量存在,葡萄糖仍是糖類物質(zhì)消化的主要產(chǎn)物[12]。葡萄糖通常以糖原的形式儲存在肝胰腺和肌肉中[11]。糖原是一種快速動員的短期儲備燃料,對維持血淋巴葡萄糖的穩(wěn)定性有重要作用。當魚類或甲殼類動物長時間沒有食物時,肝胰腺糖原通過葡萄糖-6-磷酸酶水解為葡萄糖[11]。糖酵解是在葡萄糖激酶(GK)和丙酮酸激酶(PK)兩種關(guān)鍵酶的作用下,將葡萄糖分解為丙酮酸的一系列反應,為機體提供生命活動所需的能量。
羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)是一種優(yōu)良的淡水大蝦,原產(chǎn)于印度洋、太平洋地區(qū),居于淡水或咸淡水水域,于1976 年在國內(nèi)被引種成功后,其養(yǎng)殖規(guī)模迅速擴展。又因其具有食性廣、生長快、病害少、受地域條件限制小、養(yǎng)殖性能優(yōu)良等特點,已經(jīng)成為世界上養(yǎng)殖量最高的三大蝦種之一[14-15]。
糖類物質(zhì)在羅氏沼蝦上的作用值得關(guān)注,學者們大多專注于羅氏沼蝦蛋白質(zhì)和脂肪的研究[16-17],然而,糖類物質(zhì)無論是對羅氏沼蝦的生長和健康,還是產(chǎn)業(yè)上的降本增效都有很大的價值。同時,已有研究表明玉米淀粉是最有利于羅氏沼蝦生長的糖源[18],因此,本研究以羅氏沼蝦為研究對象,通過評估不同玉米淀粉水平飼料對羅氏沼蝦生長性能、飼料利用率和葡萄糖代謝酶活性的影響,來確定羅氏沼糖類物質(zhì)最適需求水平。
配制了5 種等氮(42.8%粗蛋白)和等脂(8.0%粗脂肪)日糧飼料以滿足羅氏沼蝦對營養(yǎng)物質(zhì)的需求,玉米淀粉水平分別為5%、10%、15%、20%和25%的飼料,實際含量分別為7.33%、12.72%、18.07%、21.98%和27.15%,見表1。所有原料來自廣東海大集團股份有限公司。且均通過超細粉碎機研磨成細粉。微量成分,包括維生素和礦物質(zhì)混合物,使用逐級擴大法混合(先混合添加量小于100 g的原料,然后與大量原料混合)。粉碎和混合后的原料分別通過擠出機和制粒機冷擠出,生產(chǎn)直徑為0.8 mm 和1.0 mm 的兩種顆粒,在90 ℃下熟化30 min,最后風干至水分約10%。將干燥的飼料密封在真空包裝袋中,并在-20 ℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>
表1 飼料配方與營養(yǎng)水平
養(yǎng)殖試驗在海大集團恩平育種中心進行,羅氏沼蝦苗來自恩平羅氏沼蝦遺傳選育項目組,預先用漂白粉將暫養(yǎng)池和試驗池消毒,沖洗干凈。蝦苗暫養(yǎng)30 d,規(guī)格達到(0.50±0.02) g 時,挑選規(guī)格整齊、健康無病的試驗蝦,分到規(guī)格為2 m×1.5 m×1 m的網(wǎng)箱中,試驗共5 組,每組設(shè)置4 個重復,每個重復放養(yǎng)60 尾蝦。試驗開始前用對照組飼料馴養(yǎng)5~7 d,待蝦能正常攝食且無死亡后開始試驗。每天投喂4 次(06:00,10:00, 16:00,21:30),以早晚投喂為主,日投喂量為羅氏沼蝦體重的3%~5%,達表觀飽食。試驗為期8 周,試驗期間24 h 充氣,溶解氧≥6 mg/L,不定期吸污換水,進水均用200 目篩網(wǎng)過濾,水溫為26~30 ℃,氨氮≤0.3 mg/L,pH 7.8~8.3。
養(yǎng)殖試驗結(jié)束后,逐個網(wǎng)箱稱重、計數(shù)。然后從每個網(wǎng)箱隨機取蝦12 尾,先用1 mL 注射器于圍心腔處取血淋巴于1.5 mL離心管中;取肝胰腺放入無菌離心管中,并在液氮中短暫保存;最后將所有樣品置于-80 ℃保存用于后續(xù)檢測分析。
養(yǎng)殖試驗開始于2022 年7 月1 日,每個網(wǎng)箱放60 尾蝦,并記錄初始平均體重,結(jié)束于2022 年8 月26 日,記錄每個網(wǎng)箱蝦的實際存活數(shù)量,并稱重,記錄終末平均體重。
成活率(SR,%)=(試驗結(jié)束時蝦尾數(shù)/試驗初始時蝦尾數(shù))×100
增重率(WGR,%)=(終末平均體重-初始平均體重)/初始平均體重×100
特定生長率(SGR,%/d)=(ln 終末平均體重-ln 初始平均體重)×100/試驗天數(shù)
飼料系數(shù)(FCR)=飼料投喂量/(終末平均體重-初始平均體重)
血淋巴中葡萄糖含量、丙酮酸激酶(PK)、葡萄糖激酶(GK)、磷酸果糖激酶(PFK)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)的活性均采用試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司)進行測定。并使用試劑盒(江蘇科特生物科技有限公司)分析胰島素樣肽(ILP)和高血糖激素(CHH)的濃度。葡萄糖采用氧化酶法測定。糖代謝酶活均采用紫外法測定。GK、胰島素樣肽和高血糖激素采用ELISA 試劑盒測定方法。
肝胰腺樣品需在冰浴中加入9體積(W/V)生理鹽水勻漿,然后在4 ℃(Eppendorf centrifuge 5810R,Germany)下以3 000 r/min離心10 min。肝胰腺中的糖原和ATP含量也使用測定試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司)按相應方案進行測定。
試驗結(jié)果用“平均值±標準差”表示,采用SPSS 23.0 對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(one-way ANOVA),差異顯著時用Tukey 進行多重比較檢驗,P<0.05 表示差異顯著。
由表2 所示,飼料玉米淀粉水平對羅氏沼蝦生長性能及飼料利用的影響。終重、增重率、特定增長率和飼料系數(shù)均受到飼料玉米淀粉水平的影響。隨著玉米淀粉水平升高羅氏沼蝦終重、增重率和特定生長率都呈先上升后下降的變化趨勢,其中,投喂15%玉米淀粉水平組最高。根據(jù)增重率與飼料玉米淀粉水平的折線和二階多項式回歸分析,羅氏沼蝦實際的最適玉米淀粉水平為14.75%~15.79%,根據(jù)無氮浸出物計算可知,羅氏沼蝦最適的糖類物質(zhì)水平為17.82%~18.86%,見圖1。所有試驗組之間的存活率差異不顯著(P>0.05),飼料系數(shù)隨玉米淀粉水平增加而不同程度降低,20%,25% 水平組顯著高于5% 水平組(P<0.05)。
圖1 基于折線和二階多項式回歸分析的羅氏沼蝦增重率與飼料玉米淀粉水平的關(guān)系
表2 飼料玉米淀粉水平對羅氏沼蝦生長性能及飼料利用的影響
由表3 所示,飼料玉米淀粉水平對羅氏沼蝦血淋巴葡萄糖含量、糖代謝酶活性及激素含量的影響。葡萄糖含量、丙酮酸激酶(PK)、葡萄糖激酶(GK)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)的活性、胰島素樣肽(ILP)和高血糖激素(CHH)濃度均受到玉米淀粉水平的影響。葡萄糖含量隨著飼料玉米淀粉水平呈上升趨勢,投喂25%玉米淀粉處理組顯著高于5%玉米淀粉處理組(P<0.05)。
表3 飼料玉米淀粉水平對羅氏沼蝦血淋巴葡萄糖含量及酶活性的影響
隨著葡萄糖含量的增加,糖酵解相關(guān)酶PK 和GK的活性呈增加的趨勢,且25%水平組顯著高于5%水平組(P<0.05),PFK 的活性無顯著性變化(P>0.05);糖異生相關(guān)酶PEPCK 的活性25%水平組顯著低于其他組(P<0.05)。同時,血淋巴中ILP 的濃度25%水平組顯著高于5%、10%、15%水平組(P<0.05),而CHH的濃度呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,15%玉米淀粉水平組的羅氏沼蝦CHH濃度最高。
如圖2 所示,飼料玉米淀粉水平對羅氏沼蝦肝胰腺糖原及ATP 含量的影響。肝胰腺糖原及ATP 含量均受到飼料玉米淀粉水平的顯著影響(P<0.05)。隨著飼料中玉米淀粉水平含量逐漸增加,肝胰腺糖原含量也顯著增加,ATP 含量先增加后降低,投喂15%玉米淀粉的羅氏沼蝦ATP含量最高。
圖2 飼料玉米淀粉水平對羅氏沼蝦肝胰腺糖原及ATP含量的影響
黃黎明等[18]研究發(fā)現(xiàn),玉米淀粉是最有利于羅氏沼蝦生長的糖源,但羅氏沼蝦的最適糖水平還未見報道。許多研究結(jié)果表明,飼料配方中糖類物質(zhì)含量在18%~20%適用于甲殼類動物,如凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)[19]、斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon Fabricius)[20]、擬穴青蟹(Scylla serrata)[21]和中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)[22]。因此,本試驗以玉米淀粉為糖源,設(shè)計5%、10%、15%、20%和25%共5 個梯度去探究對羅氏沼蝦生長性能、飼料利用及糖代謝的影響。
適當增加飼料配方中糖類物質(zhì)的比例,有利于羅氏沼蝦的生長,但過量的糖類物質(zhì)也會抑制生長[2-3,10-11]。在本研究中,羅氏沼蝦終重、增重率和特定生長率都呈先上升后下降的變化趨勢?;谠鲋芈逝c飼料玉米淀粉水平的折線和二階多項式回歸分析,羅氏沼蝦實際的最適玉米淀粉水平為14.75%~15.79%。根據(jù)無氮浸出物計算可知,羅氏沼蝦最適的糖類物質(zhì)水平為17.82%~18.86%。大量的研究表明,蛋白質(zhì)和脂肪水平的變化均會導致飼料系數(shù)顯著變化[17,23],這說明氨基酸和脂肪酸變化會強烈引起水產(chǎn)動物對飼料的采食差異,糖類物質(zhì)并沒有誘食方面的優(yōu)勢[22,24]。但本研究中,飼料系數(shù)隨著糖水平的增加而降低,這可能是因為低糖水平的飼料總能低于高糖飼料,羅氏沼蝦需要通過攝入更多的飼料來獲取充足的能量。
在本研究中,隨著飼料中玉米淀粉水平逐漸增加,葡萄糖含量顯著增加。攝入糖類物質(zhì)會導致血淋巴葡萄糖升高,這與很多研究結(jié)果相同[20,24-25]。隨著糖類物質(zhì)的攝入,葡萄糖含量升高,為了保持血糖平衡,抑制葡萄糖升高的相關(guān)激素必然也會升高,反之,促進葡萄糖上升的激素則會被抑制。胰島素對魚類代謝的影響已被廣泛綜述[26-27]。在甲殼動物中并不存在胰島素,但經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)存在一種類似胰島素功能的多肽分子,稱之為胰島素樣肽(ILP)[28-29]。在中華絨螯蟹的試驗中證明了ILP 具有降血糖功能,其主要表達于肝胰腺、眼柄、胸腹神經(jīng)團等內(nèi)分泌器官內(nèi)[30]。因此,在本研究中,ILP 的含量也是呈逐漸升高趨勢。而甲殼類高血糖激素(CHH)的含量則呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢,與生長趨勢一致。CHH 是唯一已知的血淋巴葡萄糖調(diào)節(jié)激素,I 型CHH 具有增加血淋巴葡萄糖的功能[31]。但除I 型CHH 外,CHH 家族也能協(xié)助蛻殼,并參與蛻殼后的生長[32]。因此,本研究中,CHH 的含量與生長性能呈現(xiàn)一致的趨勢也是合理的。
伴隨著血糖水平的改變,葡萄糖代謝也出現(xiàn)相應的波動,表明葡萄糖是各種刺激過程中重要的底物[33]。糖酵解和糖異生是葡萄糖代謝的重要途徑。GK、PFK 和PK 都可以限制糖酵解途徑,影響葡萄糖分解獲取能量。為了調(diào)控葡萄糖穩(wěn)態(tài),在本研究中,糖酵解相關(guān)酶PK 和GK 的活性也呈增強趨勢。GK 對葡萄糖有高度專一性,葡萄糖含量的上升可以誘導GK 酶活性的提高。同時,在葡萄糖轉(zhuǎn)化成丙酮酸的過程中,PK 活性也顯著增強。糖異生途徑是合成葡萄糖的過程,磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)可以限制葡萄糖的合成。因此,在本研究中,PEPCK 活性隨糖類物質(zhì)含量上升而下降。
組織中的糖原是由血清或血淋巴中的葡萄糖合成的。在本研究中,葡萄糖含量增加,糖原含量也顯著增加。和許多研究結(jié)果一致,過量的葡萄糖可以合成更多的糖原,當機體提供能量時,首先消耗糖原[2,34]。然而,過量的糖原積累可導致脂質(zhì)沉積和組織損傷,從而影響水產(chǎn)動物的健康和生長[7,11],因此,投喂25%玉米淀粉水平組的羅氏沼蝦生長性能最差,但糖原積累最多。
內(nèi)源性和外源性因素會改變機體能量需求和供應的平衡,為了應對平衡的變化并維持能量穩(wěn)定,機體會通過調(diào)節(jié)線粒體的代謝狀態(tài)以調(diào)節(jié)ATP的產(chǎn)生[35]。在本研究中,ATP 含量先增加后降低,與生長趨勢一致。ATP 直接為機體生長及生理活動提供能量,羅氏沼蝦的快速生長離不開能量的供應,因此,羅氏沼蝦機體內(nèi)ATP 的儲存量與生長性能成正比。
本研究結(jié)果表明,適量添加玉米淀粉可以提高羅氏沼蝦的生長性能?;谠鲋芈逝c飼料玉米淀粉水平的折線和二階多項式回歸分析,羅氏沼蝦實際的最適玉米淀粉水平為14.75%~15.79%。根據(jù)無氮浸出物計算可知,羅氏沼蝦最適的糖類物質(zhì)水平為17.82%~18.86%,與其他的甲殼動物最適糖水平的研究結(jié)果相差不大。同時,隨著糖類物質(zhì)添加水平的增加,糖原含量增加,胰島素樣肽含量降低。糖酵解酶活性增強,糖異生酶活性降低。