張?zhí)祚Y,李沐哲,牛園園,郭楊,3,王禮寧,3,田霖坤,王遇珩,王泉荃,馬勇,3

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,骨傷修復(fù)與重建新技術(shù)實驗室,江蘇 南京 210023;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,江蘇 南京 210029;3.南京中醫(yī)藥大學(xué)無錫附屬醫(yī)院,江蘇省中醫(yī)退行性骨關(guān)節(jié)病臨床醫(yī)學(xué)創(chuàng)新中心,江蘇 無錫 214071)

老年性骨質(zhì)疏松癥(Senile osteoporosis,SOP)是一種與年齡相關(guān)的代謝性骨疾病,以進(jìn)行性骨量丟失、骨微結(jié)構(gòu)惡化和骨脆性增加為特征,通常發(fā)生在65歲以上的人群中[1]。巨噬細(xì)胞是骨組織中最豐富、最活躍的免疫細(xì)胞之一。在骨髓微環(huán)境中,它們與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stromal cell,BMSC)、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞相互作用,在維持骨穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用。而在衰老的骨髓微環(huán)境中,衰老細(xì)胞產(chǎn)生衰老相關(guān)分泌表型(Senescence associated secretory phenotypes,SASPs),誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞衰老并向M1型極化[2]。同時,衰老的巨噬細(xì)胞會分泌腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)和白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)等細(xì)胞因子,造成成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間的失衡,加劇了年齡相關(guān)的骨質(zhì)流失[2-3]。因此,在治療SOP方面,調(diào)控衰老巨噬細(xì)胞、改善骨髓微環(huán)境以促進(jìn)BMSC成骨分化可能是一種新方法。

馬勇教授認(rèn)為SOP主要病機(jī)為腎精虧虛,脾虛肝郁,骨髓失養(yǎng),故治療SOP當(dāng)以補(bǔ)益脾腎、調(diào)和臟腑、強(qiáng)筋健骨之法。以此構(gòu)建的經(jīng)驗方溫腎通絡(luò)止痛方療效確切(處方已申請國家發(fā)明專利,公布號:CN107823493A),能有效提高SOP患者骨密度,改善疼痛、腰膝酸軟、步履艱難等癥狀[3-4],并且可在炎癥微環(huán)境下通過核因子κB(Nuclear factor-kappa B,NF-κB)信號通路,調(diào)控巨噬細(xì)胞極化,抑制破骨細(xì)胞活性[5]。而在衰老微環(huán)境下,溫腎通絡(luò)止痛方能否通過延緩巨噬細(xì)胞衰老,對成骨分化產(chǎn)生影響仍然有待進(jìn)一步的探索。因此,本研究擬利用過氧化氫(H2O2)建立巨噬細(xì)胞衰老模型,并通過D-半乳糖構(gòu)建SOP小鼠模型,探討溫腎通絡(luò)止痛方能否通過抑制巨噬細(xì)胞衰老促進(jìn)BMSC成骨分化從而發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松效應(yīng)。

1 方法

1.1 試劑

H-DMEM培養(yǎng)基(Cytiva,批號:SH30022.FS);DMEM/F12培養(yǎng)基(Cytiva,批號:SH30023.01);L-DMEM培養(yǎng)基(Cytiva,批號:SH30021.01);青霉素-鏈霉素(100×)(新賽美,批號:C100C5);胰蛋白酶消化液(新賽美,批號:C100C1);p21抗體(武漢三鷹,批號:28248-1-AP);p53抗體(武漢三鷹,批號:60283-2-Ig);Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)抗體(武漢三鷹,批號:82636-2-RR);骨鈣蛋白(Osteocalcin,OCN)抗體(Santa Cruz,批號:sc-390877);GAPDH抗體(Affinity,批號:AF7021);HRP偶聯(lián)羊抗兔二抗抗體(武漢三鷹,批號:SA00001-2);HRP偶聯(lián)羊抗小鼠二抗抗體(武漢三鷹,批號:SA00001-1);iNOS抗體(武漢三鷹,批號:80517-1-RR);ARG1抗體(武漢三鷹,批號:16001-1-AP);CoraLite488-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG(武漢三鷹,批號:SA00013-2);CoraLite594-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG(武漢三鷹,批號:SA00013-4);蘇木素-伊紅(Hematoxylin-eosin,HE)染液(南京建成生物工程研究所,批號:D006-1-1);切片石蠟、脫鈣液、4%多聚甲醛(索萊寶,批號:8002-74-2、E1171、P1112);活性氧(Reactive oxygen species,ROS)檢測試劑盒、細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒、成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)染色試劑盒、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)、CCK-8試劑盒、免疫熒光染色試劑盒、免疫染色通透液、免疫染色封閉液(碧云天,批號:S0033S、C0602、C0148S、C3206、C2006、C0037、P0186、P0096、P260);地塞米松、β-磷酸甘油磷酸鈉、維生素C(Sigma,批號:265005、G9422、BP461);總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司,批號:RC101-01、R223-01、Q711-02)。

1.2 儀器

Allsheng型全自動多功能酶標(biāo)儀(杭州奧盛儀器有限公司);BB16/BB5060型CO2培養(yǎng)箱(德國Heraus公司);CKX31型倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司);Mini Trans-blot cell型電轉(zhuǎn)印槽系列(美國Bio-Rad公司);1176型小動物Micro-CT測試儀(比利時Skyscan公司)。

1.3 細(xì)胞和實驗動物

小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7(武漢普諾賽,貨號:CL-0190)。3月齡的雄性C57BL/6J小鼠[體質(zhì)量(30±5)g]和8周齡SD大鼠[體質(zhì)量(180±20)g]購自浙江杭州醫(yī)學(xué)院,實驗動物許可證號:SCXK(浙)2019-0002。動物實驗已獲得南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會的批準(zhǔn)(202211A035),并遵循《實驗動物護(hù)理和使用指南》。

1.4 溫腎通絡(luò)止痛方藥液制備

溫腎通絡(luò)止痛方組成:山茱萸10 g,骨碎補(bǔ)30 g,淫羊藿10 g,蛇床子6 g,狗脊10 g,薏苡仁15 g,附子8 g,炙黃芪15 g,炒白術(shù)10 g,羌活10 g,獨(dú)活10 g,細(xì)辛3 g,天麻6 g,白芍15 g,炙甘草6 g。實驗使用的中藥均購自江蘇省中醫(yī)院。稱取處方藥材,加10倍水量煎煮1 h,二煎采用8倍量的水煎煮1 h,2次提取的藥液合并后過濾,濾液濃縮至每1 mL含1.25 g生藥,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 含藥血清制備

40只8周齡SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白血清組(20只)、溫腎通絡(luò)止痛方含藥血清組(20只),適應(yīng)性喂養(yǎng)后,據(jù)《藥理學(xué)實驗方法》中臨床常用量按實驗動物與人體表面積折算出給藥組溫腎通絡(luò)止痛方劑量為21 g·kg-1,空白組給予等量生理鹽水,每日1次,連續(xù)7 d。末次給藥1 h后麻醉,腹主動脈取血,室溫靜置2 h后分離血清,4 ℃、3 500 r·min-1離心15 min,吸取上層血清,0.22 μm濾膜過濾,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)

RAW264.7細(xì)胞采用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞生長至培養(yǎng)瓶底面積的80%～90%時,每2 d按照1∶3傳代。

采用文獻(xiàn)報道的方法獲取原代小鼠BMSC[6]。2月齡C57BL/6小鼠麻醉后脫頸處死,剝離脛骨和股骨,無血清DMEM/F12培養(yǎng)基沖洗骨髓腔,離心后棄去上清,用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸后,放于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),48 h后半量換液,之后每隔2 d全量換液1次,細(xì)胞生長融合至80%～90%時,按照1∶2傳代,取第3代細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.7 實驗分組和干預(yù)

1.7.1 巨噬細(xì)胞衰老模型建立 RAW264.7細(xì)胞分別加入含有100、200、300、400 μmol·L-1H2O2的培養(yǎng)基3 h后,換無H2O2培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h,β-半乳糖苷酶染色檢測巨噬細(xì)胞衰老水平,CCK-8法檢測巨噬細(xì)胞活性,從而篩選最佳的H2O2誘導(dǎo)濃度。

1.7.2 含藥血清對巨噬細(xì)胞衰老、線粒體功能、極化的影響 將RAW264.7細(xì)胞隨機(jī)分為對照組、模型組、含藥血清低劑量組、含藥血清高劑量組。除對照組外,其余3組均加入H2O2(30 μmol·L-1)以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞衰老,3 h后對照組和模型組換成含有空白血清的培養(yǎng)基,含藥血清低、高劑量組分別換成含有低劑量含藥血清(20%溫腎通絡(luò)止痛方含藥血清+80%空白血清)和高劑量含藥血清(40%溫腎通絡(luò)止痛方含藥血清+60%空白血清)的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,對細(xì)胞進(jìn)行β-半乳糖苷酶染色,Western blot、qPCR檢測衰老指標(biāo)p21和p53的mRNA及蛋白表達(dá),探討含藥血清對巨噬細(xì)胞衰老的影響。ROS染色和JC-1染色檢測巨噬細(xì)胞線粒體功能。qPCR檢測巨噬細(xì)胞極化相關(guān)因子IL-6、IL-10、CD206、iNOS mRNA水平,免疫熒光檢測巨噬細(xì)胞極化相關(guān)因子ARG1和iNOS的蛋白表達(dá),評估含藥血清對巨噬細(xì)胞極化的影響。

1.7.3 含藥血清處理的巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基對BMSC成骨分化的影響 取各組巨噬細(xì)胞上清液,制備條件培養(yǎng)基(CM),BMSC細(xì)胞隨機(jī)分為對照組-CM、模型組-CM、含藥血清低劑量組-CM、含藥血清高劑量組-CM。取BMSC接種于12孔板中,調(diào)整細(xì)胞密度約為每孔2×104個,使用成骨誘導(dǎo)液(L-DMEM完全培養(yǎng)基+50 μg·mL-1維生素C+10 mmol·L-1β-甘油磷酸鈉+8～10 mol·L-1地塞米松)和條件培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo),2者體積比為1∶1,隔天換液,誘導(dǎo)7 d后進(jìn)行qPCR檢測成骨指標(biāo)OCN、Ⅰ型膠原蛋白(Collagen type Ⅰ alpha 1,Col1a1)、Runx2 mRNA表達(dá)水平,并用ALP試劑盒進(jìn)行染色實驗。誘導(dǎo)21 d后進(jìn)行茜素紅染色實驗。

1.7.4 溫腎通絡(luò)止痛方對D-半乳糖誘導(dǎo)的SOP小鼠模型的影響 將40只3月齡雄性C57BL/6J小鼠按照數(shù)字表法隨機(jī)分為對照組、模型組、復(fù)方(溫腎通絡(luò)止痛方)低劑量組、復(fù)方(溫腎通絡(luò)止痛方)高劑量組,每組10只。每天腹腔注射D-半乳糖(1 g·kg-1),共6周。6周后,按照人與小鼠體表面積換算法,算出溫腎通絡(luò)止痛方低、高劑量組小鼠每日灌胃給予溫腎通絡(luò)止痛方湯劑21、42 g·kg-1,溫腎通絡(luò)止痛方溶液用生理鹽水稀釋成所需濃度,給藥體積為1 mL·kg-1,對照組及模型組灌胃給予等體積生理鹽水。給藥8周后,小鼠禁食12 h,腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg·kg-1)麻醉后,摘除眼球取血,采血結(jié)束后處死小鼠,剝離小鼠股骨、脛骨,一部分放置于-80 ℃保存,一部分放置于4%多聚甲醛中保存。Micro-CT分析小鼠股骨的骨微結(jié)構(gòu),HE染色檢測小鼠股骨病理變化,Western blot、qPCR檢測小鼠脛骨衰老相關(guān)分子p21、p53和成骨相關(guān)指標(biāo)OCN、Runx2蛋白和mRNA表達(dá)水平,qPCR檢查巨噬細(xì)胞極化相關(guān)分子IL-6、iNOS、CD206、IL-10 mRNA的表達(dá)水平,評估溫腎通絡(luò)止痛方對小鼠SOP模型的影響。

1.8 檢測指標(biāo)

1.8.1 細(xì)胞活性檢測 將RAW264.7接種于96孔板,每孔加入10 μL CCK-8溶液,繼續(xù)孵育2 h后,檢測450 nm處的吸光度值。

1.8.2 β-半乳糖苷酶染色 將RAW264.7細(xì)胞室溫固定15 min,加入1 mL X-Gal染色工作液,37 ℃無CO2條件下孵育6 h,顯微鏡下觀察。

1.8.3 免疫熒光檢測 將RAW264.7細(xì)胞室溫固定15 min,用免疫染色通透液(Triton X-100)處理20 min,免疫染色封閉液封閉30 min,按1∶100稀釋iNOS和ARG1一抗,4 ℃孵育過夜,按1∶1 000稀釋二抗與DAPI共同孵育30 min,加入抗熒光淬滅劑封固,倒置熒光顯微鏡采集圖像。

1.8.4 qPCR檢測 使用RNA提取試劑盒從各組脛骨、RAW264.7細(xì)胞、BMSC中提取總RNA并合成cDNA。使用SYBR Green染料法進(jìn)行qPCR分析。最后,使用GAPDH作為內(nèi)參基因?qū)PCR反應(yīng)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,采用2-ΔΔCt法計算p21、p53、IL-6、IL-10、CD206、iNOS、OCN、Col1a1、Runx2 mRNA的表達(dá)。引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列Table 1 qPCR Primer sequence

1.8.5 Western blot檢查 取于干預(yù)后的巨噬細(xì)胞及-80 ℃保存的脛骨,脛骨樣本經(jīng)液氮研磨后,使用RIPA裂解液提取組織總蛋白,并經(jīng)過BCA法進(jìn)行定量。將蛋白稀釋為同一濃度,加入上樣緩沖液,混勻后沸水煮10 min,冷卻后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,使用PVDF膜進(jìn)行400 mA 30 min的轉(zhuǎn)膜,接著在室溫下使用5%的脫脂奶粉進(jìn)行2 h的封閉處理。隨后,按抗體說明書配制一抗:p21(1∶1 000)、p53(1∶1 000)、GAPDH(1∶10 000)、Runx2(1∶1 000)、OCN(1∶100),并在4 ℃下孵育過夜,接著根據(jù)一抗種類使用合適的二抗在室溫下孵育2 h。最后,滴加ECL化學(xué)發(fā)光液,使用凝膠成像系統(tǒng)檢測目標(biāo)蛋白的信號強(qiáng)度,并利用Image J軟件進(jìn)行條帶灰度值的測定。

1.8.6 ROS染色 RAW264.7細(xì)胞中加入10 μmol·L-1Hydroethidine探針,室溫中孵育30 min,PBS清洗3遍后,熒光顯微鏡下觀察,Hydroethidine探針與細(xì)胞中ROS結(jié)合發(fā)出紅色熒光。

1.8.7 JC-1染色 PBS洗滌RAW264.7細(xì)胞1次,加入0.5 mL細(xì)胞培養(yǎng)液,再加入0.5 mL JC-1染色工作液,充分混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃孵育20 min。37 ℃孵育結(jié)束后,吸除上清,用JC-1染色緩沖液(1×)洗滌2次,加入1 mL細(xì)胞培養(yǎng)液,熒光顯微鏡下通過熒光通道FL1(綠)和FL2(紅)檢測分別拍照。

1.8.8 ALP染色 將BMSC細(xì)胞用4%多聚甲醛室溫固定30 min,PBS清洗3遍,按堿性磷酸酶染色試劑盒配置工作液,室溫染色30min,PBS沖洗3遍,倒置相差顯微鏡觀察采集圖像。

1.8.9 茜素紅染色 將BMSC細(xì)胞用4%多聚甲醛室溫固定30 min,PBS清洗2遍,換成茜素紅染液室溫染色5 min,PBS沖洗3遍,倒置相差顯微鏡觀察采集圖像。

1.8.10 Micro-CT檢測 每組隨機(jī)選取6只小鼠的右側(cè)股骨組織,去除股骨周圍的軟組織,用4%多聚甲醛固定48 h后,保存在70%乙醇溶液中,使用Micro-CT影像系統(tǒng)對股骨遠(yuǎn)端進(jìn)行掃描,分析骨密度(Bone mineral density,BMD)、骨體積分?jǐn)?shù)(Bone volume/tissue volume,BV/TV)、骨小梁數(shù)量(Trabecular number,Tb.N)和骨小梁分離度(Trabecular thickness trabecular separation,Tb.Sp)。

1.8.11 HE染色 分離小鼠股骨組織,在4%多聚甲醛中充分固定24 h,EDTA脫鈣液脫鈣1個月。脫鈣后進(jìn)行組織脫水、浸蠟、包埋等,制作石蠟切片。切片經(jīng)脫蠟、蘇木精-伊紅染色、脫水、透明、封片等步驟后在顯微鏡下拍照采集圖像。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 巨噬細(xì)胞衰老模型的制備

β-半乳糖苷酶染色結(jié)果顯示,與對照組相比,H2O2組可以見到大量綠色的衰老陽性細(xì)胞。CCK-8結(jié)果顯示,與對照組相比,300、400 μmol·L-1H2O2均可顯著降低細(xì)胞活力(P<0.05,P<0.001)。但H2O2為400 μmol·L-1時細(xì)胞活力較低,細(xì)胞大量死亡,因此后續(xù)的實驗采用300 μmol·L-1的H2O2來建立細(xì)胞衰老模型(圖1)。

注:A.β-半乳糖苷酶染色檢測造模后巨噬細(xì)胞衰老情況,紅色三角形指示綠色的衰老陽性細(xì)胞;B.CCK-8檢測造模后巨噬細(xì)胞的細(xì)胞活力;與對照組比較,

2.2 含藥血清對巨噬細(xì)胞衰老的影響

β-半乳糖苷酶活性染色結(jié)果顯示,與對照組相比,模型組可見大量的綠色衰老陽性細(xì)胞;與模型組相比,含藥血清組衰老陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少(圖2A)。qPCR與Western blot實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,模型組衰老相關(guān)基因p21和p53的mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05,P<0.01,P<0.001),高劑量含藥血清干預(yù)后,p21和p53 mRNA及蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05,P<0.01,P<0.001)(圖2B～C)。

注:A.β-半乳糖苷酶染色檢測含藥血清給藥后巨噬細(xì)胞衰老情況,紅色三角形指示綠色的衰老陽性細(xì)胞;B.qPCR檢測含藥血清干預(yù)后巨噬細(xì)胞p21、p53 mRNA的表達(dá);C.Western blot檢測含藥血清干預(yù)后巨噬細(xì)胞p21、p53蛋白的表達(dá);與模型組比較,

2.3 含藥血清對衰老巨噬細(xì)胞線粒體功能的影響

免疫熒光結(jié)果顯示,H2O2可刺激RAW264.7細(xì)胞中ROS產(chǎn)生(P<0.001),而含藥血清可降低ROS的產(chǎn)生(P<0.05,P<0.001)(圖3A)。為了確定功能失調(diào)線粒體的減少是否為ROS減少的原因,使用JC-1標(biāo)記來測量線粒體膜電位。免疫熒光分析結(jié)果表明,高劑量含藥血清處理后降低了JC-1綠色熒光的強(qiáng)度,而增加了JC-1紅色熒光的強(qiáng)度(P<0.05),表明線粒體膜電位在含藥血清處理后變得穩(wěn)定(圖3B)。

注:A.ROS染色檢測含藥血清給藥后衰老巨噬細(xì)胞ROS水平;B.JC-1檢測含藥血清給藥后衰老巨噬細(xì)胞線粒體功能;與模型組比較,

2.4 含藥血清對衰老巨噬細(xì)胞極化的影響

qPCR結(jié)果顯示,與對照組比較,模型組M1型相關(guān)基因iNOS顯著升高(P<0.01);高劑量含藥血清干預(yù)后,巨噬細(xì)胞iNOS的mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.01),M2型相關(guān)基因CD163和CD206表達(dá)水平升高(P<0.05)。免疫熒光結(jié)果顯示,與對照組相比,模型組中的iNOS熒光強(qiáng)度顯著增加(P<0.001);而與模型組相比,高劑量含藥血清可顯著降低iNOS熒光強(qiáng)度(P<0.01),增加M2型相關(guān)蛋白ARG1的熒光強(qiáng)度(P<0.05)(圖4)。

注:A.qPCR檢測含藥血清干預(yù)后巨噬細(xì)胞iNOS、CD206、CD163 mRNA的表達(dá)水平;B.免疫熒光檢測含藥血清給藥后衰老巨噬細(xì)胞iNOS與ARG1的表達(dá)水平;與模型組比較,

2.5 含藥血清處理的巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基對BMSC成骨分化的影響

ALP染色、茜素紅染色結(jié)果顯示,模型組-CM中ALP陽性細(xì)胞數(shù)、茜素紅陽性區(qū)域顯著少于對照組(P<0.01,P<0.001),含藥血清干預(yù)之后,ALP陽性細(xì)胞數(shù)、茜素紅陽性區(qū)域顯著增多和變大(P<0.05,P<0.01,P<0.001),說明BMSC成骨分化增強(qiáng)。qPCR結(jié)果顯示,與對照組-CM相比,模型組-CM中成骨相關(guān)基因Runx2 mRNA表達(dá)降低(P<0.05),高劑量含藥血清-CM干預(yù)后,Col1a1、Runx2 mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05,P<0.01)(圖5)。

注:A.ALP染色、茜素紅染色檢測含藥血清處理的巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基對BMSC成骨的影響;B.qPCR檢測含藥血清處理的巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基對BMSC成骨相關(guān)基因Col1a1、Runx2和OCN mRNA表達(dá);與模型組-CM比較,

2.6 溫腎通絡(luò)止痛方對小鼠股骨骨微結(jié)構(gòu)的影響

Micro-CT結(jié)果顯示,與對照組比較,模型組小鼠股骨組織中BMD、BV/TV、Tb.N均顯著降低(P<0.01,P<0.001,P<0.000 1),Tb.Sp升高(P<0.001);與模型組比較,復(fù)方高劑量組BMD、BV/TV、Tb.N均顯著增加(P<0.05,P<0.01,P<0.001),Tb.Sp顯著降低(P<0.05)(圖6)。

注:A.Micro-CT檢測各組小鼠股骨微結(jié)構(gòu);B.各組小鼠BMD、Tb.Sp、BV/TV、Tb.N比較。與模型組比較,

2.7 溫腎通絡(luò)止痛方對小鼠股骨病理變化的影響

HE染色結(jié)果顯示,與對照組比較,模型組小鼠骨小梁數(shù)量減少,間隙增寬變細(xì)多斷裂;溫腎通絡(luò)止痛方干預(yù)后,骨小梁明顯改善,數(shù)量增多變寬,骨小梁連續(xù)性增加,且骨小梁狀況隨劑量增大改善明顯(圖7)。

圖7 溫腎通絡(luò)止痛方對小鼠股骨病理變化的影響Fig.7 Effect of Wenshen Tongluo Zhitong Recipe on pathological changes of femur in mice

2.8 溫腎通絡(luò)止痛方對小鼠脛骨衰老和巨噬細(xì)胞極化相關(guān)基因的影響

qPCR結(jié)果顯示,與對照組相比,模型組脛骨衰老相關(guān)因子p21和p53 mRNA和蛋白顯著升高(P<0.01,P<0.000 1),成骨相關(guān)指標(biāo)OCN、Runx2蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.01,P<0.000 1),高劑量溫腎通絡(luò)止痛方干預(yù)后,p21和p53 mRNA和蛋白降低(P<0.05,P<0.001,P<0.000 1),成骨相關(guān)指標(biāo)OCN、Runx2蛋白表達(dá)上升(P<0.01,P<0.000 1)。與對照組比較,模型組M1型相關(guān)基因IL-6,iNOS mRNA顯著升高(P<0.01);高劑量溫腎通絡(luò)止痛方干預(yù)后iNOS mRNA降低(P<0.05),IL-10和CD206 mRNA表達(dá)水平升高(P<0.01)。詳見圖8。

注:A.qPCR檢測溫腎通絡(luò)止痛方干預(yù)后小鼠脛骨p21、p53 mRNA的表達(dá)水平;B.qPCR檢測溫腎通絡(luò)止痛方干預(yù)后小鼠脛骨IL-6、iNOS、IL-10和CD206 mRNA的表達(dá)水平;C.Western blot檢測溫腎通絡(luò)止痛方干預(yù)后小鼠脛骨p21、p53、OCN和Runx2蛋白的表達(dá)水平;與模型組比較,

3 討論

隨著我國人口老齡化的加劇,SOP的問題受到越來越多的重視。目前,我國65歲以上人群SOP發(fā)病率已達(dá)32%[7]。中醫(yī)藥對SOP的治療具有療效好、毒副作用小、治療成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為SOP為本虛標(biāo)實之證。根據(jù)藏象學(xué)說理論,本課題組將該病的病機(jī)歸納為腎精虧虛,脾虛肝郁,骨髓失養(yǎng),故以補(bǔ)益脾胃、調(diào)和臟腑、強(qiáng)筋健骨之法構(gòu)建了溫腎通絡(luò)止痛方。方中黃芪、附子主一身陽氣,鼓舞腎陽;骨碎補(bǔ)、蛇床子、狗脊、淫羊藿、山茱萸溫補(bǔ)腎陽,充養(yǎng)骨髓;狗脊、淫羊藿兼可祛風(fēng)除濕;薏苡仁、白術(shù)、白芍益氣健脾疏肝;羌活、細(xì)辛、獨(dú)活、天麻散寒通絡(luò)止痛;炙甘草調(diào)和諸藥,全方共奏補(bǔ)益脾腎、調(diào)和臟腑、強(qiáng)筋健骨之效。

中醫(yī)學(xué)對免疫的認(rèn)識由來已久,《素問·四氣調(diào)神大論》便記載:“是故圣人不治已病治未病,不治已亂治未亂”[8]4?！端貑枴ご谭ㄕ摗分幸灿涊d:“正氣存內(nèi),邪不可干,邪之所湊,其氣必虛”[8]164。正氣代表了人體防御、抵抗病邪的能力。而隨著年齡的增長、機(jī)體的衰老,臟腑功能失調(diào),人體正氣漸虛而免疫力下降。正氣的產(chǎn)生與運(yùn)行有賴于肝脾腎三臟。正氣依賴于腎中精氣所化生?！端貑枴ど瞎盘煺嬲摗分赋?“丈夫八歲,腎氣實,發(fā)長齒更……八八,天癸竭,精少,腎臟衰,形體皆極,則齒發(fā)去”[8]2。由此可見,伴隨著年齡的增長,腎之藏精與納氣功能不足,導(dǎo)致免疫功能的下降。溫腎通絡(luò)止痛方中主溫補(bǔ)腎陽淫羊藿被證實能夠提升機(jī)體的免疫能力[9]。正氣靠脾胃后天水谷之精氣充養(yǎng),故張仲景提出“四季脾旺不受邪”[10]1。隨著年齡的增長,脾胃運(yùn)化功能下降,正氣虧虛,恰符合李東垣指出的“百病皆由脾胃衰而生也”[11]7,可見,脾虛與免疫力下降密切相關(guān)。本方中白芍具有柔肝之功,對免疫系統(tǒng)的正向調(diào)節(jié)作用已被證實[12]。正氣對于機(jī)體的作用有賴于肝之疏泄。隨著機(jī)體的衰老,腎精虧虛,水不涵木,肝氣郁滯,正氣則難以發(fā)揮其功能,故而肝氣郁滯是機(jī)體免疫功能下降的重要因素。本方中細(xì)辛對細(xì)胞衰老的正向調(diào)節(jié)作用已被證實[13]。因此,溫腎通絡(luò)止痛方可通過調(diào)節(jié)臟腑平衡,影響免疫衰老,從而發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松效應(yīng)。

SOP的發(fā)生與衰老密切相關(guān),抑制衰老可以延緩疾病的進(jìn)程或減輕其嚴(yán)重程度[14]。巨噬細(xì)胞具有調(diào)節(jié)組織修復(fù)、再生的能力,在骨穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。伴隨著機(jī)體的衰老,巨噬細(xì)胞也會表現(xiàn)出細(xì)胞衰老樣特征,如線粒體膜電位降低,引起線粒體功能障礙,以及細(xì)胞衰老的標(biāo)志物p21和p53表達(dá)升高等[15-16]。同時,衰老的巨噬細(xì)胞傾向于向M1型分化,并分泌SASPs,使機(jī)體處于長期的炎癥狀態(tài)[17-19]。H2O2能夠通過其氧化作用誘導(dǎo)體外細(xì)胞衰老[20]。本研究中,H2O2可以增加β-糖苷酶陽性巨噬細(xì)胞的數(shù)量,使巨噬細(xì)胞衰老標(biāo)志物p21和p53的mRNA及蛋白表達(dá)均明顯升高,并使其M1型相關(guān)基因iNOS的mRNA顯著升高,促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1極化。同時,H2O2還可以使巨噬細(xì)胞內(nèi)ROS不斷累積,線粒體膜電位降低,引起線粒體功能障礙。而含藥血清降低了巨噬細(xì)胞衰老標(biāo)志物p21和p53的mRNA及蛋白的表達(dá);減少了ROS的產(chǎn)生;降低了JC-1綠色熒光的強(qiáng)度,增加了JC-1紅色熒光的強(qiáng)度。提示含藥血清可以在一定程度上改善線粒體的功能,改善巨噬細(xì)胞的衰老。D-半乳糖是一種活性氧促進(jìn)劑,廣泛應(yīng)用于衰老動物模型的建立[16]。本研究觀察到通過D-半乳糖建立的SOP小鼠脛骨中衰老標(biāo)記物p21和p53表達(dá)明顯增高,溫腎通絡(luò)止痛方明顯下調(diào)上述分子的mRNA及蛋白表達(dá)水平,由此可見,溫腎通絡(luò)止痛方在一定程度上可以改善SOP小鼠模型股骨的老化現(xiàn)象。同時,通過比較模型組與復(fù)方組小鼠脛骨中巨噬細(xì)胞極化相關(guān)基因,發(fā)現(xiàn)溫腎通絡(luò)止痛方可顯著促進(jìn)脛骨中巨噬細(xì)胞IL-10和CD206 mRNA的表達(dá),促進(jìn)脛骨中巨噬細(xì)胞向M2極化。根據(jù)以上分析,溫腎通絡(luò)止痛方可改善骨微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞衰老與分化。

巨噬細(xì)胞和BMSC之間的相互作用對于維持骨穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。根據(jù)微環(huán)境中的信號分子,巨噬細(xì)胞可以被極化為M1或M2狀態(tài)[21]。Song和Wu等發(fā)現(xiàn)M1型巨噬細(xì)胞可通過分泌外泌體抑制BMSCs的成骨分化[22-23]。此外,Assoian等報道,M2型巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量成骨生長因子驅(qū)動BMSC向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化[24-25]。近期有文章報道,在免疫衰老的過程中,衰老的巨噬細(xì)胞積累和分泌大量的鈣顆粒蛋白進(jìn)入骨髓,不僅抑制BMSC的成骨分化,也刺激其成脂分化,最終加速骨老化[26]。我們的研究結(jié)果表明,與H2O2處理的巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基組相比,含藥血清處理的巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基能顯著升高鈣沉積和ALP陽性表達(dá),并促進(jìn)成骨相關(guān)基因Runx2和Col1a1 mRNA表達(dá)。此外,溫腎通絡(luò)止痛方能顯著增加D半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠股骨Tb.N、BMD、BV/TV等骨微結(jié)構(gòu),并改善骨小梁數(shù)量及寬度,還可以促進(jìn)成骨相關(guān)指標(biāo)OCN、Runx2蛋白表達(dá)。根據(jù)以上分析,溫腎通絡(luò)止痛方可通過改善骨微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞衰老與極化,進(jìn)而促進(jìn)BMSC成骨分化,從而減少骨質(zhì)的流失。

綜上所述,我們在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下,從衰老巨噬細(xì)胞-BMSC成骨分化的角度出發(fā),進(jìn)行了初步探索,發(fā)現(xiàn)溫腎通絡(luò)止痛方可能通過緩解巨噬細(xì)胞衰老,改變巨噬細(xì)胞M1/M2極化表型,促進(jìn)BMSC成骨分化,維持骨穩(wěn)態(tài)。由此得出,骨髓微環(huán)境對于骨重塑至關(guān)重要,調(diào)控骨髓衰老微環(huán)境可以作為未來抗骨質(zhì)疏松的有效手段。但是,本實驗仍有不足,在衰老骨髓微環(huán)境中,衰老巨噬細(xì)胞與BMSC之間的通訊機(jī)制沒有明確,可通過測序分析進(jìn)一步挖掘。