杜靜婷，藺 楠，施俊鳳

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太原 030031）

灰霉病是水果貯運(yùn)期間最常發(fā)生且破壞性最強(qiáng)的病害，尤其是漿果類(lèi)水果[1]。灰霉病的病原菌為灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea），屬腐生致病菌，在果實(shí)采前和采后均可被侵染?；移咸焰呙箤?duì)環(huán)境的適應(yīng)能力強(qiáng)，其孢子在低溫條件下即可萌發(fā)生長(zhǎng)，在貯藏環(huán)境中極易繁殖，嚴(yán)重影響果品的商品價(jià)值及食用價(jià)值。長(zhǎng)期以來(lái)，化學(xué)殺菌劑是防治果蔬采后腐爛的主要方法，但化學(xué)殺菌劑易造成環(huán)境污染，產(chǎn)生植物耐藥性，且其殘留也對(duì)人體健康有害[2-3]，因此，尋找新的無(wú)公害防治方法勢(shì)在必行[4]。

目前，微生物防治方法由于無(wú)殘留、不產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是最有可能替代化學(xué)殺菌劑的方法之一[5]。大量研究表明，拮抗菌可以有效防治灰霉病。Karabulut等[6]研究發(fā)現(xiàn)，利用檸檬形克勒克酵母（Kloeckera apiculata）能有效控制貯藏30 d 的桃灰霉病的發(fā)生，貯藏45 d 時(shí)，生防效果超過(guò)83%。White等[7]將灰綠鏈霉菌（Streptomyces griseovirides）菌株制成可以預(yù)防萵苣灰霉病的菌劑Mycostop。Zahavi等[8]研究表明，假絲酵母（Candida guilliermondii）對(duì)葡萄上由灰葡萄孢霉及黑曲霉引起的腐敗具有明顯的抑制效果，與對(duì)照相比，分別可以減少腐敗損失約17%和60%。Shi等[9]發(fā)現(xiàn)，采用1×109CFU/mL腸桿菌Enterobacter cowanii對(duì)番茄進(jìn)行傷口接種試驗(yàn)，對(duì)果實(shí)灰霉病的生防效果可達(dá)95.24%。Hassan等[10]發(fā)現(xiàn)，拮抗菌沙福芽孢桿菌（Bacillus safensis）B3可以通過(guò)水解灰葡萄孢霉的細(xì)胞壁抑制草莓灰霉病的發(fā)生。

本研究以梨果灰霉病為靶標(biāo)，從葡萄果實(shí)表面分離、篩選出具有抗菌活性的細(xì)菌菌株。利用生理生化和分子鑒定相結(jié)合的方法，對(duì)菌株H-1 進(jìn)行鑒定，并對(duì)其體外抑菌作用和生防效力進(jìn)行評(píng)價(jià)，旨在為果蔬采后灰霉病防治新方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

拮抗菌株分離自山西省晉中市太谷縣種植的‘玫瑰香’葡萄表面，GeneBenk登錄號(hào)為OP919568.1；用于拮抗菌生防效果試驗(yàn)的梨果采自山西省晉中市太谷縣，品種為‘酥梨’；病原菌由本實(shí)驗(yàn)室從自然發(fā)病的草莓、葡萄、梨果等病健交界處分離，經(jīng)科赫氏法則鑒定和分子鑒定等方法確定，保存于本實(shí)驗(yàn)室。

27F/1541R 引物、gyrB-34F/gyrB-977R 引物，華大基因科技集團(tuán)公司；MRS培養(yǎng)基、LA培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；TaqDNA 聚合酶，上海羅氏制藥有限公司；核酸染料、D2000DNA Marker、D-絲氨酸、D-天冬氨酸、甘氨酸-L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-組氨酸、L-焦谷氨酸、L-絲氨酸、D-葡糖酸、D-葡萄糖醛酸、葡糖醛酰胺、粘酸、奎寧酸、糖質(zhì)酸、L-乳酸、檸檬酸、α-酮戊二酸、D-蘋(píng)果酸、L-蘋(píng)果酸、溴代丁二酸、萘啶酸、α-丁酮酸、乙酰乙酸、丙酸、乙酸、甲酸、ρ-羥基苯乙酸、γ-氨基丁酸、α-羥丁酸、β-羥基-D,L-丁酸、氨曲南、DL-精氨酸、糊精、D-麥芽糖、D-海藻糖、D-纖維二糖、龍膽二糖、蔗糖、松二糖、水蘇糖、D-棉子糖、α-D-乳糖、D-蜜二糖、β-甲基-D-葡糖苷、D-水楊苷、N-乙酰-D-葡糖胺、N-乙酰-β-D-甘露糖胺、N-乙酰-D-半乳糖胺、N-乙酰神經(jīng)氨酸、α-D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、D-半乳糖、3-甲基-D-葡萄糖、D-巖藻糖、L-巖藻糖、L-鼠李糖、肌苷、乳酸鈉、夫西地酸、D-山梨醇、D-甘露醇、D-阿糖醇、肌醇、甘油、D-葡糖-6-磷酸、D-果糖-6-磷酸、果膠、D-半乳糖醛酸、L-半乳糖酸內(nèi)酯、竹桃霉素、利福霉素、二甲胺四環(huán)素、林可霉素、鹽酸胍、蛋白酶K、十六烷基三甲基溴化胺（CTAB）、十四烷硫酸鈉、萬(wàn)古霉素，北京索萊寶生物科技有限公司；對(duì)二甲基氨基苯甲醛、甲基紅、溴甲酚紫、四唑紫、四唑藍(lán)、KOH、檸檬酸鈉、硝基酚-β-半乳糖苷、明膠、丁酸鈉、溴酸鈉、丙酮酸甲酯、D-乳酸甲酯、氯化鋰、亞碲酸鉀、吐溫40、次氯酸、異丙醇，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)器，上海一恒科技有限公司；DW-HL340 超低溫冷凍儲(chǔ)存箱，中科美菱低溫科技有限公司；ALLEGRAX-30R 型高速冷凍離心機(jī)，貝克曼庫(kù)爾特公司；LifeECO 型基因擴(kuò)增儀，杭州博日科技有限公司；Geldol-Lt 315 型凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)UVP 公司；DYY-6C 型電泳儀電源，北京市六一儀器廠(chǎng)；BX51 型微分干涉相差顯微鏡，日本OLYMPUS 公司；UItrospec2000型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，GE HealthCare Technologies 公司；PHS-25 型雷磁pH 計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌株H-1的鑒定

將保存于實(shí)驗(yàn)室的拮抗菌株H-1 接種于LA 培養(yǎng)基中，160 r/min，26 ℃培養(yǎng)24 h 后，10 000 r/min 離心10 min，取沉淀并用無(wú)菌水清洗3 次后離心，再于-4 ℃保存用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.1.1 基因組DNA的提取

使用SDS-蛋白酶K 裂解，十六烷基三甲基溴化銨沉淀細(xì)胞碎片和多糖，再用異丙醇沉淀的方法提取基因組DNA。

1.2.1.2 菌株H-1的16S rDNA克隆

按照Coenye 等[11]的方法擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA。引物為27F（5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’）和1541R（5’-AAG GAG GTG ATC CAC CC-3’）。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min 15 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃終止10 min。PCR反應(yīng)體系為：TaqDNA聚合酶（5 U/μL）0.8 μL；10×PCR Buffer（Mg2+Plus）10 μL；dNTP Mixture 8 μL；模板DNA 2.5 ng；引物F1（10 μmoL/L）2 μL，引物R1（10 μmoL/L）2 μL；ddH2O補(bǔ)足至100 μL。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳及EB 染色后用紫外凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析，回收目的片段并純化后，由上海英駿基因有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.2.1.3 菌株H-1的gyrB基因克隆

參照Yamamoto等[12]的方法，克隆gyrB基因的正向引物為gyrB-34F（5’-ggTgTWRgKgCNgTCgTAAACg-3’），反向引物為gyrB-977R（5’-CCSgCAgARTCACCCTCTACg-3’）。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃下變性1 min，55 ℃下退火2 min 15 s，72 ℃下延長(zhǎng)2 min 15 s，3 個(gè)循環(huán)；95 ℃下變性35 s，55 ℃下退火1 min，72 ℃下延長(zhǎng)1 min 15 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃終止7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳及EB染色后用紫外凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析，回收目的片段并純化后，由上海英駿基因有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

gyrB基因序列反應(yīng)體系為100 μL：Taq（5 U/μL）0.8 μL；10×PCR Buffer（Mg2+Plus）10 μL；dNTP Mixture（2.5 mmol/each）8 μL；模板DNA 2.5 ng；gyrB-34F（10 mmol/L）2 μL，gyrB-977R（10 mmol/L）2 μL；ddH2O補(bǔ)足至100 μL。

1.2.1.4 同源比較及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

將克隆的基因DNA 序列進(jìn)行測(cè)序后，進(jìn)行Blast同源性比較，使用MEGA4.1 采用鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，自展數(shù)據(jù)集為1 000次[13]。

1.2.1.5 生理生化指標(biāo)分析

依據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[14]第8 版對(duì)菌株進(jìn)行生理生化測(cè)定。

1.2.2 拮抗菌H-1對(duì)病原真菌的體外抑制

1.2.2.1 拮抗菌H-1與病原真菌對(duì)峙培養(yǎng)

采用菌碟法，將菌株H-1純化后，挑取單菌落接種于100 mL 的LB 培養(yǎng)基中，37 ℃200 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h，采用稀釋平板法測(cè)定濃度后，以無(wú)菌水配制濃度分別為1×105、1×106、1×107、1×108、1×109CFU/mL的拮抗菌懸浮液。在直徑9 cm的培養(yǎng)皿中倒入PDA培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基凝固后，分別加入不同濃度的拮抗菌H-1 懸浮液100 μL，對(duì)照（CK）加無(wú)菌水涂布均勻后，無(wú)菌風(fēng)吹干，再于中心點(diǎn)分別接入直徑為5 mm的細(xì)極鏈格孢、灰葡萄孢霉、串珠鐮孢菌菌餅。26 ℃下恒溫培養(yǎng)，5～7 d 后測(cè)量菌落直徑，并計(jì)算其抑制率。每個(gè)處理3次重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)3次。抑制率計(jì)算公式如下：

式中：dC代表對(duì)照菌落直徑，mm；dT代表不同處理?xiàng)l件下菌落直徑，mm。

1.2.2.2 拮抗菌對(duì)灰葡萄孢霉菌絲形態(tài)的影響

在PDA 平板中心點(diǎn)接種灰葡萄孢菌，在距平板中心1/3 處采用劃直線(xiàn)方式接種H-1 菌株，26 ℃下培養(yǎng)3 d 后分別挑取背對(duì)拮抗菌和面對(duì)拮抗菌的灰葡萄孢菌菌絲，于掃描電鏡下觀(guān)察菌絲的形態(tài)變化。

1.2.3 拮抗菌H-1對(duì)酥梨采后灰霉病的抑制作用

取無(wú)病蟲(chóng)害的健康梨果，用2%NaClO 對(duì)果實(shí)進(jìn)行表面消毒，并于果實(shí)腰部刺直徑5 mm深3 mm的傷口，每個(gè)果實(shí)2個(gè)傷口。H-1菌沉淀中加入無(wú)菌水稀釋?zhuān)趥谔幏謩e滴加濃度為1×108、1×109、1×1010、1×1011CFU/mL 的拮抗菌H-1菌懸液，對(duì)照（CK）加無(wú)菌水。2 h 后在傷口處接種1×105CFU/mL 的灰葡萄孢（B.cinerea）20 μL，室溫下保濕培養(yǎng)5 d，然后測(cè)量病斑直徑并計(jì)算抑制率。每個(gè)處理20 個(gè)果實(shí)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株H-1的菌落形態(tài)

將細(xì)菌菌株H-1 于26 ℃培養(yǎng)24 h 后，菌落呈圓形，邊緣不整齊，不透明，乳脂色（圖1A）。將菌株革蘭氏染色后，置于微分干涉相差顯微鏡下觀(guān)察，菌株呈桿狀，為革蘭氏陽(yáng)性菌（圖1B）。

2.2 菌株H-1的生理生化特性

采用Biolog GEN III MicroStation自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)對(duì)菌株H-1 的生理生化特性進(jìn)行分析，結(jié)果如表1 和表2 所示。由表1 和表2 可以看出，菌株H-1可以形成芽孢，同時(shí)可利用多種碳源和氮源。

表1 菌株H-1的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain H-1

表2 菌株H-1 對(duì)不同碳源和氮源的利用情況Table 2 Utilization of different carbon sources and nitrogen sources by strain H-1

2.3 菌株H-1 的16S rDNA 同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

試驗(yàn)所用引物擴(kuò)增出的基因組16S rDNA序列全長(zhǎng)為1 437 bp。將所測(cè)得序列經(jīng)Blast同源性比較后，以日內(nèi)瓦分枝桿菌（Mycobacterium genavense）為外群，使用MEGA4.1軟件，采用鄰位連接法構(gòu)建該菌株的16S rDNA 的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2），進(jìn)行1 000 次的相似度重復(fù)計(jì)算，圖中發(fā)育樹(shù)節(jié)點(diǎn)只顯示Bootstrap值大于50%的數(shù)值。聚類(lèi)結(jié)果顯示，菌株H-1 與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）和暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamensis）聚為一類(lèi)，表明其親緣關(guān)系較近。

圖2 通過(guò)鄰接法構(gòu)建的基于菌株H-1 16S rDNA 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of strain H-1 constructed by Neighbor-joining

2.4 H-1與相關(guān)種的gyrB基因序列系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

為了更準(zhǔn)確鑒定細(xì)菌菌株H-1，通過(guò)對(duì)持家基因gyrB進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，擴(kuò)增的片段經(jīng)測(cè)序所得序列長(zhǎng)度為892 bp。為了進(jìn)一步鑒定菌株H-1的種，將所測(cè)得序列經(jīng)Blast進(jìn)行同源性比較后，以芽孢桿菌Bacillus safensisFO-036bT為外群，使用MEGA4.1軟件采用鄰位連接法構(gòu)建該菌株H-1的gyrB基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖3）。結(jié)果表明：菌株H-1 與貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）BCRC 17467T聚為一類(lèi)，自舉支持率為100%，所以確定菌株H-1為貝萊斯芽孢桿菌。

圖3 通過(guò)鄰接法構(gòu)建的基于菌株H-1 gyrB基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree based on gyrB sequence of strain H-1 constructed by Neighbor-joining

2.5 拮抗菌體外抑菌作用

2.5.1 拮抗菌H-1對(duì)病原真菌的體外抑制效果

由圖4可以看出：供試的不同濃度的拮抗菌H-1均可以有效抑制串珠鐮孢菌（Fusarium verticillioides）、細(xì)極鏈格孢（Alternaria tenuissima）和灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）菌絲的正常生長(zhǎng)，且拮抗菌H-1的菌液濃度越高，其抑菌作用也越強(qiáng)。結(jié)果顯示：拮抗菌H-1 對(duì)灰葡萄孢霉的抑制作用最強(qiáng)，當(dāng)菌液濃度為1×105CFU/mL時(shí)，抑制率達(dá)85.12%，菌液濃度達(dá)到1×108CFU/mL時(shí)，能完全抑制該病原真菌的生長(zhǎng)。H-1 對(duì)串珠鐮孢菌的抑制作用最弱，在菌液濃度為1×105CFU/mL時(shí)，抑制率為78.25%。

圖4 不同濃度拮抗菌H-1菌懸液對(duì)3種病原真菌的抑制效果Fig.4 Inhibitory effects of different concentrations of antagonistic H-1 bacterial suspension against three pathogenic fugus

2.5.2 拮抗菌對(duì)灰葡萄孢霉菌絲形態(tài)的影響

根據(jù)“2.5.1”的試驗(yàn)結(jié)果，貝萊斯芽孢桿菌H-1對(duì)灰葡萄孢霉的抑制作用最強(qiáng)。兩者對(duì)峙培養(yǎng)后，于掃描電鏡下觀(guān)察菌絲形態(tài)。可以看出，背對(duì)拮抗菌端的灰葡萄孢菌菌絲外表光滑，生長(zhǎng)均勻，較粗壯（圖5A）；面對(duì)拮抗菌端的灰葡萄孢菌菌絲粗細(xì)不均勻，表面皺縮，有內(nèi)含物溢出（圖5B）。說(shuō)明貝萊斯芽孢桿菌H-1 能改變灰葡萄孢霉菌絲形態(tài)，抑制菌絲生長(zhǎng)。

圖5 拮抗菌H-1對(duì)灰葡萄孢霉菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effect of antagonistic strain H-1 on mycelial growth of Botrytis cinerea

2.5.3 拮抗菌H-1對(duì)酥梨采后灰霉病的抑制效果

接入不同濃度的拮抗菌懸浮液后，梨果對(duì)灰霉病的抑制率及病斑直徑統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖6 所示。隨著拮抗菌懸液濃度的升高，抑制率呈上升趨勢(shì)，病斑直徑呈下降趨勢(shì)。培養(yǎng)5 d時(shí)調(diào)查顯示：對(duì)照組的抑制率為0，病斑直徑達(dá)3.15 cm；使用1×1010CFU/mL拮抗菌懸浮液處理的抑制率高達(dá)94.76%，病斑直徑為0.62 cm 時(shí)，抑制灰霉病效果顯著；而使用最高濃度1×1011CFU/mL處理時(shí)，可完全抑制灰霉病的發(fā)生。

圖6 拮抗菌H-1對(duì)酥梨采后灰霉病的抑制作用Fig.6 Inhibitory effect of antagonistic strain H-1 on Botrytis cinerea of postharvest crisp pear

3 討論與結(jié)論

芽孢桿菌（Bacillusspp.）作為生防細(xì)菌，已廣泛應(yīng)用于動(dòng)物和植物的病害防控，也是當(dāng)今微生物生態(tài)防控的研究熱點(diǎn)。貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）為芽孢桿菌屬的一個(gè)新種，于2005 年由西班牙科學(xué)家從貝萊斯河流中分離而來(lái)，故得名貝萊斯芽孢桿菌[15]。貝萊斯芽孢桿菌與其親緣關(guān)系相近的種通過(guò)表型難以區(qū)分，經(jīng)典的分類(lèi)學(xué)方法，如形態(tài)和生理特征、細(xì)胞壁成分、（G+C）摩爾分?jǐn)?shù)等難以有效區(qū)分芽孢桿菌復(fù)合群內(nèi)的各個(gè)種[16]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，貝萊斯芽孢桿菌的物種鑒定更加高效、準(zhǔn)確。而基于16S rRNA基因序列進(jìn)化分析，貝萊斯芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、死亡谷芽孢桿菌的親緣關(guān)系較近，序列相似性高達(dá)99%，高于物種劃分推薦的閾值（＞98.65%）[17]。因此，僅通過(guò)16S rRNA 基因序列不能準(zhǔn)確鑒定。而gyrB基因的相似性與DNA雜交結(jié)果有很好的線(xiàn)性關(guān)系[18]，因此可以借助此基因清晰鑒定到種。本研究也進(jìn)一步驗(yàn)證了這一點(diǎn)，通過(guò)持家基因gyrB構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，將菌株H-1與同屬的不同種區(qū)別開(kāi)來(lái)。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌不僅可以促進(jìn)動(dòng)植物生長(zhǎng)，而且有較強(qiáng)的抑菌作用，可應(yīng)用于生物防治、藥物研發(fā)、食品發(fā)酵和工業(yè)應(yīng)用等領(lǐng)域[19-21]。貝萊斯芽孢桿菌主要通過(guò)分泌脂肽類(lèi)抗生素、聚酮類(lèi)化合物和抗菌蛋白等次級(jí)代謝產(chǎn)物發(fā)揮抑菌作用[20，22-23]。關(guān)于貝萊斯芽孢桿菌在植物病害防控方面的報(bào)道較多。楊勝清[24]從園藝大棚土壤中分離出貝萊斯芽孢桿菌S6，該菌的發(fā)酵原液和100倍稀釋液對(duì)番茄早疫病的田間防治有效率分別為80.83%和64.88%。Trinh 等[25]從土壤中分離出貝萊斯芽孢桿菌RB.DS29，該菌株不僅具有促生作用，而且可以降低溫室栽培黑胡椒的發(fā)病率和死亡率。沙月霞等[26]從水稻葉片中分離到一株貝萊斯芽孢桿菌E69，該菌株具有廣譜抑菌性，能夠在水稻莖部表皮、薄壁組織和維管束有效定殖，對(duì)水稻葉瘟病的田間預(yù)防效果高達(dá)85.97%。另外，也有貝萊斯芽孢桿菌用于果實(shí)采后病害防治的相關(guān)報(bào)道。Sun等[27]從梨園土壤中分離到貝萊斯芽孢桿菌L-1，該菌株在‘皇冠’梨上接種11 d 后，對(duì)梨輪紋病的抑制率達(dá)到了76.55%，同時(shí)還可誘導(dǎo)梨果實(shí)的抗性。本試驗(yàn)中，無(wú)論是傷口試驗(yàn)還是自然腐爛試驗(yàn)，貝萊斯芽孢桿菌H-1均能有效降低梨果實(shí)采后灰霉病的發(fā)生，具有很好的生防潛力。