郝玉娟 周 輝 曹 蒙

卵巢癌是女性生殖道惡性腫瘤中發(fā)病率第三,病死率第一的婦科惡性腫瘤,其中上皮性卵巢癌居多,5年生存率低于45%。卵巢癌大多發(fā)生在50歲以上的人群中,患者常出現(xiàn)非特異性盆腔或腹部癥狀[1-2]。初步診斷檢查包括經(jīng)陰道超聲檢查和血清腫瘤抗原125測(cè)定。然而,這些檢測(cè)并不針對(duì)卵巢癌。常規(guī)治療包括手術(shù)減積,然后化療[3-4]。預(yù)后通常由癌癥的分期和分級(jí)決定,盡管未來的治療可能取決于腫瘤的基因組成。然而在上皮性卵巢癌發(fā)生后,由于70%的病例在Ⅲ期或Ⅳ期被診斷,因此預(yù)后較差[5-6]。卵巢癌多發(fā)生在圍絕經(jīng)期并且進(jìn)展速度較快,該過程與激素引起免疫紊亂和血管豐富程度密切相關(guān)[7]。據(jù)報(bào)道,卵巢癌組織中血管生成與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF)高表達(dá)存在緊密聯(lián)系,VEGF結(jié)合受體后能夠促進(jìn)卵巢癌新生血管生成并加快腫瘤發(fā)展[8]。據(jù)報(bào)道,抗腫瘤藥物貝伐珠單抗能夠抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的活性,進(jìn)而抑制血管形成和腫瘤發(fā)展。研究表明,貝伐珠單抗聯(lián)合化療方案有利于提高貝伐珠單抗在卵巢癌等癌癥方面的治療效果[9]。目前,相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)NF-κB/HIF-1α/VEGF通路在腫瘤發(fā)展中發(fā)揮促進(jìn)作用,例如調(diào)控該信號(hào)通路能夠干擾食管癌、乳腺癌和皮膚鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)展[10-12]。然而,關(guān)于貝伐珠單抗聯(lián)合化療治療方案與NF-κB/HIF-1α/VEGF通路在卵巢癌中的關(guān)系以及該通路對(duì)卵巢癌的發(fā)展尚未有過系統(tǒng)性報(bào)道。因此,本研究旨在探討貝伐珠單抗在其聯(lián)合化療藥物后對(duì)卵巢癌的抑癌效果及其相關(guān)機(jī)制,以期發(fā)現(xiàn)新的抗卵巢癌方法。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人卵巢癌SKOV3細(xì)胞(廣州博輝生物科技);紫杉醇(美國sigma公司);貝伐珠單抗(美國sigma公司);青霉素/鏈霉素(美國Invitrogen公司);RPMI 1640(安諾倫生物科技有限公司);VEFG抗體(英國abcam公司,ab32152);NF-κB p65抗體(美國CST公司,8242S);HIF-1α抗體(美國CST公司,36169S);GAPDH抗體(英國abcam公司,ab8245);Ki-67抗體(美國Santa Cruz公司,SC-23900);Bax抗體(英國abcam公司,ab32503);Bcl-2抗體(英國abcam公司,ab141523)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

細(xì)胞在RPMI 1640培養(yǎng)基(10%胎牛血清)中培養(yǎng),培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃和5%濃度的二氧化碳。將細(xì)胞分為三組,分別為:①對(duì)照組;②貝伐珠單抗組;③聯(lián)合用藥組。其中貝伐珠單抗組的給藥濃度為5 μM,聯(lián)合用藥組的給藥濃度為貝伐珠單抗(5 μm)和紫杉醇(1 μm),藥物處理24 h后開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

將SKOV3細(xì)胞接種在96孔板中,按照不同實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行不同處理,各組細(xì)胞孵育24 h后按照試劑說明書使用MTT試劑進(jìn)行染色,反應(yīng)4 h后洗滌未結(jié)合的染料,并將染色的細(xì)胞溶解在150 μL DMSO中,在490 nm處檢測(cè)吸光度以反映細(xì)胞增殖能力。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)分析SKOV3細(xì)胞凋亡率

不同實(shí)驗(yàn)組處理24 h后,PBS輕微沖洗2次后,在4 ℃下用70%乙醇固定1 h。細(xì)胞與50 μL RNase在室溫下孵育10 min以降解RNA。將細(xì)胞在4 ℃下以1 500 g離心5 min,然后加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶在室溫下暗處雙染色30 min。使用流式細(xì)胞術(shù)分析SKOV3細(xì)胞凋亡率。

1.5 細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞生長(zhǎng)能力

將各組SKOV3細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶從培養(yǎng)皿消化后,并以3×105個(gè)細(xì)胞/孔的數(shù)量轉(zhuǎn)移到6孔板培養(yǎng)皿中,24 h后將50個(gè)細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)皿中,繼續(xù)培養(yǎng)2個(gè)星期,將細(xì)胞用結(jié)晶紫溶液染色20 min并在顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.6 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)變化

使用RIPA裂解緩沖液從細(xì)胞系中提取總蛋白質(zhì)樣品,并使用考馬斯亮藍(lán)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。將變性后蛋白樣品在12% SDS-PAGE膠上開始電泳分離,電泳完成后將DS-PAGE膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用在5%脫脂牛奶室溫封閉膜2 h。然后,將PVDF膜與對(duì)應(yīng)的一級(jí)抗體在4 ℃下孵育過夜。用TBST洗滌后,將PVDF膜與二級(jí)抗體在室溫下孵育2 h,并通過增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)捕獲印記信號(hào)。

1.7 Trans well實(shí)驗(yàn)分析SKOV3細(xì)胞遷移能力

在無血清RPMI-1640培養(yǎng)基下,將給藥處理完成后的SKOV3細(xì)胞轉(zhuǎn)移到Transwell小室的上面。將含有15%血清的RPMI-1640培養(yǎng)基加入下室。24 h后,在顯微鏡下觀察到侵入下室的細(xì)胞,隨后用結(jié)晶紫染色,使用Image J軟件統(tǒng)計(jì)SKOV3細(xì)胞侵襲情況。

1.8 裸鼠異種移植腫瘤模型建立

30只雌性BALBc-Nude裸鼠購于集萃藥康公司,并將裸鼠置于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境中飼養(yǎng),自由飲食、飲水。將SKOV3細(xì)胞(1×106個(gè)細(xì)胞)懸浮在100 μl無血清培養(yǎng)基中,并皮下注射到4～6周齡的裸鼠腋下,飼養(yǎng)2周;當(dāng)腫瘤體積達(dá)到30 mm3時(shí),將接種腫瘤細(xì)胞的裸鼠按隨機(jī)分為3組,每組10只。對(duì)照組裸鼠腹腔注射PBS,1次/天;貝伐珠單抗組腹腔注射貝伐珠單抗(1.5 mg/kg,溶于PBS),1次/天,聯(lián)合用藥組腹腔注射貝伐珠單抗(1.5 mg/kg,溶于PBS)+紫杉醇(0.5 mg/kg,溶于PBS)1次/天。各組每日采用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小,然后通過統(tǒng)計(jì)每組裸鼠腫瘤體積。在干預(yù)第5個(gè)星期后,安樂死裸鼠,分離出腫瘤,稱重后以10%甲醛溶液固定。

1.9 裸鼠腫瘤組織Ki-67表達(dá)檢測(cè)

采用免疫組織化學(xué)法。各組裸鼠腫瘤組織固定48 h后使用石蠟包埋,將包埋后的組織進(jìn)行切片,然后脫蠟復(fù)水,進(jìn)過抗原修復(fù)、過氧化氫酶處理,封閉等步驟后,將切片與Ki-67抗體一起孵育,在含5%BSA的PBS中4 ℃孵育過夜。次日與辣根過氧化物酶偶聯(lián)物孵育切片,DAB顯色。最后使用顯微鏡觀察,使用圖像分析軟件Olympus cell Dimension計(jì)算陽性率。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均以mean SD表示。兩組或多組比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析。P<0.05為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 貝伐珠單抗聯(lián)合化療藥物對(duì)SKOV3細(xì)胞中NF-κB/HIF-1α/VEGF通路的影響

與對(duì)照組相比,貝伐珠單抗組、聯(lián)合用藥組SKOV3細(xì)胞中VEGF/HIF-1α/NF-κB蛋白的表達(dá)水平下降(P<0.05)。與貝伐珠單抗組相比,聯(lián)合用藥組SKOV3細(xì)胞中VEGF/HIF-1α/NF-κB蛋白的表達(dá)水平明顯下降(P<0.05),見圖1,表1。結(jié)果提示,貝伐珠單抗聯(lián)合化療藥物對(duì)SKOV3細(xì)胞中VEGF/HIF-1α/NF-κB通路具有抑制作用。

表1 SKOV3細(xì)胞中NF-κB/HIF-1α/VEGF通路的相對(duì)表達(dá)水平

注:A為Western blotting分析結(jié)果;B為Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.2 貝伐珠單抗聯(lián)合化療藥物對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖和侵襲的影響

與對(duì)照組相比,貝伐珠單抗組、聯(lián)合用藥組SKOV3細(xì)胞增殖能力、侵襲能力均下降(P<0.05)。與貝伐珠單抗組相比,聯(lián)合用藥組SKOV3細(xì)胞增殖、侵襲能力明顯下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖2和表2。結(jié)果提示,貝伐珠單抗聯(lián)合化療藥物對(duì)SKOV3細(xì)胞的增殖、侵襲能力具有抑制作用。

表2 貝伐珠單抗聯(lián)合化療藥物對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖、侵襲的影響

注:A為SKOV3細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果;B為細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果(400×);C為細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析;D為細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析;E為MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析。

2.3 貝伐珠單抗聯(lián)合化療藥物對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組相比,貝伐珠單抗組、聯(lián)合用藥組SKOV3細(xì)胞凋亡率增高(P<0.05)。與貝伐珠單抗組相比,聯(lián)合用藥組SKOV3細(xì)胞凋亡率明顯增高(P<0.05),見表3和圖3。結(jié)果提示,貝伐珠單抗聯(lián)合化療藥物能夠促進(jìn)SKOV3細(xì)胞凋亡。

表3 貝伐珠單抗聯(lián)合化療藥物對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡的影響

注:①②③為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SKOV3細(xì)胞凋亡結(jié)果圖像;④為細(xì)胞凋亡率的統(tǒng)計(jì)分析。

2.4 貝伐珠單抗聯(lián)合化療藥物對(duì)裸鼠移植腫瘤NF-κB/HIF-1α/VEGF通路的影響

往BALBc-Nude裸鼠體內(nèi)植入SKOV3細(xì)胞5周后,與對(duì)照組相比,貝伐珠單抗組、聯(lián)合用藥組裸鼠移植腫瘤中VEGF/HIF-1α/NF-κB蛋白的表達(dá)水平下降(P<0.05)。與貝伐珠單抗組相比,聯(lián)合用藥組裸鼠移植腫瘤中VEGF/HIF-1α/NF-κB蛋白的表達(dá)水平明顯下降(P<0.05),見表4和圖4。結(jié)果提示,貝伐珠單抗聯(lián)合化療藥物對(duì)裸鼠移植腫瘤VEGF/HIF-1α/NF-κB通路具有抑制作用。

表4 腫瘤組織中NF-κB/HIF-1α/VEGF通路的相對(duì)表達(dá)水平

注:A為Western blotting分析NF-κB/HIF-1α/VEGF通路蛋白表達(dá)的結(jié)果;B為Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析。

2.5 貝伐珠單抗聯(lián)合化療藥物對(duì)裸鼠移植腫瘤的影響

往BALBc-Nude裸鼠體內(nèi)植入SKOV3細(xì)胞5周后,與對(duì)照組比較,貝伐珠單抗組、聯(lián)合用藥組裸鼠移植腫瘤體積均縮小,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與貝伐珠單抗組相比,聯(lián)合用藥組裸鼠移植腫瘤體積明顯縮小(P<0.05)。此外,免疫組化結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,貝伐珠單抗組、聯(lián)合用藥組裸鼠移植腫瘤中Ki-67表達(dá)降低,凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2的比值升高(P<0.05),與貝伐珠單抗組相比,聯(lián)合用藥組裸鼠移植腫瘤中Ki-67表達(dá)明顯降低,凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2的比值升高(P<0.05),見圖5。結(jié)果提示,貝伐珠單抗聯(lián)合化療藥物能夠抑制裸鼠移植腫瘤的生長(zhǎng)。

注:A為三組腫瘤生長(zhǎng)曲線比較;B為三組腫瘤體積比較;C為Ki-67在各組織中的表達(dá);D為Western blotting分析Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)。

3 討論

上皮性卵巢癌是最常見的卵巢癌類型,由于70%的病例在Ⅲ期或Ⅳ期被診斷,因此預(yù)后較差,開發(fā)新的治療技術(shù)手段有利于提高卵巢癌患者總生存期[1]。卵巢癌的發(fā)病率和死亡率很高,部分原因是患者往往被診斷為晚期,嚴(yán)重影響了他們的生活質(zhì)量。值得慶幸的是,貝伐珠單抗已被發(fā)現(xiàn)可以與VEGF進(jìn)行結(jié)合,阻斷生物活性,減少腫瘤血管形成,抑制腫瘤生長(zhǎng)[9]。

在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)貝伐珠單抗以及聯(lián)合化療在體外和體內(nèi)誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡并降低細(xì)胞活力。另外,考慮到NF-κB/HIF-1α/VEGF通路在腫瘤發(fā)展中的促進(jìn)作用,我們進(jìn)一步研究了貝伐珠單抗以及聯(lián)合化療對(duì)卵巢癌細(xì)胞NF-κB、HIF-1α和VEGF表達(dá)的影響以及可能的分子機(jī)制,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),貝伐珠單抗聯(lián)合化療抑制卵巢癌的作用可能與NF-κB/HIF-1α/VEGF通路相關(guān)。

HIF-1α作為癌細(xì)胞缺氧轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子,該因子上調(diào)一系列支持腫瘤細(xì)胞的基因,以補(bǔ)償缺氧微環(huán)境[13]。有研究檢測(cè)了37例接受光動(dòng)力學(xué)療法(PDT)治療的早期食管癌中HIF-1α和HIF-2α的表達(dá),他們發(fā)現(xiàn)HIF-1α的高表達(dá)與光動(dòng)力學(xué)療法(PDT)的作用呈負(fù)相關(guān)。此外,他們對(duì)食管癌細(xì)胞作用的研究表明,缺氧誘導(dǎo)的HIF-1α過度表達(dá)通過血管生成減弱了PDT的療效[14]。VEGF是HIF-1α的下游靶基因,是最重要的血管生成蛋白之一。它與特定受體的結(jié)合可誘導(dǎo)靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移,改善血管通透性,最終促進(jìn)血管生成[15]。另外,有研究在乳腺癌小鼠中發(fā)現(xiàn)貝伐珠單抗介導(dǎo)的PDT誘導(dǎo)異二聚體HIF-1轉(zhuǎn)錄因子的HIF-1α亞單位表達(dá),并增加VEGF蛋白水平[16]。Ding等在裸鼠顱內(nèi)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤異種移植物上使用了抗VEGF的單克隆抗體,發(fā)現(xiàn)該抗體可以顯著增強(qiáng)PDT的作用[17]。所有這些研究表明,HIF-1α和VEGF的表達(dá)增加后可以誘導(dǎo)血管生成并減弱貝伐珠單抗療效。

NF-κB是一種調(diào)節(jié)各種細(xì)胞過程的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,包括胚胎發(fā)育、免疫、凋亡、血管生成和增殖。在活化之前,NF-κB蛋白主要通過與IκB家族成員結(jié)合而局限于胞漿[18]。IκB激酶對(duì)IκB-的磷酸化觸發(fā)Iκ-B的降解,并允許NF-κB移位到細(xì)胞核[19]。既往研究發(fā)現(xiàn),NF-κB過表達(dá)后增加了小鼠乳腺癌細(xì)胞的存活信號(hào),并加劇了小鼠RAW 264.7巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[20]。這些結(jié)果表明,抑制NF-κB可改善腫瘤發(fā)展惡化。腫瘤組織中NF-κB的表達(dá)與HIF-1α的表達(dá)、VEGF的表達(dá)以及血管侵犯的存在顯著相關(guān)。NF-κB抑制劑,如BAY11-7028,也可以可以抑制HIF-1α和VEGF表達(dá)。此外,此外,姜黃素類似物在胰腺癌中的抗血管生成作用的研究表明,姜黃素類似品EF31和UBS109可以抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄,在體內(nèi)誘導(dǎo)HIF-1α和VEGF的下調(diào)。然而,HIF-1α沉默后,細(xì)胞的NF-κB p65沒有變化。因此,我們猜想貝伐珠單抗以及聯(lián)合化療通過NF-κB/HIF-1α/VEGF信號(hào)通路抑制卵巢癌的發(fā)展。在本研究中,考慮到NF-κB/HIF-1α/VEGF通路在腫瘤發(fā)展中的促進(jìn)作用,通過貝伐珠單抗以及聯(lián)合化療藥物處理SKOV3細(xì)胞后,NF-κB p65蛋白表達(dá)被抑制,同時(shí)HIF-1α和VEGF的蛋白表達(dá)也受到抑制。另外,在裸鼠移植瘤的研究中發(fā)現(xiàn),貝伐珠單抗以及聯(lián)合化療藥物處理后,移植瘤的NF-κB p65蛋白表達(dá)被抑制,同時(shí)HIF-1α和VEGF的蛋白表達(dá)也受到抑制,這一研究結(jié)果證實(shí)了我們前面的猜想,貝伐珠單抗聯(lián)合化療抑制卵巢癌的作用可能與NF-κB/HIF-1α/VEGF通路相關(guān)。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn),貝伐珠單抗聯(lián)合化療方案能夠抑制卵巢癌的體內(nèi)外發(fā)展,該作用可能與抑制NF-κB/HIF-1α/VEGF信號(hào)通路相關(guān)。