阮先樂

摘要：為了篩選水稻在低溫脅迫下的關(guān)鍵基因，從GEO數(shù)據(jù)庫下載水稻4個數(shù)據(jù)集中的70個樣本。利用在線分析程序GEO2R進行共同差異表達基因分析，并對這些差異表達基因進行GO、KEGG分析，構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)，對關(guān)鍵基因構(gòu)建熱圖。結(jié)果表明，獲得共同差異表達基因51個，其中上調(diào)表達基因1個，下調(diào)表達基因50個。上述基因的GO分析結(jié)果表明，其細(xì)胞組成主要集中在細(xì)胞、細(xì)胞要素和細(xì)胞器上；在分子功能上，上述基因的功能主要集中在結(jié)合、催化活性上；在生物過程中，上述基因的功能主要集中在細(xì)胞過程、代謝過程和生物調(diào)控上。KEGG信號通路分析結(jié)果表明，上述基因主要參與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等通路。在構(gòu)建的共同差異表達基因的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)中，有29個節(jié)點。另外，得到10個關(guān)鍵基因、2個關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)。研究結(jié)果為進一步研究水稻低溫脅迫關(guān)鍵基因奠定了基礎(chǔ)，也有利于水稻低溫育種。

關(guān)鍵詞：水稻；GEO數(shù)據(jù)庫；低溫脅迫；共同差異表達基因；GO功能分析；KEGG信號通路分析

中圖分類號：S511.01；S126? 文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）03-0061-06

水稻（Oryza sativa L.）起源于熱帶與亞熱帶，是低溫敏感型作物。低溫嚴(yán)重影響了水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)，也限制了水稻向高海拔、高緯度地區(qū)擴展［1］。從全球范圍來看，目前有24個國家約1 500萬hm2的水稻受到低溫影響，在亞洲南部、東南部，約700萬hm2的土地由于受到低溫影響而無法種植水稻［2］。在我國的東北地區(qū)，由于緯度較高、溫度偏低，每3～5年就會發(fā)生1次冷害［3］。因此，培育耐冷水稻品種具有十分重要的現(xiàn)實意義。

植物的耐冷性是多基因效應(yīng)的，其機理復(fù)雜，而利用傳統(tǒng)育種方式在改良植物耐冷性方面有限制。如果采用基因工程技術(shù)進行作物育種，是提高植物耐冷性比較有效的途徑［4］。水稻與低溫脅迫相關(guān)的基因可以分2類：第1類是功能基因，其編碼產(chǎn)物在水稻受到低溫脅迫時直接起到保護作用；第2類是調(diào)控基因表達的信號因子［5］。閆凌月等研究發(fā)現(xiàn)，OsMADS25通過提高水稻在低溫脅迫下對活性氧的清除能力，進而提高其對低溫的耐受性［6］。Hur等研究發(fā)現(xiàn)，水稻中合成脯氨酸的關(guān)鍵基因OsP5CS2對提高水稻的耐冷性十分重要［7］。Li等研究發(fā)現(xiàn)，OsTPS1基因的超表達能夠提高轉(zhuǎn)基因水稻對干旱、鹽和低溫脅迫的耐受性［8］。陳能剛等研究發(fā)現(xiàn)，在孕穗期、開花期，轉(zhuǎn)異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因（isopentenyl transferase ipt）水稻的相對電導(dǎo)率的變化量和葉綠體受低溫的危害較?。?］。張明星構(gòu)建的OsWRKY63水稻突變體具有較強的耐冷性，為水稻耐冷品種的選育提供了潛在基因資源和中間育種材料［10］。Wang等研究發(fā)現(xiàn)，含有OsDREB1F基因的轉(zhuǎn)基因水稻對鹽、干旱和低溫的耐受性有所提高［11］。另有研究也發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子MYB、SNAC、TCP、PHD、bZIP與水稻的耐冷性有關(guān)［12-16］。

GEO數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）是一個公共功能基因組數(shù)據(jù)存儲庫，目前儲存了100多個物種的約十億個基因表達數(shù)據(jù)，科研人員借助基于WEB的工具，有效地探索、查詢和下載這些海量數(shù)據(jù)，從而更好地分析和設(shè)計自己的試驗。本研究采用生物信息學(xué)技術(shù)分析GEO數(shù)據(jù)庫中與水稻低溫脅迫相關(guān)的一些數(shù)據(jù)，篩選關(guān)鍵差異基因及其功能、信號通路，以期研究低溫脅迫對水稻生長發(fā)育影響的分子機制，從而為今后水稻耐冷性育種奠定良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 基因芯片數(shù)據(jù)的獲取與篩選

水稻低溫脅迫基因表達譜芯片數(shù)據(jù)來源于NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的GEO數(shù)據(jù)庫?；趯Λ@得的初始數(shù)據(jù)的分析與試驗要求，采用GSE6901、GSE31874、GSE37940和GSE71680共4個數(shù)據(jù)集，選擇其中70個樣本進行數(shù)據(jù)分析（表1）。試驗分析時間是2022年10—12月，地點在周口師范學(xué)院。

1.2 方法

1.2.1 共同差異表達基因的篩選 首先利用GEO數(shù)據(jù)庫中的在線分析程序GEO2R對不同數(shù)據(jù)集的處理組、對照組進行分析，并以P<0.05、|log2 FC|≥2作為差異表達基因篩選的標(biāo)準(zhǔn)。然后，利用Evenn（http：//www. ehbio.com/test/venn/#/）獲得4個數(shù)據(jù)集的共同差異表達基因。

1.2.2 共同差異表達基因的GO功能分析和KEGG信號通路分析 首先在UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org）中查詢各個共同差異表達基因的GO號，然后利用WEGO 2.0（https：//wego.genomics.cn/）進行共同差異表達基因的GO功能分析。KEGG信號通路分析利用DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）、KOBAS （http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/）2個在線網(wǎng)站。

1.2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 用STRING（https：//cn.string-db.org/）和Cytoscape 3.9.1軟件構(gòu)建共同差異表達基因的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，用Cytoscape 3.9.1 Cytohubba插件篩選關(guān)鍵基因，用Cytoscape 3.9.1 MCODE篩選關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果與分析

2.1 共同差異表達基因的篩選結(jié)果

利用4個數(shù)據(jù)集的70個樣本進行研究分析，按照規(guī)定的篩選標(biāo)準(zhǔn)，從GSE6901中獲得1 107個基因，從GSE31874中獲得2 537個基因，從GSE71680中獲得184個基因，從GSE37940中獲得498個基因。之后，經(jīng)Evenn在線分析，獲得51個共同差異表達基因 （圖1），其中上調(diào)表達基因1個，是AK108642，下調(diào)表達基因50個（表2）。

2.2 共同差異表達基因的GO功能分析和KEGG信號通路分析

對共同差異表達基因的GO分析結(jié)果（圖2）表明，細(xì)胞組成主要集中在細(xì)胞、細(xì)胞要素、細(xì)胞器上，分別達到41.2%、41.2%、35.3%。在分子功能上，這些基因的功能主要集中在結(jié)合、催化活性上，分別達到62.7%、31.4%。在生物過程中，這些基因的功能主要集中在細(xì)胞過程、代謝過程、生物調(diào)控上，分別達到49.0%、41.2%、39.2%。KEGG信號通路分析結(jié)果（表3、圖3）表明，這些差異表達基因主要參與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物病原相互作用、類胡蘿卜素生物合成、脂肪酸延伸、RNA降解和次生代謝產(chǎn)物的生物合成等通路中。

2.3 共同差異表達基因的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵基因的篩選

利用STRING數(shù)據(jù)庫與Cytoscape軟件對共同差異表達基因構(gòu)建蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，最終得到29個節(jié)點 （圖4-a）。另外，得到10個關(guān)鍵基因（圖4-b）、2個關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)（圖4-c、圖4-d）。這10個關(guān)鍵基因的熱圖見圖5。

3 討論和結(jié)論

本研究基于GPL2025、GPL7344等2個平臺上的4個數(shù)據(jù)集的70個樣本進行基因表達數(shù)據(jù)的分析。最終篩選出共同差異表達基因51個，其中上調(diào)表達的基因只有1個，下調(diào)表達的基因50個，并用Cytoscape 3.9.1 Cytohubba篩選出10個關(guān)鍵基因。

KEGG信號通路分析結(jié)果表明，植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程是一個主要的信號通路過程。脫落酸（ABA）是植物體內(nèi)一種多功能植物激素，植物在非生物脅迫下，其體內(nèi)的ABA含量通常會升高，從而可以增強植物應(yīng)對干旱、鹽、低溫等非生物脅迫的能力［17］。一些早期的研究結(jié)果表明，內(nèi)源性ABA的積累是植物對低溫脅迫的響應(yīng)［18-20］，另有研究證實，ABA處理能夠增強黃瓜、苜蓿的抗寒性［21-22］。在本研究中，植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑涉及AK107854、AK120087、AK070649等3個基因，這3個基因都與轉(zhuǎn)錄因子TIFY有關(guān)。幾乎所有的OsTIFY基因?qū)Ω珊怠Ⅺ}度和低溫等有一種或多種非生物脅迫有反應(yīng)［23］。徐佳寧的研究發(fā)現(xiàn)，幾乎所有蘋果MdUPL基因的表達都受到鹽、干旱或者低溫脅迫的誘導(dǎo)，尤其是MdUPL7、MdUPL9在低溫脅迫下表達量顯著上調(diào)［24］。Ca2+已經(jīng)被證明是植物冷脅迫的第二信使，而編碼CML的基因參與了冷脅迫誘導(dǎo)的Ca2+信號途徑［25］。Hu等研究發(fā)現(xiàn)，KCS與小麥的耐冷性有關(guān)［26］。YLS9（YELLOW-LEAF-SPECIFIC GENE 9）對ABA有響應(yīng)［27］。在擬南芥CBP60家族成員中，AtCBP60a、AtCBP60g、AtSARD1參與低溫誘導(dǎo)的水楊酸的合成［1］。Peres等研究發(fā)現(xiàn)，EL2編碼了一種新型植物CDK（cyclin-dependent protein kinase）抑制劑，將細(xì)胞周期進程與生物、非生物應(yīng)激反應(yīng)聯(lián)系起來，而非生物脅迫如低溫和干旱誘導(dǎo)了EL2 mRNA的表達［28］。

GO功能分析結(jié)果也表明，這些共同差異基因的功能主要集中在細(xì)胞過程、代謝過程和生物調(diào)控上。利用Cytoscape 3.9.1-MCODE篩選得到2個關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)，這2個關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)所涉及的7個基因都屬于重點關(guān)注的10個關(guān)鍵基因。結(jié)合以上分析，在水稻的耐冷育種中，可以重點考慮上面提到的10個關(guān)鍵基因。本研究為水稻的耐冷育種提供了一定的理論依據(jù)，奠定了良好的基礎(chǔ)。

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