趙佳明，付英杰，羅曾源，席 輝，盧斌斌，張 帥，陳帥偉，王增瑜，宗永立，李 軍*，孫世豪*

1. 中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2 號 450001

2. 山東中煙工業(yè)有限責任公司技術中心，濟南市歷下區(qū)經(jīng)十路11888 號 250014

消費風味產(chǎn)品時，風味成分從產(chǎn)品（固體、液體或凝膠）中釋放出來，為消費者所感知［1］。消費者感受到風味產(chǎn)品的風味特征并非產(chǎn)品中所含風味成分的簡單加和，而是消費過程中風味成分釋放特征的綜合體現(xiàn)，這不僅受產(chǎn)品中風味成分濃度和理化性質(zhì)的影響，也取決于構成產(chǎn)品主體的其他化學物質(zhì)（如水、糖、有機酸和蛋白質(zhì)等），即基質(zhì)成分［2］。產(chǎn)品中風味成分的種類差異及其從基質(zhì)中釋放的行為差異共同塑造了差異化和特征化的產(chǎn)品風味。因此，在特定的基質(zhì)背景下，闡述風味成分的釋放行為特征對于產(chǎn)品風味的調(diào)控和風格塑造具有理論支撐意義和實際應用價值。卷煙是一種特殊的嗜好型風味產(chǎn)品，為了使消費者得到更加舒適的感官體驗，通常會在卷煙中添加一些風味物質(zhì)以改善和豐富卷煙香味和吃味特征，掩蓋雜氣，減少刺激性，或者賦予煙氣某些特征香氣，達到塑造產(chǎn)品風格特征的目的。因此，闡明風味成分在卷煙釋放過程中的行為差異，可對今后更加科學合理地使用單體香料提供技術支撐。為了探明單體香料在卷煙中的釋放規(guī)律，研究人員對不同種類煙用單體香料在煙草基質(zhì)（卷煙、加熱卷煙）中的轉移行為進行了深入的研究［3-4］，通過考察酯類單體香料在煙支內(nèi)部（煙絲、濾嘴）的持留率、遷移率［5-8］以及酯類單體香料在煙氣中的轉移率［9-11］嘗試揭示其在卷煙中的轉移規(guī)律。風味成分的遷移率/轉移率反映的是煙氣中風味成分的最終釋放結果，對于卷煙加香有很大的指導意義；但無論是單體香料在煙氣中的總轉移率還是逐口轉移率，均是單體香料由煙草基質(zhì)中釋放到氣相并轉移進入煙氣，再經(jīng)歷冷凝吸附和截留［12-13］等作用，最終在煙氣中呈現(xiàn)，其體現(xiàn)的是風味成分最終釋放的累積結果，對風味成分在卷煙中的釋放行為差異解釋較為有限。

固-氣分配系數(shù)（K）定義為分析物在固相中或固相上的濃度與其在氣相中質(zhì)量濃度的平衡比［14］。固-氣分配系數(shù)能很好地反映分析物在固相或氣相中的分配釋放能力，是許多應用中的重要參數(shù)，例如，表征食品中風味成分釋放能力大小的參數(shù)，用于香氣釋放研究［15-16］；評估包裝材料的安全性能，以盡量減少揮發(fā)性有機化合物（VOCs）的釋放［17］。此前，分配系數(shù)的測定大多處于液體體系當中，其他固相體系中所使用的微量點滴法［18］也不適用于煙草基質(zhì)中單體香料分配系數(shù)的測定。因此，開發(fā)準確可靠的方法測定煙草基質(zhì)中目標化合物的固-氣分配系數(shù)很重要。基于此，本研究中以6 種酯類單體香料為研究對象，建立了適用于煙草基質(zhì)中單體香料固-氣分配系數(shù)的檢測方法，旨在為煙草基質(zhì)中單體香料釋放行為研究提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

云南玉溪產(chǎn)C3F等級煙葉切后煙絲樣品。

乙酸丁酯、乙酸戊酯（≥99%，阿拉丁生化科技股份有限公司）；乙酸異戊酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、異戊酸乙酯（≥99%，梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司）；無水乙醇（色譜純，德國Merck 公司）。其理化性質(zhì)見表1。

表1 香氣化合物的理化性質(zhì)Tab.1 Physicochemical properties of the studied aroma compounds

O37-醫(yī)用喉頭噴霧器（江蘇平安醫(yī)療器械有限公司）；CP224S 型電子天平（感量0.000 1 g，德國Sartious 公司）；Lab Dancer 渦旋振蕩器（德國IKA 公司）；8890/5977B 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent 公司）；MPS robotic 多功能進樣平臺（德國Gerstel公司）。

1.2 方法

1.2.1 改變相比法測定理論

分配系數(shù)（K）表示一種揮發(fā)性化合物在熱力學平衡時在固相（Cs）與氣相（Cg）中的質(zhì)量濃度之比：

式中：K為熱力學平衡狀態(tài)下香氣化合物的分配系數(shù)，Cs為平衡時香氣化合物在固相（煙絲）中的質(zhì)量濃度，g/cm3；Cg為平衡時香氣化合物在氣相中的質(zhì)量濃度，g/cm3。

兩相間的質(zhì)量濃度也可以描述為

式中：ms為平衡時香氣化合物在固相中的質(zhì)量，g；mg為平衡時香氣化合物在氣相的質(zhì)量，g。

因此，聯(lián)立公式（1）、（2）和（3）可得公式（4）。

式中：β為頂空瓶中氣相（Vg）與固相（Vs）的體積之比。

式中：Cs*為頂空瓶內(nèi)煙絲中香氣化合物的初始質(zhì)量濃度，g/cm3。聯(lián)立公式（3），可以表示為

公式（10）最初由Ettre 等［19］建立，等式兩邊取倒數(shù)，得公式（11）：

在頂空分析時，色譜峰面積與頂空氣相中的平衡濃度成比例，見公式（12）：

式中：A為頂空瓶內(nèi)待測化合物在給定溫度下達到熱力學平衡時色譜峰的面積，fi為檢測器的響應系數(shù)。聯(lián)立公式（11）與（12）可得：

式中：a=K/（fi·Cs*），b=1/（fi·Cs*）。

1.2.2 加香煙絲及頂空分析樣品制備

加香煙絲樣品：將未添加任何香料的云南C3F切后煙絲過孔徑0.250 mm（60 目）篩除雜，過濾掉煙絲廢渣、煙末和梗簽，放置在（22±1）℃，相對濕度60%±3%的恒溫恒濕箱中平衡48 h 以上。稱取50 g平衡后的煙絲，按其質(zhì)量的0.01%稱取1.1 節(jié)中所選用的6 種酯類單體香料，以8 mL 無水乙醇稀釋后，用醫(yī)用喉頭噴霧器均勻地噴灑在煙絲表面，加香過程中保持翻動以保證加香均勻，將制備好的加香煙絲樣品置密封袋中保存48 h。

頂空分析樣品：將不同質(zhì)量的加香煙絲分別放入20 mL 頂空瓶中，密封后放入MPS 多功能進樣平臺，由全自動進樣器置于孵化器中，孵化平衡條件：60 ℃，240 min；65 ℃，240 min；70 ℃，120 min；75 ℃，120 min；80 ℃，90 min；90 ℃，90 min；100 ℃，45 min；110 ℃，45 min。

將制備好的樣品進行HS-GC-MS 分析。分析條件：

MPS多功能進樣平臺條件：

孵化器分別在60、65、70、75、80、90、100、110 ℃下孵化；自動進樣平臺氣密針注射溫度：70～120 ℃（氣密針溫度設定高于孵化溫度10 ℃）；氣密針填充速率：250 μL/s；氣體注射速率：250 μL/s；進樣量：1 000 μL。

色譜條件：

色譜柱：DB-5MS（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣：氦氣；進樣模式：分流進樣；分流比：10∶1；進樣口溫度：250 ℃；程序升溫：50 ℃（7 min）250 ℃（1 min）；傳輸線溫度：280 ℃；EI 離子源溫度：230 ℃；電離能量：70 eV；四極桿溫度：150 ℃；掃描模式：選擇離子監(jiān)測；質(zhì)量掃描范圍：30～350 amu；溶劑延遲：5 min。

1.2.3 加香煙絲堆積密度測定［20］與β計算

稱取20 mL 頂空瓶的質(zhì)量，記為m0。使用稱量紙和鑷子將加香后煙絲置于20 mL頂空瓶中，并手持頂空瓶在桌面上振動10 次，輔助使用渦旋振蕩器振蕩頂空瓶，使煙絲自由堆積密實，直至煙絲在頂空瓶瓶口處的高度不再變化。稱取20 mL 頂空瓶與填充后煙絲的總質(zhì)量，記為m1，煙絲的堆積密度（ρ，g/mL）按照公式（16）計算：

式中：VL表示頂空瓶體積，cm-3；VS表示頂空瓶中煙絲基質(zhì)的體積，cm-3。

測定煙絲堆積密度，從而確定頂空瓶中所加入不同質(zhì)量比煙絲對應的氣-固兩相體積比β。使用同一批次加香后煙絲重復5 次實驗，測得其平均堆積密度為0.15 g/cm3，RSD為2.61%。在體積為20 mL 的5 個頂空瓶中分別加入0.15、0.30、0.45、0.60 和0.75 g 的煙絲（對應的β值分別為19.00、9.00、5.67、4.00和3.00）。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 2019 軟件對β與色譜峰面積倒數(shù)（1/A）進行線性回歸分析。

2 結果與討論

2.1 基于改變相比法的分配系數(shù)測定方法建立

將不同體積的待測煙絲分別放入5 個頂空瓶中密封，用HS-GC-MS 法分別測定每個樣品，因為每個樣品中待測成分是相同的，且處于同一溫度下，所以其分配系數(shù)相同。同時，因為每個相熱力學系統(tǒng)是相同的，所以聯(lián)立幾次獨立的頂空檢測結果就可以計算出Kcut/air值。此外，分配系數(shù)的測定受溫度、β、平衡時間和基質(zhì)體系作用力等多方面的影響；其中，β與平衡時間對方法精確度的影響很大，因此需要對β與平衡時間兩個實驗條件進行優(yōu)化，提高測定方法的準確度。

2.1.1 頂空固相體積優(yōu)化

采用改變相比法測定分配系數(shù)時，需要待測化合物處于熱力學平衡狀態(tài)下，測定每一個β值下所對應的化合物色譜峰面積。β的選擇對方法的精確度有很大影響，當體積比過小或過大時，均無法得到準確的分配系數(shù)Kcut/air值［21-22］。如圖1 所示，在添加1.00 g 煙絲時，煙絲占據(jù)了頂空瓶較大的體積，氣密針在扎取采樣時存在與煙絲接觸的現(xiàn)象，導致氣密針吸取體積小于設定體積，色譜峰面積（對應的β值為2.00）小于添加0.80 g（對應的β值為2.75）煙絲時的色譜峰面積。本研究中通過優(yōu)化β實驗得到了結論：在測定煙絲基質(zhì)中酯類單體香料在固-氣兩相間的分配系數(shù)時，應避免出現(xiàn)固相體積過大導致氣密針與煙絲基質(zhì)接觸的情況，選擇β值在3.00～19.00 范圍內(nèi)較為合適。

圖1 60 ℃條件下β優(yōu)化前后異戊酸乙酯所對應的色譜峰面積Fig.1 Chromatographic peak areas corresponding to ethyl isovalerate before and after optimized β values at 60 ℃

2.1.2 頂空平衡溫度選擇及平衡孵化時間優(yōu)化

頂空平衡溫度可選擇范圍為30～200 ℃，但是當平衡溫度過高時，會破壞原有基質(zhì)結構，從而影響加香成分在固-氣兩相間的分配。低碳酯類單體香料熱穩(wěn)定性相對較低，處于煙支冷凝區(qū)較低溫度時，就已經(jīng)開始釋放。此外，溫度較高時其分子活動劇烈，不同酯類單體香料間釋放差異較不明顯。因此，選擇處于冷凝區(qū)溫度區(qū)間的60～110 ℃平衡溫度作為實驗溫度，其中，90、100、110 ℃作為分配系數(shù)測定的外推溫度。

為了保證加香成分在設定溫度下達到固-氣兩相間分配平衡，在60～110 ℃內(nèi)考察平衡孵化時間對煙絲中6 種低碳酯類加香成分豐度的影響［23］，結果如圖2 所示。由圖2a 可知，隨著平衡孵化時間增加，6 種酯類單體香料在60 ℃條件下的色譜峰面積不斷增加；當平衡孵化時間大于240 min 時，色譜峰面積趨近于穩(wěn)定。圖2b 中6 種酯類單體香料在70 ℃條件下于120 min 時基本達到平衡狀態(tài)。圖2c、2d 表明，在80、100 ℃條件下，6 種酯類單體香料分別在90、45 min時達到平衡。因此，選擇240 min作為60、65 ℃條件下的平衡孵化時間；選擇120 min 作為70、75 ℃的平衡孵化時間；選擇90 min 作為80、90 ℃的平衡孵化時間；選擇45 min 作為100、110 ℃的平衡孵化時間。

圖2 不同溫度下頂空平衡孵化時間對目標物色譜峰面積的影響Fig.2 Effects of headspace equilibrium incubation time at different temperatures on chromatographic peak areas of the target compounds

2.1.3 分配系數(shù)Kcut/air測定方法評價

采用HS-GC-MS 法逐個測定每個待測樣品的頂空平衡色譜峰面積，結果見圖3。通過繪制色譜峰面積倒數(shù)（1/A）與β的曲線得到線性回歸方程，結果見圖4。以異戊酸乙酯為例，將線性方程中的截距（a）與斜率（b），按照k=a/b計算得到其在煙絲基質(zhì)中的固-氣分配系數(shù)Kcut/air。

圖3 不同β值所對應的異戊酸乙酯色譜峰面積Fig.3 Peak areas of ethyl isovalerate corresponding to different β values

以β為自變量（X），色譜峰面積倒數(shù)（1/A）為因變量（Y），進行線性回歸分析，得線性回歸方程和相關系數(shù)（R2），并計算5 次重復實驗的相對標準偏差（RSD），結果見表2。

表2 6種酯類單體香料在不同溫度條件下的線性回歸方程、相關系數(shù)（R2）Tab.2 Linear regression equations and correlation coefficients（R2）of six monomer ester flavors at different temperatures

根據(jù)文獻［24-25］報道，基于改變相比（Phase ratio variation，PRV）方法，利用PRV-HS-GS-MS 檢測溶液基質(zhì)中化合物的分配系數(shù)時，色譜峰面積倒數(shù)與β的線性回歸方程的相關系數(shù)（R2）均大于等于0.990。由表2 可知，在60～110 ℃條件下，6 種酯類單體香料方程線性關系良好，R2≥0.991，RSD為0.92%～9.14%。表明該方法重復性較好，適用于煙絲等固相基質(zhì)中酯類香料分配系數(shù)的測定。

2.2 煙絲基質(zhì)中單體香料的分配系數(shù)分析

2.2.1 酯類單體香料的分配系數(shù)與溫度的關系

溫度對煙絲中酯類單體香料釋放的影響如表3 所示?？芍?，總的趨勢是，隨著溫度的升高，Kcut/air值逐漸減小。這表明隨著溫度的升高，單體香料與煙絲基質(zhì)的吸附結合作用變?nèi)酰懔系尼尫判袨樵鰪?，在氣相中的分配增加。進一步分析互為同系物、同分異構體的香料單體的分配系數(shù)可知，互為碳鏈異構的異戊酸乙酯與乙酸異戊酯，乙酸異戊酯分子的對稱性更好，色散力較大，具有較高的結構穩(wěn)定性，其分配系數(shù)也更大。此外，分配系數(shù)的大小不僅與化合物自身的結構有關，也與基質(zhì)有關［26-27］。在65 ℃時乙酸丁酯、乙酸異戊酯與異戊酸乙酯的分配系數(shù)以及100 ℃時丁酸乙酯與異戊酸乙酯的分配系數(shù)較為接近，此時，酯類單體香料與煙絲基質(zhì)之間的作用力可能是主要的決定因素。

表3 6種酯類單體香料的Kcut/air值Tab.3 Kcut/air values of six monomer ester flavors

繪制lnK和熱力學溫度倒數(shù)（1/Tabs）之間的回歸曲線，如圖5 所示，可以發(fā)現(xiàn)lnK和1/Tabs間基本呈線性關系。因此，可以描述為公式（18），在公式（18）中a"和b"是回歸系數(shù)，斜率（b"）是反映分析物分配系數(shù)與溫度關系的直接系數(shù)。此外，lnK與1/Tabs之間的線性關系也可以檢驗分配系數(shù)數(shù)據(jù)的準確性［28］，即lnK-1/Tabs回歸曲線的R2>0.9 時，可證明分配系數(shù)測定結果的準確性。雖然從乙酸丁酯和異戊酸乙酯的回歸曲線上能觀察到存在輕微曲率，但在研究范圍內(nèi)的線性關系（如相關系數(shù)所示）仍然良好，這也意味著，在本研究中的溫度條件下測定的6 種酯類單體香料的固-氣分配系數(shù)，在合理范圍內(nèi)可以外推至其他溫度范圍，尤其是高于頂空最高溫度（200 ℃）的溫度范圍［25］。

圖5 6種酯類單體香料Kcut/air的對數(shù)值與熱力學溫度倒數(shù)的線性回歸分析結果Fig.5 Results of linear regression analysis of Kcut/air logarithmic values and thermodynamic temperature reciprocals for six monomer ester flavors

式中：a"和b"為回歸方程回歸系數(shù)，a"為截距，b"為斜率。

2.2.2 酯類單體香料的分配系數(shù)與釋放預測

酯類單體香料分配系數(shù)的大小對應了在該溫度下酯類單體香料由煙絲基質(zhì)釋放到氣相過程中能力的大小，將lnK和1/Tabs的回歸曲線作為預測方程，以90、100 和110 ℃（對應圖中溫度倒數(shù)絕對值2.75×10-3、2.68×10-3、2.61×10-3K-1）作為外推溫度進行預測，結果如表4、圖6 所示。從圖6 可以看出，6 種酯類單體香料分配系數(shù)的實際測定值與預測值相對誤差不大，預測擬合程度較好。6 種酯類單體香料在90、100 和110 ℃下分配系數(shù)的實際值與預測值的平均相對誤差在1.04%～5.32%范圍內(nèi)，預測效果較好，可為實驗溫度區(qū)域之外的分配系數(shù)測定提供一定的數(shù)據(jù)支持。

圖6 6種酯類單體香料Kcut/air對數(shù)值的預測方程Fig.6 Prediction equations for Kcut/air logarithmic values of six monomer ester flavors

表4 6種酯類單體香料在不同溫度下的Kcut/air實際值和Kcut/air預測值及其平均相對誤差（AE）Tab.4 Actual and predicted Kcut/air values and average relative errors of six monomer ester flavors at different temperatures

此外，有研究表明，疏水性香氣化合物在油溶液中的油-氣分配系數(shù)在設定溫度下可以準確地預測香氣化合物的釋放速率（μg/s）［29］。目前，關于分配系數(shù)的研究多是基于恒定的低溫度場體系下進行的［30］，而煙草基質(zhì)中單體香料的釋放往往涉及溫度的變化，Kcut/air值反映的是對應溫度下該單體香料從煙草基質(zhì)釋放到氣相中的能力，對于溫度變化過程中單體香料的動態(tài)釋放的預測存在一定局限性。若假設煙支中煙絲升溫是與時間（t）相關的函數(shù)，如公式（19）所示：

式中：t為時間，s；φ（t）表示時間的函數(shù)；f 為常數(shù)參數(shù)。

則lnK和1/T線性回歸方程的斜率（b"）從一定程度上可解釋煙絲基質(zhì)中酯類單體香料在溫度變化過程中的釋放行為差異，以及預測其在動態(tài)釋放過程的釋放行為差異。

3 結論

（1）建立了煙草基質(zhì)中單體香料分配系數(shù)測定的改變相比-頂空-氣質(zhì)聯(lián)用法（PRV-HS-GC-MS）法。該方法操作簡便、重復性好，可實現(xiàn)對煙草基質(zhì)中單體香料分配系數(shù)（Kcut/air）值的快速和準確檢測。

（2）在60～110 ℃條件下，6 種酯類單體香料Kcut/air值的RSD值為0.92%～9.14%，Kcut/air值與溫度呈負相關關系。

（3）建立了6 種酯類單體香料的Kcut/air預測方程，在90～110 ℃條件下Kcut/air的實際測定值與預測值平均相對誤差在1.04%～5.32%范圍內(nèi)，預測效果較好，可實現(xiàn)直接測量困難或在難以測量的較高溫度下預測分配系數(shù)。