黎龍香， 鄭康樂， 王學(xué)明

（江西科睿藥業(yè)有限公司， 江西 贛州 341000）

磷酸特地唑胺（tedizolid phosphate）是一種新型噁唑烷酮類抗生素，屬于前藥，通過在體內(nèi)水解釋放出特地唑胺發(fā)揮抗菌作用[1]。 磷酸特地唑胺是由Cubist Pharmaceuticals LLC 公司開發(fā)，于2014 年6 月20 日獲得FDA 批準(zhǔn)上市[2]。 臨床上用于革蘭氏陽性菌所致的急性細(xì)菌性皮膚和皮膚組織感染（ABSSSI）。 與已上市藥物利奈唑酮相比， 磷酸特地唑胺對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌等耐藥菌的活性大幅度提高[3]。

江西科睿藥業(yè)有限公司注射用磷酸特地唑胺于2023 年4 月獲得中華人民共和國國家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）批準(zhǔn)生產(chǎn)。 TDZA010、TDZA046 是由磷酸特地唑胺中間體、起始物料與三氯氧磷反應(yīng)生成，均具有鹵代烷烴致癌警示結(jié)構(gòu)[4]，雜質(zhì)信息見表1。

表1 磷酸特地唑胺基因毒性雜質(zhì)信息Tab. 1 Genotoxic impurities information of tedizolid phosphate

表2 洗脫程序Tab. 2 Elution procedure

參照ICH M7 《評估和控制藥物中DNA 反應(yīng)性（致突變）雜質(zhì)以限制潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)》中基于TTC 的可接受攝入量1.5 μg/d[5]被視為具有保護(hù)作用的終生每日暴露量。 這就允許致突變雜質(zhì)的日攝入量可以高于終生暴露時(shí)的情況，而其風(fēng)險(xiǎn)水平仍與每日或非每日治療方案相持平。 磷酸特地唑胺每天最大使用劑量為200 mg，治療周期不超過一年?；诜墙K生暴露（LTL）原則：治療期1～12 個(gè)月時(shí)，潛在基因毒性的每日可接受攝入量為20 μg/d。 計(jì)算得到TDZA010、TDZA046 的控制限度為不得超過100×10-6（20 μg/d/（200 mg/d）=100×10-6）。

目前，僅查詢到姚松梅[6]建立了高效液相色譜法（HPLC）測定磷酸特地唑胺原料藥中有關(guān)物質(zhì)TDZA010 的分析方法， 該方法TDZA010 定量限均為45 ng·mL-1，運(yùn)行時(shí)間為60 min；未見對磷酸特地唑胺中基因毒性雜質(zhì)TDZA046 分析方法的研究報(bào)道。 為保證本品臨床用藥的安全性，本文建立一種同時(shí)測定磷酸特地唑胺中基因毒性雜質(zhì)TDZA010、TDZA046 的質(zhì)譜定量測定方法，并參照《中國藥典》2020 年版四部通則9101[7]和ICH Q2[8]要求進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

Agilent 1260 高效液相色譜儀（安捷倫公司）；Agilent G6125C（安捷倫公司）；Waters XEVO G2-XS Qtof （沃特世公司）；XPE 105 DR 電子天平（梅特勒-托利多公司）。

1.1.2 試劑

TDZA010 對照品（自制，批號：1920343304，含量98.8%）；TDZA046 對照品 （自制， 批號：1920421002，含量99.6%）；磷酸特地唑胺（自制，批號：20201103、20201223、20201227、20210105）。

乙酸銨（色譜純，山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司）；氨水（色譜純，廣東光華科技股份有限公司）；乙腈（質(zhì)譜純，F(xiàn)isher 公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱為Waters Acquity BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；以20 mmol 醋酸銨溶液（取醋酸銨1.54 g，加水1000 mL 使其溶解，用氨水調(diào)節(jié)pH 至8.0）為流動相A，以乙腈為流動相B，按表1 進(jìn)行線性梯度洗脫； 柱溫為40 ℃； 流速為0.4 mL·min-1；進(jìn)樣體積為10 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件

采用ESI 離子源正離子模式， 毛細(xì)管電壓：4000 V；氣體溫度：300 ℃；氣體流速：11.0 L·min-1；噴霧器壓力：1.0×105Pa；裂解電壓：135 V。

1.2.3 電噴霧離子化掃描圖

電噴霧離子化正離子掃描檢測條件下，分別以TDZA010、TDZA046 的[M+H]+質(zhì)荷比為m/z =389.1 及m/z= 310.0 作為定量離子（圖1） 。

圖1 TDZA010、TDZA046 質(zhì)譜圖Fig. 1 Mass spectrogram of TDZA010、TDZA046

1.2.4 溶液配制

空白溶液/溶劑：流動相A。

對照品儲備1 溶液： 取TDZA010 對照品、TDZA046 對照品各約10 mg，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，加溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻。

對照品儲備2 溶液： 精密量取對照品儲備1溶液1 mL，置于20 mL 容量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻。

對照品溶液：精密量取對照品儲備2 溶液1 mL，置于25 mL 容量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻。

供試品溶液：取磷酸特地唑胺約50 mg，精密稱定，置于25 mL 容量瓶中，加溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻。

供試品加標(biāo)溶液：取磷酸特地唑胺約50 mg，精密稱定，置于25 mL 容量瓶中，加對照品溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻。

2 結(jié)果與討論

2.1 測定條件的選擇

2.1.1 質(zhì)譜條件的選擇

由于使用的質(zhì)譜儀為單四級桿質(zhì)譜儀，只能使用SIM 模式進(jìn)行定量檢測， 在電子噴霧源ESI正離子模式下可得到TDZA010 加氫峰m/z 389.1，TDZA046 加氫峰m/z 310.1， 因此確定m/z 389.1、m/z 310.1 為定量離子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 溶劑及流動相A 的選擇

由于磷酸特地唑胺在中性、 酸性溶液中難溶，僅在堿性溶液中易溶，所以考慮堿性水溶液作為溶劑，但質(zhì)譜采用的是ESI 正離子模式，堿性過強(qiáng)會抑制化合物的電離從而影響方法的靈敏度，因此選擇弱堿性pH=8.0 的20 mmol 乙酸銨溶液作為溶劑及流動相A。

2.1.3 色譜柱的選擇

由于本實(shí)驗(yàn)中供試品溶液濃度較大，TDZA010、TDZA046 與磷酸特地唑胺需完全分離，以保證方法的回收率符合要求。 通過考察不同規(guī)格的色譜柱， 最終確定Waters Acquity BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱進(jìn)行本次研究，該色譜柱可以滿足分離度要求并快速分析。

2.2 專屬性

分別取1.2.4 項(xiàng)下空白溶液、 對照品溶液、供試品溶液及供試品加標(biāo)溶液， 按擬定條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果見圖2 及表3。 結(jié)果表明，基因毒性雜質(zhì)TDZA010、TDZA046 的保留時(shí)間分別為6.8 min、7.9 min 左右， 空白溶液和供試品溶液不干擾TDZA010、TDZA046，表明方法專屬性良好。

圖2 供試品加標(biāo)溶液色譜圖Fig. 2 Chromatogram of sample spiking solution

表3 供試品加標(biāo)溶液結(jié)果Tab. 3 Results of sample spiking solution

2.3 系統(tǒng)精密度

取1.2.4 項(xiàng)下對照品溶液按擬定條件連續(xù)進(jìn)樣6 次， 記錄色譜圖， 結(jié)果見表4。 表4 表明，TDZA010、TDZA046 保留時(shí)間的RSD 均為0.1%，峰面積RSD 分別為0.5%、1.6%，表明方法系統(tǒng)精密度良好。

表4 系統(tǒng)精密度結(jié)果Tab. 4 Results of system precision

2.4 檢測限與定量限

取1.2.4 項(xiàng)下對照品溶液， 用溶劑逐級稀釋，按擬定條件進(jìn)樣檢測，記錄色譜圖，信噪比S/N 約為3 作為檢測限溶液, 信噪比S/N 約為10 作為定量限溶液。 結(jié)果表明，TDZA010、TDZA046 檢測限均為1 ng·mL-1，定量限均為3 ng·mL-1，表明方法靈敏度高。

2.5 線性與范圍

線性考察溶液-1（限度的30%）：取1.2.4 項(xiàng)下對照品儲備2 溶液0.3 mL，置于25 mL 容量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻。

線性考察溶液-2（限度的50%）：取1.2.4 項(xiàng)下對照品儲備2 溶液0.5 mL，置于25 mL 容量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻。

線性考察溶液-3（限度的80%）：取1.2.4 項(xiàng)下對照品儲備2 溶液0.8 mL，置于25 mL 容量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻。

線性考察溶液-4（限度的100%）：取1.2.4 項(xiàng)下對照品儲備2 溶液1.0 mL，置于25 mL 容量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻。

線性考察溶液-5（限度的120%）：取1.2.4 項(xiàng)下對照品儲備2 溶液1.2 mL，置于25 mL 容量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻。

線性考察溶液-6（限度的150%）：取1.2.4 項(xiàng)下對照品儲備2 溶液1.5 mL，置于25 mL 容量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻。

取上述線性系列溶液， 按擬定條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以最小二乘法進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表5。 結(jié)果表明，TDZA010、TDZA046 在限度的30%～150%范圍內(nèi)線性關(guān)系良好， 皮爾遜相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.99。

表5 線性與范圍考察結(jié)果Tab. 5 Results of linearity and range

2.6 準(zhǔn)確度

回收率考察溶液-1（限度的80%）：取磷酸特地唑胺約50 mg，精密稱定，分別置于25 mL 容量瓶中，精密加入1.2.4 項(xiàng)下對照品儲備2 溶液0.8 mL，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，平行配制3 份。

回收率考察溶液-2（限度的100%）：取磷酸特地唑胺約50 mg，精密稱定，分別置于25 mL 容量瓶中， 精密加入1.2.4 項(xiàng)下對照品儲備2 溶液1.0 mL，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，平行配制6 份。

回收率考察溶液-3（限度的150%）：取磷酸特地唑胺約50 mg，精密稱定，分別置于25 mL 容量瓶中， 精密加入1.2.4 項(xiàng)下對照品儲備2 溶液1.5 mL，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，平行配制3 份。

按1.2.4 項(xiàng)下方法配制對照品溶液及供試品溶液，取上述溶液按擬定條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算回收率及回收率RSD（n=12），結(jié)果見表6、表7。 表6、表7 結(jié)果表明，TDZA010 回收率在89.8%～105.3%之間，TDZA046 回收率在90.3%～102.5%之間，RSD 分別為5.3%、4.6%，表明方法回收率良好。

表6 TDZA010 回收率考察結(jié)果Tab. 6 Results of TDZA010 recovery

表7 TDZA046 回收率考察結(jié)果Tab. 7 Results of TDZA046 recovery

2.7 重復(fù)性

取6 份2.6 項(xiàng)下回收率考察溶液-2。 按擬定條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算6 份回收率，考察溶液中TDZA010、TDZA046 檢測結(jié)果的RSD， 結(jié)果見表8。 結(jié)果表明，6 份考察溶液TDZA010、TDZA046 的重復(fù)性RSD 分別為0.4%、3.3%，表明方法重復(fù)性良好。

表8 重復(fù)性考察結(jié)果Tab.8 Results of repeatability

2.8 耐用性

按1.2.4 項(xiàng)下溶液配制方法配制空白溶液、對照品溶液、供試品溶液、供試品加標(biāo)溶液，微小改變色譜條件或者質(zhì)譜條件參數(shù)，耐用性考察的條件如下：

柱流速-1： 僅將1.2.1 色譜條件流速改為0.41 mL·min-1；

柱溫-1：僅將1.2.1 色譜條件柱溫改為39 ℃；

柱溫-2：僅將1.2.1 色譜條件柱溫改為41 ℃；

毛細(xì)管電壓-1： 僅將2.1.2 質(zhì)譜條件毛細(xì)管電壓改為3950 V；

毛細(xì)管電壓-2： 僅將1.2.2 質(zhì)譜條件毛細(xì)管電壓改為4050 V。

取空白溶液、對照品溶液、供試品溶液、供試品加標(biāo)溶液按上述各改變條件測試， 記錄色譜圖， 計(jì)算正常條件和微調(diào)參數(shù)后TDZA010、TDZA046 回收率及回收率RSD，考察結(jié)果見表9。結(jié)果表明，TDZA010 耐用性檢測結(jié)果回收率在92.1%～97.0%之間，TDZA046 耐用性檢測結(jié)果回收率在81.9%～89.2%之間， 回收率RSD 分別為0.1%、3.0%，表明方法的耐用良好。

表9 耐用性考察結(jié)果Tab.9 Results of robustness

2.9 樣品測定

取3 批工藝驗(yàn)證磷酸特地唑胺樣品 （批號：20201223、20201227、20210105）， 按1.2.4 項(xiàng)下溶液配制方法配制對照品溶液、供試品溶液。 取上述對照品溶液、 供試品溶液按擬定條件進(jìn)樣，記錄色譜圖， 按外標(biāo)法計(jì)算TDZA010、TDZA046 的含量，樣品測定結(jié)果見表10。表10 表明，3 批磷酸特地唑胺中只有2 批樣品檢出TDZA010，但遠(yuǎn)小于擬定控制限度，TDZA046 均未檢出。 為保證產(chǎn)品質(zhì)量， 將TDZA010、TDZA046 訂入磷酸特地唑胺放行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行周期性檢測。

表10 樣品測定結(jié)果Tab.10 Results of sample determination

3 結(jié)論

本研究建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用方法同時(shí)測定磷酸特地唑胺中基因毒性雜質(zhì)TDZA010、TDZA046 的含量，該方法精密度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確，可為后期測定該類生產(chǎn)工藝的磷酸特地唑胺鹵代烷烴類基因毒性雜質(zhì)含量提供參考。