鄭璐璐 ，王 敏 ，武玉玉 ，劉開鑫 ，崔茂盛

（1.天津農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300380；2.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381）

雙酚A（BPA）是環(huán)境中內(nèi)分泌干擾物（EDCs）之一，在食品包裝、個人護理用品、收銀機收據(jù)和醫(yī)療設(shè)備中隨處可見，對機體產(chǎn)生負(fù)面影響。BPA作為一種弱外源性雌激素，能夠結(jié)合經(jīng)典的核雌激素受體ERα和ERβ并激活它們，這種激活會干擾正常的激素信號傳導(dǎo)，影響卵巢功能和卵泡發(fā)育，從而導(dǎo)致月經(jīng)周期不穩(wěn)定和生殖問題。BPA還會干擾子宮內(nèi)膜的正常發(fā)育和增殖，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜異位癥、不孕癥和胚胎著床等問題，對雌性生殖系統(tǒng)產(chǎn)生嚴(yán)重的毒性影響。到目前為止，BPA已經(jīng)在水生環(huán)境、污水、自來水、土壤、灰塵和空氣中被檢測到，對人類和動物都構(gòu)成了威脅。

褪黑素（M T）是一種吲哚胺，主要由松果體分泌和合成，褪黑素及其代謝物除了能發(fā)揮影響生物節(jié)律、減少炎癥狀態(tài)等多重作用外，還具有間接抗氧化劑和強大的自由基直接清除劑的功能。褪黑素可以維持卵母細(xì)胞的促氧化-抗氧化平衡，從而保護雌性配子免受氧化損傷，調(diào)節(jié)健康的卵泡生成。褪黑素存在于卵泡液中，通過激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）刺激顆粒細(xì)胞增殖。許多體外研究在培養(yǎng)基中添加褪黑素，以便促進卵母細(xì)胞成熟、卵母細(xì)胞受精和胚胎發(fā)育。有研究者認(rèn)為，MT作為一種抗氧化因子在豬胚胎體外培養(yǎng)中不可或缺。實驗表明，MT能夠緩解BPA誘導(dǎo)的超氧化物對細(xì)胞的損傷。

國內(nèi)外相關(guān)研究進展顯示，雖然研究者在MT緩解BPA對生物機體或細(xì)胞損傷方面做了一些探討，但在豬卵母細(xì)胞體外成熟過程中，針對MT對BPA誘導(dǎo)的豬卵丘細(xì)胞損傷的作用方面研究尚少。本實驗室前期試驗確定在卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中，BPA導(dǎo)致卵丘細(xì)胞氧化和凋亡，降低卵丘細(xì)胞的擴展和連接水平。本研究以正常成熟培養(yǎng)的豬卵丘細(xì)胞為對照組，設(shè)置BPA組和BPA+MT組，BPA濃度根據(jù)本實驗室以往濃度為基礎(chǔ)進行選擇，從細(xì)胞形態(tài)、基因等層面深入探討MT對BPA損傷豬卵丘細(xì)胞發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑配制

洗卵液：HEPES緩沖液中添加0.3%的BSA。成熟培養(yǎng)液：碳酸氫鈉 0.015 g，葡萄糖0.027 5 g，聚乙烯醇0.05 g，丙酮酸鈉0.005 g，慶大霉素0.000 5 g，TCM-199培養(yǎng)基，10%的卵泡液（PFF），1 μg/mL促卵泡素（FSH）、促黃體素（LH），10 ng/mL表皮生長因子（EGF）。根據(jù)試驗設(shè)計添加75 μmol/L BPA，添加10-7mol/L的MT。

1.2 主要耗材

Medium199購于美國Gibco公司；活性氧檢測試劑盒、線粒體紅色熒光探針試劑盒、谷胱甘肽試劑盒和丙二醛試劑盒均購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒購于美國GeneCopoeia公司；在無特殊說明的情況下，細(xì)胞培養(yǎng)所需其他試劑均購自Sigma公司。

1.3 材料

將屠宰場采集的豬卵巢放入37℃的含有雙抗的生理鹽水中，1～3 h內(nèi)運至實驗室。

1.4 方法

1.4.1 豬卵母細(xì)胞的采集

將豬卵巢在含有雙抗的生理鹽水中清洗3次，用帶有18號針頭的10 mL一次性注射器抽取卵巢表面直徑2～8 mm的卵泡中的卵子和卵泡液，置于10 mL的錐形離心管中，37℃水浴鍋中靜置10 min后吸走上清液，用洗卵液洗兩次，在體式顯微鏡下挑選卵丘細(xì)胞三層以上胞質(zhì)均勻的卵母細(xì)胞。

1.4.2 豬卵母細(xì)胞的培養(yǎng)與分組

對照組：COCs在成熟培養(yǎng)液中清洗3次后，置于100 uL的成熟培養(yǎng)液滴中，每滴30枚卵母細(xì)胞置于38.5℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44 h。BPA組：操作方法同對照組，置于100 μL添加75 μmol/LBPA的成熟液滴中，培養(yǎng)44 h。BPA+MT組：在添加BPA的成熟培養(yǎng)液中預(yù)處理18 h后轉(zhuǎn)入添加10-7mol/L MT的成熟培養(yǎng)液滴中繼續(xù)培養(yǎng)至44 h。

1.4.3 豬卵母細(xì)胞卵丘擴展指數(shù)

在CO Cs 體外成熟培養(yǎng)44 h后，用熒光顯微鏡觀察并拍照，對卵丘擴展指數(shù)（Cumulus Expansion Index，CEI）進行分類統(tǒng)計，標(biāo)準(zhǔn)如下：0級：幾乎未擴展；1級：只有外層1～2層卵丘細(xì)胞擴展；2級：外層卵丘細(xì)胞約有一半擴展；3級：卵丘細(xì)胞除放射冠外全部擴展；4級：所有卵丘細(xì)胞呈放射狀擴展；卵丘擴展指數(shù)CEI計算公式：CEI =（0級數(shù)×0＋1級數(shù)×1＋2級數(shù)×2＋3級數(shù)×3＋4級數(shù)×4）÷總COCs個數(shù)。如圖1所示。

圖1 豬卵丘細(xì)胞分級

圖2 MT 對BPA 暴露的卵丘擴展程度的影響

1.4.4 豬卵丘細(xì)胞的采集

將培養(yǎng)成熟的各組卵母細(xì)胞放在裝有透明質(zhì)酸酶的離心管中反復(fù)吹打40次左右去除卵丘細(xì)胞，轉(zhuǎn)入操作液中在顯微鏡下將卵母細(xì)胞撿出放在操作洗盤里。將撿出卵母細(xì)胞后的剩余液體轉(zhuǎn)移到無RNAse的1 mL離心管中，在3 500 rpm離心5 min，棄去上清液，加入PBS吹打清洗，重懸后3 500 rpm離心5 min，棄去上清液，做好標(biāo)記。其他各組卵丘細(xì)胞均按此方法進行收集，收集完成后放入-80℃冰箱保存。

1.4.5 豬卵丘細(xì)胞總RNA提取及基因檢測

每個組收集1×106個/mL卵丘細(xì)胞，使用RNeasy Micro Kit（5 0）微量試劑盒提取核糖核酸（R N A），使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用All-inoneTMqPCR Mix試劑盒進行熒光定量PCR。待反應(yīng)結(jié)束后將所有Ct值導(dǎo)出，參照內(nèi)參基因，采用 2-△△Ct法計算出各目的基因mRNA的相對表達量。

1.4.6 引物設(shè)計及合成

本研究引物由生工生物工程股份有限公司設(shè)計并合成，檢測基因包括細(xì)胞凋亡相關(guān)基因（Bax、Bcl-2）、氧化應(yīng)激相關(guān)基因（CAT、SOD1）、細(xì)胞連接相關(guān)基因（Cx43、Cx45）、細(xì)胞擴展相關(guān)基因（Ptgs1、Ptgs2、Has2、Tnfaip6）引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR 引物序列

1.4.7 統(tǒng)計學(xué)處理

所有試驗數(shù)據(jù)均用均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。采用SPSS 26.0單因素方差分析（ANOVA）進行統(tǒng)計，用LSD、Duncan's檢驗法確定組間差異，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義的結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 MT 對BPA 暴露的卵丘擴展程度的影響

卵母細(xì)胞成熟后對不同處理組的COCs在顯微鏡下進行拍照，根據(jù)CEI計算公式統(tǒng)計卵丘細(xì)胞的擴展指數(shù)。由表2所示，與對照組相比，BPA組卵丘細(xì)胞擴展指數(shù)顯著降低（P＜0.05），BPA+MT組卵丘細(xì)胞擴展指數(shù)顯著升高（P＜0.05），但仍顯著低于對照組（P＜0.05）。

表2 MT 對BPA 暴露的卵丘擴展程度的影響

2.2 MT 對BPA 暴露后豬卵丘細(xì)胞CAT 基因表達的影響

卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)44 h后收集卵丘細(xì)胞檢測抗氧化相關(guān)基因CAT、SOD1。結(jié)果由圖3所示，BPA+MT組的CAT基因表達水平與對照組相比顯著降低（P＜0.05），但仍顯著高于BPA組（P＜0.05）。MT+BPA組的SOD1基因表達水平顯著低于BPA組（P＜0.05），與對照組無明顯差異（P＞0.05）。

圖3 MT 對BPA 暴露的豬卵丘細(xì)胞CAT、SOD1 基因的影響

2.3 MT 對BPA 暴露后豬卵丘細(xì)胞調(diào)亡基因的影響

卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)44 h后收集卵丘細(xì)胞檢測調(diào)亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2。由圖4可見，對照組的Bax基因表達量顯著低于BPA組（P＜0.05），但仍顯著高于BPA+MT組（P＜0.05）。BPA+MT組的Bcl-2基因表達量顯著高于BPA組（P＜0.05），但與對照組無明顯差異（P＞0.05）。與對照組相比，BPA組Bcl-2/Bax顯著降低（P＜0.05），BPA+MT組Bcl-2/Bax與對照組相比顯著升高（P＜0.05）。

圖4 MT 對BPA 暴露的豬卵丘細(xì)胞調(diào)亡基因的影響

2.4 MT 對BPA 暴露的豬卵丘細(xì)胞擴展基因的影響

卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)44 h后收集卵丘細(xì)胞擴展相關(guān)基因Ptgs1、Ptgs2、Has2、 Tnfaip6。由圖5可見，MT+BPA組Ptgs1的基因表達量與對照組相比無明顯差異（P＞0.05），都顯著高于BPA組（P＜0.05）。與對照組相比，BPA+MT組的Ptgs2的基因表達量顯著升高（P＜0.05），BPA組Ptgs2的基因表達量與對照組相比顯著降低（P＜0.05）。BPA+MT組Has2的基因表達量與對照組相比顯著降低（P＜0.05），但仍顯著高于BPA組（P＜0.05）。BPA+MT組Tnfaip6的基因表達量顯著高于B PA 組（P＜0.05），但與對照組相比無明顯差異（P＞0.05）。

圖5 MT 對BPA 暴露的豬卵丘細(xì)胞擴展基因的影響

2.5 MT 對BPA 暴露的豬卵丘細(xì)胞連接基因的影響

卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)44 h后收集卵丘細(xì)胞連接相關(guān)基因Cx43、Cx45。由圖6可見，MT+BPA組的Cx43基因表達量顯著低于對照組（P＜0.05），但仍顯著高于BPA組（P＜0.05）。與對照組相比，BPA組的Cx45基因表達量顯著降低（P＜0.05），MT+BPA組的Cx45基因表達量顯著高于對照組（P＜0.05）。

圖6 MT 對豬卵丘細(xì)胞在BPA中暴露后連接基因的影響

3 討論

卵丘細(xì)胞在卵母細(xì)胞體外成熟過程中起著關(guān)鍵作用。卵丘細(xì)胞介導(dǎo)卵泡微環(huán)境和母體特征來支持卵母細(xì)胞的生長、發(fā)育和獲能。以往的研究表明，人類裸卵細(xì)胞在體外成熟發(fā)育過程中，在減數(shù)分裂復(fù)蘇和減數(shù)分裂進行的過程中，維持中期特征的細(xì)胞質(zhì)能力不足，減數(shù)分裂中斷后傾向于自發(fā)激活，核成熟和細(xì)胞質(zhì)成熟之間缺乏協(xié)調(diào)。此外，在一項對裸牛卵母細(xì)胞的研究中，發(fā)現(xiàn)卵裂率也降低。IVM過程中卵丘細(xì)胞的缺失也會影響卵母細(xì)胞的脂質(zhì)代謝，導(dǎo)致胞質(zhì)成熟不夠理想，從而降低其發(fā)育能力。在本研究中，檢測了卵丘細(xì)胞的擴展情況。結(jié)果表明，BPA組的卵丘細(xì)胞擴展指數(shù)與對照組相比顯著降低，添加完M T 卵丘擴展指數(shù)顯著升高，但仍低于對照組。其中對照組的COCs被卵丘多層包裹切擴散體積較大，BPA組的COCs擴散體積明顯變小，卵丘細(xì)胞包裹層數(shù)少。說明BPA影響了卵丘細(xì)胞的擴展，添加10-7M的MT可以促進BPA暴露后的卵丘細(xì)胞擴展但無法完全消除損傷。

即使在極低的暴露水平下，BPA似乎也會干擾女性和男性的生殖功能。盡管BPA損害內(nèi)分泌功能的途徑多種多樣，但氧化應(yīng)激的改變?nèi)匀皇悄行院团圆挥年P(guān)鍵因素。當(dāng)ROS的產(chǎn)生超過其內(nèi)源性抗氧化防御機制的保護能力時，就會發(fā)生氧化應(yīng)激。ROS活性高會導(dǎo)致細(xì)胞損傷，但可通過氧化生物大分子和細(xì)胞器來穩(wěn)定。SOD1作為超氧化物歧化酶，可以催化超氧陰離子自由基歧化為H2O2和O2，CAT將H2O2分解為氧氣和水，可以通過中和自由基來保護機體免受ROS的侵襲。在本研究中，BPA暴露顯著降低卵母細(xì)胞內(nèi)CAT基因的表達量，SOD1基因表達量顯著升高。添加MT后，CAT基因表達量顯著升高但仍顯著低于對照組。我們研究得出，BPA暴露后卵丘細(xì)胞的抗氧化能力降低，添加MT后抗氧化能力顯著上升。

為了確定BPA暴露后卵丘細(xì)胞凋亡因子的變化，我們檢測了卵丘細(xì)胞中抗調(diào)亡基因Bcl-2以及促調(diào)亡基因Bax的表達。結(jié)果表明，BPA暴露降低了抗調(diào)亡基因Bcl-2的mRNA表達，而顯著提高了促調(diào)亡基因Bax的mRNA表達，在加入MT后，抗調(diào)亡基因Bcl-2的mRNA表達顯著上升，回到對照組水平，促調(diào)亡基因Bax的mRNA表達量與對照組相比顯著降低。BPA組的Bcl-2/Bax比例顯著降低，BPA+MT組的Bcl-2/Bax比例顯著升高，結(jié)果表明，BPA能促進卵丘凋亡，而MT通過抑制卵丘凋亡來保護卵丘細(xì)胞的發(fā)育。

以往的研究表明，卵丘細(xì)胞的擴展與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的產(chǎn)生有關(guān)，Has2合成的透明質(zhì)酸包含基質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)骨架，Tnfaip6也是ECM的重要組成部分。卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞之間的相互作用是雙向溝通的必要條件，卵母細(xì)胞與卵丘細(xì)胞之間的通信是通過縫隙連接進行的，縫隙連接也參與卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞之間的分子轉(zhuǎn)移。

在本研究中，檢測了卵丘細(xì)胞擴展相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)BPA暴露后卵丘擴展基因Ptgs1、Ptgs2、Tnfaip6、Has2的基因表達水平顯著降低；MT+BPA組Ptgs2基因的表達水平顯著升高，同時顯著高于對照組；顯著升高了Ptgs1、Tnfaip6基因表達水平，與對照組相比差異不顯著；Has2基因表達水平顯著升高，但仍顯著低于對照組。檢測卵丘連接相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)BPA暴露后顯著降低卵丘連接基因Cx43和Cx45的轉(zhuǎn)錄水平；添加MT的BPA組，Cx43基因轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，與對照組差異不顯著；Cx45基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，同時顯著高于對照組；結(jié)果表明，卵丘細(xì)胞連接和擴展的基因表達在BPA暴露后受到了抑制，導(dǎo)致卵母細(xì)胞的成熟與發(fā)育能力下降。而添加MT后卵丘細(xì)胞連接和擴展的基因表達上調(diào)，表明MT并不僅是通過減緩 BPA對卵丘細(xì)胞的損傷來促進卵丘的連接和擴展，而是其本身對卵丘細(xì)胞連接和擴展有促進作用。

4 結(jié)論

本研究表明，在BPA染毒豬卵丘細(xì)胞體外成熟的過程中，MT不僅提高了卵丘擴展基因和卵丘連接基因的表達從而提高卵丘擴展指數(shù)，還提高了卵丘抗氧化基因和抗凋亡基因的表達，緩解了細(xì)胞的氧化應(yīng)激和調(diào)亡，起到保護卵丘細(xì)胞的作用。