肖敏，劉達(dá)，游秋云，但漢雄，尤朋濤

1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，中藥資源與中藥化學(xué)省級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（武漢 430065）；2.武漢綠時代創(chuàng)新科技有限公司（武漢 430012）

便秘是一種常見的胃腸功能性疾病，慢傳輸型便秘（slow transit constipation，STC）是便秘中最常見的類型[1]。便秘主要臨床表現(xiàn)是大便次數(shù)減少、糞便干硬、排便困難。它在各個年齡段人群中普遍存在，在老年人和女性中發(fā)病率越來越高，其病情會反復(fù)發(fā)作，難以治愈，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量[2]。STC現(xiàn)有治療藥物主要有緩瀉劑如開塞露和促動力劑如枸櫞酸莫沙必利，藥物治療便秘雖然短期內(nèi)療效較好，但是長期使用會引起藥物依賴、胃腸動力不足等多種不良反應(yīng)[3]。因此，尋找安全有效的天然活性物質(zhì)在治療和緩解慢傳輸型便秘具有重要的意義。

竹鹽是原鹽經(jīng)特殊加工得到的保健食用鹽。將原鹽放進(jìn)竹筒封上黃泥，在特制的窯中進(jìn)行煅烤，反復(fù)經(jīng)過升溫、保溫、再升溫、再保溫等過程，可得到一烤竹鹽至八烤竹鹽，如果想要得到純度較高的九烤竹鹽，需要將爐溫升到1 300 ℃讓鹽粉熔化成液態(tài)，氣化蒸發(fā)掉其中的重金屬氯化物，并清理出其他雜質(zhì)的懸浮物和深沉物[4]。馮霞等[5]檢測發(fā)現(xiàn)竹鹽的鈣、鎂、鐵、錳、磷、硫、鉀含量均高于海鹽。因此，竹鹽比一般食鹽也就多了更多的養(yǎng)生與保健的功效。竹鹽具有弱堿性，可以中和機(jī)體內(nèi)酸性代謝產(chǎn)物，被譽(yù)為“自然界解毒之王”和“藥用鹽”。現(xiàn)已有研究結(jié)果表明，竹鹽具有潛在的抗癌作用[6]、抗炎作用[7]、抗皮膚衰老作用[8]、增強(qiáng)免疫作用[9]等，并提示竹鹽有助于緩解消化系統(tǒng)疾病[10]。Huang等[11]發(fā)現(xiàn)竹鹽含有的成分之一硫化氫，外源應(yīng)用硫化氫在生理相關(guān)濃度下可以促進(jìn)體外成熟胃起搏細(xì)胞Cajal間質(zhì)細(xì)胞（interstitial cells of cajal，ICC）的增殖。ICC的增殖和存活與c-kit原癌基因（c-kit proto-oncogene protein，c-kit）和配體干細(xì)胞因子（stem cell factor，SCF）結(jié)合后激活信號通路有關(guān)[12]。Ikarasgi等[13]研究發(fā)現(xiàn)導(dǎo)瀉劑硫酸鎂可導(dǎo)致腸HT-29細(xì)胞水通道蛋白3（aquaporin 3，AQP3）表達(dá)增多，可能的機(jī)制是鎂離子引起腺苷酸環(huán)化酶活化，催化產(chǎn)生環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP），引起蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）的活化，導(dǎo)致環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白磷酸化，促進(jìn)了AQP3的表達(dá)。周永學(xué)等[14]發(fā)現(xiàn)血管活性腸肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）靜脈注射能夠激活cAMP/PKA通路，促進(jìn)AQP3的表達(dá)，影響便秘大鼠腸道水液代謝，進(jìn)而改善便秘癥狀。此研究采用鹽酸洛哌丁胺誘導(dǎo)STC小鼠模型，檢測血清中胃腸激素、神經(jīng)遞質(zhì)、結(jié)腸中相關(guān)蛋白和基因表達(dá)水平，觀察竹鹽對便秘小鼠的影響，并基于SCF/c-kit和VIP/PKA/cAMP/AQP3通路初步探討其作用機(jī)制，以期為開發(fā)相關(guān)功能性食品提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

60只昆明SPF級小鼠，雌性，體重26～28 g（湖北省疾病預(yù)防控制中心），許可證號：SCXK（鄂）2020-0018。動物進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)室通氣良好，室溫25±2 ℃，相對濕度50%～70%。

九烤竹鹽（湖北省中科鹽谷科技有限公司），為粉末狀，于4 ℃冰箱備用。枸櫞酸莫沙必利片（國藥準(zhǔn)字J20140149，蘇州住友制藥有限公司）；c-Kit抗體（批號AF6153）、VIP抗體（批號DF6627）、PKA抗體（批號AF7746）、AQP3抗體（批號AF5222）：江蘇親科生物研究中心有限公司；GAPDH抗體（批號97166T）、二抗兔抗（批號7074P2）：美國Cell Signaling Technology公司；小鼠胃泌素（gastrin，Gas）酶聯(lián)免疫分析試劑盒（批號A119258-96T）、小鼠P物質(zhì)（substance-P，SP）酶聯(lián)免疫分析試劑盒（批號A105714-96T）：上海撫生實(shí)業(yè)有限公司；一氧化氮（nitric oxide，NO）檢測試劑盒（批號A012-1）：南京建成生物工程研究所；阿拉伯樹膠（批號A108975）、醫(yī)藥級別活性炭（批號A304261）、鹽酸洛哌丁胺（批號L129465）：上海阿拉丁集團(tuán)有限公司；RIPA-PMSF裂解緩沖液（批號P0013B）：上海Beyotime公司。

1.2 儀器與設(shè)備

酶標(biāo)儀（SPARK10M，美國瑞士帝肯有限公司）；萬分之一天平（AL-204，美國特勒-托利多儀器有限公司）；qPCR儀（Step One Plus，美國Applied Biosystems公司）；蛋白電泳儀（Power Pac，美國Bio-Rad有限公司）；成像系統(tǒng)（NIKONDS-U3，日本尼康公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 便秘小鼠模型的建立與給藥

60只雌鼠，隨機(jī)分為空白組、模型組、低中高給藥組、陽性對照組，每組各10只。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，空白組灌胃等量0.9%氯化鈉注射液，其余組給予鹽酸洛哌丁胺10 mg/kg造便秘模型，連續(xù)7 d后，從第8天開始，灌胃鹽酸洛哌丁胺1 h后，給藥組灌胃低中高濃度的竹鹽（0.5，1.0和1.5 g/kg），空白組和模型組灌胃等量0.9%氯化鈉注射液，陽性對照組灌胃枸櫞酸莫沙必利片2.5 mg/kg，連續(xù)干預(yù)7 d。

1.3.2 小鼠6 h排便粒數(shù)統(tǒng)計和小腸推進(jìn)率的測量

第14天給藥后分開飼養(yǎng)，統(tǒng)計6 h的排便粒數(shù)。禁食不禁水24 h，灌胃0.2 mL的5%活性炭混懸液，灌胃后開始計時，30 min后處死收集小腸，測量長度，幽門至回盲處的距離計為腸管總長度，幽門至炭末汁前端處計為炭末推進(jìn)長度，計算小腸推進(jìn)率，按式（1）計算。

1.3.3 神經(jīng)遞質(zhì)及胃腸激素檢測

將小鼠麻醉后眼眶取血，所采血液在低溫高速離心機(jī)上以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速，在4 ℃的條件下離心10 min后收集上清，放入-80 ℃冰箱。使用對應(yīng)試劑盒檢測小鼠血清中胃泌素、P物質(zhì)、一氧化氮含量，具體步驟參考試劑盒說明書。

1.3.4 便秘小鼠結(jié)腸組織的病理觀察

剪取小鼠近肛門部位長約2 cm的結(jié)腸組織，采用生理鹽水沖洗，置10%中性甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟切片。蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色后，顯微觀察結(jié)腸組織的病理學(xué)變化。

1.3.5 實(shí)時熒光定量法（real time quantitative PCR，RT-qPCR）檢測小鼠結(jié)腸組織中相關(guān)mRNA水平

取50 mg各組小鼠的結(jié)腸組織，使用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖鹽溶液（Phosphate Buffered Saline，PBS）清洗3次，剪成細(xì)碎小塊，置于組織勻漿機(jī)中，得組織勻漿。RNA-easy裂解液提取RNA。使用紫外分光光度計檢測各組RNA濃度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列如表1所示，檢測循環(huán)數(shù)（Ct值），以GAPDH與模型對照組為對照計算ΔΔCt，采用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達(dá)量。

表1 引物序列

1.3.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

采用蛋白質(zhì)印跡法檢測。將蛋白酶抑制劑與RIPA裂解液按照體積比1∶100混合均勻，備用。取各60 mg組凍存的結(jié)腸組織，加入100 μL裂解液混合物裂解，用眼科剪將組織剪碎，隨后用勻漿器對組織碎片勻漿，放置30 min，使其充分裂解。以12 000 r/min離心10 min，取上清液，以BCA法（Bicinchoninic acid，BCA）測定蛋白含量。蛋白經(jīng)煮沸變性后，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)膜，以5%的牛血清白蛋白封閉液封閉2 h；以Tris緩沖鹽溶液加吐溫20（Tris Buffered Saline+Tween-20，TBST）洗膜3次，加入VIP、PKA、AQP3、c-kit、GAPDH一抗（稀釋度均為1∶1 000），于4 ℃孵育過夜；以TBST洗膜3次，加入二抗（稀釋度為1∶1 000），室溫孵育2 h；以TBST洗膜3次，加入enhanced chemiluminescence（ECL）顯色劑，于化學(xué)發(fā)光儀上掃描和成像。采用Image J v1.8.0軟件對條帶灰度值進(jìn)行分析，以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

試驗(yàn)結(jié)果采用Graphpad Prism 7.00數(shù)據(jù)分析軟件，采用Studentt-test檢驗(yàn)比較組間差異顯著性，以P＜0.05作為具有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 竹鹽對便秘小鼠6 h排便數(shù)和小腸推進(jìn)率的影響

如表2所示，與空白組相比，模型組6 h的排便粒數(shù)顯著減少，腸推進(jìn)率顯著降低，說明灌胃鹽酸洛哌丁胺成功誘導(dǎo)了小鼠的便秘癥狀。經(jīng)過竹鹽和枸櫞酸莫沙必利干預(yù)后，6 h的排便粒數(shù)顯著增加，腸推進(jìn)率顯著升高，說明竹鹽和陽性藥枸櫞酸莫沙必利對鹽酸洛哌丁胺誘導(dǎo)的便秘具有一定緩解作用。

表2 竹鹽對便秘小鼠6小時排便粒數(shù)和小腸推進(jìn)率的影響（n=8）

2.2 竹鹽對便秘小鼠血清中Gas、SP、NO濃度的影響

神經(jīng)遞質(zhì)可調(diào)節(jié)胃腸道的運(yùn)動功能，分為興奮性神經(jīng)遞質(zhì)和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。SP是興奮性遞質(zhì)，收縮平滑肌，促進(jìn)胃腸運(yùn)動[15]；NO是抑制性遞質(zhì)，分泌增多可減慢結(jié)腸蠕動，導(dǎo)致便秘[16]。Gas是胃腸激素，可增強(qiáng)結(jié)腸平滑肌的收縮，促進(jìn)結(jié)腸運(yùn)動[17]。研究顯示，脾腎陽虛型STC患者血清SP含量降低，NO含量增高[18]；STC大鼠血清中SP和Gas明顯減少[19]。如表3所示，試驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M與空白組比較，血清中Gas、SP濃度明顯降低（P＜0.01），NO濃度明顯增高（P＜0.01），說明此研究使用鹽酸洛哌丁胺誘導(dǎo)成功建立STC小鼠模型。與模型組比較，除了竹鹽低劑量組的腸推進(jìn)率沒有明顯差異，竹鹽中高劑量組和枸櫞酸莫沙必利組的腸推進(jìn)率明顯增加（P＜0.01），說明竹鹽緩解了鹽酸洛哌丁胺誘導(dǎo)的便秘。

表3 竹鹽對小鼠腸推進(jìn)率和血清中Gas、SP、NO的影響（n=8）

2.3 竹鹽對便秘小鼠結(jié)腸組織形態(tài)的影響

如圖1所示，經(jīng)HE染色發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，模型組結(jié)腸黏膜出現(xiàn)紊亂表征，肌層變薄，杯狀細(xì)胞減少，且有炎性聚集。說明洛哌丁胺誘導(dǎo)的便秘對結(jié)腸黏膜組織有一定損害。竹鹽低中高劑量組和枸櫞酸莫沙必利組結(jié)腸組織黏膜排列趨向正常，肌層逐漸變厚，杯狀細(xì)胞逐漸增多，無炎性聚集。結(jié)腸中上述病理學(xué)變化在竹鹽的干預(yù)下出現(xiàn)不同程度改善，說明竹鹽緩解了便秘導(dǎo)致的黏膜損傷。

圖1 各組小鼠結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)的病理變化（×100）

2.4 竹鹽對便秘小鼠結(jié)腸組織SCF mRNA和c-kit蛋白表達(dá)水平的影響

經(jīng)蛋白免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)，模型組結(jié)腸組織中的c-Kit蛋白表達(dá)較空白組明顯減少（P＜0.05），經(jīng)中高劑量的竹鹽和陽性藥物枸櫞酸莫沙必利干預(yù)后，c-Kit表達(dá)逐漸增加（P＜0.05）。RT-qPCR分析發(fā)現(xiàn)模型組腸道組織中SCF的mRNA相對表達(dá)量較空白組減少（P＜0.05），經(jīng)低、中、高劑量竹鹽和枸櫞酸莫沙必利干預(yù)后，便秘模型小鼠腸道組織中SCF mRNA的表達(dá)量都有了顯著提高（P＜0.05）。ICC是胃腸道起搏器區(qū)的起搏細(xì)胞[20]，已有研究表明，STC患者結(jié)腸ICC顯著降低[21]；槐黃丸治療后STC大鼠便秘緩解后結(jié)腸中c-kit和SCF的基因和蛋白水平顯著升高[22]。如圖2和圖3所示，此試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)中、高劑量竹鹽干預(yù)后可以顯著提高便秘模型小鼠腸道組織中c-Kit蛋白的表達(dá)量和SCF mRNA的表達(dá)量，這說明竹鹽可能通過c-kit/SCF通路促進(jìn)ICC增殖，進(jìn)而起到改善腸道平滑肌收縮而緩解便秘癥狀的作用。

圖2 SCF mRNA在結(jié)腸組織中的表達(dá)水平（n=3）

圖3 c-kit蛋白在結(jié)腸組織中的表達(dá)水平

2.5 竹鹽對便秘小鼠結(jié)腸組織cAMP mRNA和VIP、PKA、AQP3蛋白表達(dá)水平的影響

RT-qPCR分析發(fā)現(xiàn)模型組腸道組織中cAMP的mRNA相對表達(dá)量較空白組極顯著減少（P＜0.01），經(jīng)低、中、高劑量的竹鹽和枸櫞酸莫沙必利干預(yù)后，便秘模型小鼠腸道組織中cAMP的mRNA的表達(dá)量都有了顯著提高（P＜0.05或P＜0.01），如圖4所示。經(jīng)WB檢測發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，模型組結(jié)腸中VIP、PKA、AQP3蛋白表達(dá)明顯減少（P＜0.05），竹鹽低劑量組較模型組VIP、PKA、AQP3蛋白表達(dá)無顯著性差異，竹鹽中高劑量組和枸櫞酸莫沙必利組VIP、PKA、AQP3蛋白表達(dá)水平與模型組相比明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），如圖5所示。VIP是一種由上端小腸內(nèi)分泌細(xì)胞分泌的胃腸激素，可緩解平滑肌緊張、保護(hù)胃腸道黏膜、調(diào)節(jié)腸道吸收。Tomita[23]和King等[24]研究顯示STC患者的直腸黏膜和黏膜下組織SP活性明顯降低，結(jié)腸VIP水平明顯降低。有研究表明，VIP含量的降低，可能會引起結(jié)腸出現(xiàn)過度的階段性蠕動，減弱結(jié)腸的有效推動[25]。AQP3主要分布于從口腔到胃以及從結(jié)腸到肛門段的消化道黏膜上皮，參與胃腸道水分運(yùn)輸?shù)恼{(diào)節(jié)[26]。Zhi等[27]研究顯示慢傳輸便秘模型大鼠近端結(jié)腸AQP3表達(dá)下降。Itoh等[28]研究發(fā)現(xiàn)VIP可通過影響腸上皮細(xì)胞中水通道蛋白3的表達(dá)來調(diào)節(jié)腸道水代謝，細(xì)胞內(nèi)的cAMP與PKA結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，發(fā)揮相應(yīng)的生理作用。周永學(xué)等[29]提出了VIP/cAMP/PKA/AQP3水液代謝通路。Cong等[30]發(fā)現(xiàn)便秘大鼠腸道水代謝的機(jī)制與VIP/cAMP/PKA/AQP3信號通路有關(guān)。此研究中高劑量的竹鹽對STC小鼠進(jìn)行干預(yù)后，VIP、PKA、AQP3的蛋白表達(dá)和cAMP的mRNA表達(dá)較模型組都有了顯著增高。說明竹鹽抗便秘作用可能與VIP/cAMP/PKA/AQP3信號通路有關(guān)。

圖4 cAMP mRNA在結(jié)腸組織中的表達(dá)水平（n=3）

圖5 VIP、PKA、AQP3蛋白在結(jié)腸組織中的表達(dá)水平

3 結(jié)論

此次研究結(jié)果顯示：與模型組相比，竹鹽中高劑量組和枸櫞酸莫沙必利組中STC小鼠結(jié)腸組織肌層逐漸變厚，杯狀細(xì)胞增多，緩解了便秘導(dǎo)致的黏膜損傷；與模型組相比，中高劑量竹鹽和枸櫞酸干預(yù)后明顯增加了STC小鼠腸推進(jìn)率和血清中Gas和SP含量，減少了NO含量，促進(jìn)了結(jié)腸組織中c-kit、VIP、PKA、AQP3蛋白表達(dá)水平和SCF、cAMP的mRNA的相對表達(dá)，均有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01）。竹鹽對鹽酸洛哌丁胺誘導(dǎo)的STC小鼠具有通便作用，可能通過調(diào)節(jié)SCF/c-kit和VIP/cAMP/PKA/AQP3信號通路達(dá)到緩解便秘效果，該研究為開發(fā)相關(guān)功能性食品提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

鄧志敢等[31]發(fā)現(xiàn)隨著竹鹽煅烤次數(shù)的增加，有益礦物元素鈣、鎂、磷、鉀、鐵含量在竹鹽內(nèi)不斷富集。而所用竹鹽經(jīng)過九次煅烤，含有大量礦物質(zhì)，其中包括鎂離子和硫化物，由此推測竹鹽基于VIP/cAMP/PKA/AQP3通路的抗便秘作用可能與其含有大量鎂離子有關(guān)，基于SCF/c-kit通路對便秘的緩解作用可能與其含有硫化物有關(guān)。竹鹽中是否存在其他助于緩解便秘的成分還有待于進(jìn)一步分析。

綜上所述，九烤竹鹽可能通過激活SCF/c-kit通路和VIP/cAMP/PKA/AQP3信號通路改善STC模型小鼠的便秘癥狀和腸道功能。該研究結(jié)果為開發(fā)竹鹽相關(guān)功能性食品提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。