郭峰，董曉婷

錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院（錦州 121000）

糖尿?。―iabetes mellitus，DM）是一種嚴(yán)重威脅人類健康的慢性代謝疾病，臨床表現(xiàn)為無法維持機(jī)體正常的血糖水平。“三多一少”，即多食、多飲、多尿和體重減輕。據(jù)統(tǒng)計，2017年全球有超過4.25億人患糖尿病，預(yù)計到2045年將達(dá)到6.93億人患病[1]。我國現(xiàn)有糖尿病患者眾多，在3 000萬人以上。糖尿病主要分為三種類型，即1型糖尿病（T1DM）、2型糖尿病（T2DM）以及其他特殊類型糖尿?。ㄈ缛焉锾悄虿。?，其中T2MD最為常見，占糖尿病患者的90%～95%[2]。T2MD的主要病理機(jī)制是由于胰島素抵抗，胰腺β細(xì)胞調(diào)節(jié)的葡萄糖代謝紊亂以及胰島素受體功能降低所導(dǎo)致[3]。長期處于高血糖會導(dǎo)致氧化應(yīng)激系統(tǒng)異常，從而引起一系列并發(fā)癥，如腎臟病變、視網(wǎng)膜病變及心腦血管病變等[4]。目前，已有一些臨床藥物能起到降糖作用，主要是通過提升外周血胰島素水平或改善胰島素抵抗，但長期使用會有嚴(yán)重的副作用，如酸中毒、低血糖及肝臟疾病等[5-6]。因此，從天然藥物中篩選出具有降糖功能的活性成分成為了研究熱點(diǎn)。近年來，國內(nèi)外研究者發(fā)現(xiàn)多糖具有廣泛的生物活性，在抗氧化、抗腫瘤、降血糖、抗炎、免疫調(diào)節(jié)和降血脂等活性方面取得了重大進(jìn)展。

枸杞子（Lycium barbarumL.）是一種名貴的藥食同源中藥，性甘平，具有補(bǔ)腎養(yǎng)陰、耐寒暑、治虛勞消渴之功效。其中含有多糖、黃酮、類胡蘿卜素、氨基酸、維生素和微量元素等多種活性成分，常作為補(bǔ)益方劑中的常用藥味[7-8]。枸杞多糖（Lycium barbarumpolysaccharides，LBP）是有效的生物活性成分之一，富含多種單糖成分，作用靶點(diǎn)多，具有降血糖的潛在優(yōu)勢[9]。因此，此研究從寧夏枸杞中提取LBP，并探討LBP的體外降糖活性以及對T2MD大鼠模型在降血糖方面的作用及其機(jī)制，旨在為治療糖尿病的藥物和預(yù)防糖尿病的保健食品開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要材料與試劑

50只SPF級健康Wister大鼠（沈陽艾科賽斯生物科技有限公司）；寧夏枸杞（寧夏，經(jīng)錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院鑒定為茄科植物寧夏枸杞的干燥成熟果實）；高脂飼料（沈陽茂華生物科技有限公司）；鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司）；α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、過氧化氫酶（CAT）和胰島素檢測試劑盒：合肥萊爾生物科技有限公司。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

3000FA酶標(biāo)儀（上海閃譜科技有限公司）；ACCU-CHEK血糖儀（中國羅氏制藥有限公司）；LD-Y300A高速萬能粉碎機(jī)（上海頂帥電器有限公司）；CT14RD高速冷凍離心機(jī)（北京時代離心機(jī)有限公司）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；LRHS-101B-L高低溫試驗箱（廣東宏展科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 LBP的制備

將枸杞置于65 ℃烘箱中干燥12 h后用粉碎機(jī)磨成粉末，過0.180 mm篩。稱取30 g干粉，按1∶3（g/mL）加入蒸餾水，于80 ℃提取3 h，重復(fù)提取3次，合并提取液，按5 000 r/min離心20 min后取上清液。于50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原體積的1/3，采用Sevage法除去提取液蛋白，重復(fù)操作直至中間層無白色。然后加入3倍體積無水乙醇，于4 ℃靜置沉淀12 h，按5 000 r/min離心30 min后棄去上清液，取沉淀冷凍干燥得到LBP[10]。

1.2.2 體外降血糖活性的測定

α-淀粉酶抑制活性的測定：參考石越等[11]的方法并稍作改動。取LBP，用0.1 mol/L的PBS緩沖溶液配制成質(zhì)量濃度為0.25，0.5，1.0，2.0，4.0和6.0 mg/mL的樣品稀釋液，取30 μL。再稱取相同體積的1 U/mL的α-淀粉酶溶液置于酶標(biāo)板中，于37 ℃反應(yīng)10 min。再加入同體積的1%淀粉溶液混勻，于37 ℃水浴15 min后迅速加入50 μL的DNS溶液終止反應(yīng)，沸水浴5 min，顯色后冰水浴15 min。以阿卡波糖為陽性對照，測定溶液在波長540 nm處的吸光度并計算LBP對α-淀粉酶的抑制率。

α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定：參考Xu等[12]的方法并稍作改動。取LBP，用0.1 mol/L的PBS緩沖溶液配制成質(zhì)量濃度為0.25，0.5，1.0，2.0，4.0和6.0 mg/mL的樣品稀釋液，取40 μL。再稱取相同體積的1 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液置于酶標(biāo)板中，于37 ℃反應(yīng)10 min。再加入同體積的5 mmol/L的PNPG溶液混勻，于37 ℃ 水浴5 min后加入100 mL Na2CO3溶液（0.1 mol/L）振搖1 min終止反應(yīng)。以阿卡波糖為陽性對照，測定溶液在波長405 nm處的吸光度并計算LBP對α-葡萄糖苷酶的抑制率。

1.2.3 建立T2MD大鼠模型

50只Wistar大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將10只大鼠作為正常對照組，喂普通飼料，其余40只大鼠作為T2MD模型組，喂高脂飼料。喂養(yǎng)4周后，將大鼠禁食16 h。模型組大鼠腹腔注射STZ溶液，對照組大鼠注射同等體積的檸檬酸鈉緩沖液，連續(xù)注射3 d。最后1次注射STZ 72 h后測其空腹血糖值（FBG），考察T2MD大鼠建造模型是否成功。

1.2.4 分組與給藥

T2MD大鼠建造模型成功后，將40只T2MD大鼠隨機(jī)分為四組，分別為模型組、LBP低劑量組（20 mg/kg）、LBP中劑量組（40 mg/kg）、LBP高劑量組（80 mg/kg），并給予對應(yīng)劑量干預(yù)。正常對照組和模型組給予生理鹽水干預(yù)。各組每日灌胃給藥一次，連續(xù)干預(yù)8周。

1.2.5 大鼠飲水量、體質(zhì)量（BW）和空腹血糖值（FBG）的測定

灌胃期間，每間隔2周測定1次大鼠的飲水量和體質(zhì)量。FBG從尾靜脈取血進(jìn)行測定，禁食過夜后進(jìn)行測定。

1.2.6 口服葡萄糖耐量（OGTT）的測定

在最后一次測定血糖值后，按2 g/kg的劑量給予大鼠葡萄糖溶液，測定服糖后0，30，60和120 min的血糖并計算血糖曲線下的面積（AUC），按式（1）計算。

式中：Gi為各時間點(diǎn)的血糖值[13]。

1.2.7 血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)的測定

使用SOD、CAT、GSH和MDA檢測試劑盒分別測定各含量。

1.2.8 血清中胰島素釋放試驗（Ins水平）的測定

使用胰島素檢測試劑盒測定Ins水平。

1.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)使用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”進(jìn)行表示，選用SPSS 26.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05）和極顯著性分析（P＜0.01）處理，Origin 2021繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 LBP的體外降血糖活性

2.1.1 LBP對α-淀粉酶活性的抑制

LBP可以顯著抑制α-淀粉酶的活性，其活性被抑制后可以使碳水化合物的消化過程變緩，進(jìn)而使餐后血糖濃度的升高變緩[14]。由圖1可知，雖然LBP對α-淀粉酶的抑制活性顯著低于阿卡波糖，但當(dāng)LBP濃度大于4 mg/mL時，抑制率超過了90%。當(dāng)濃度為6 mg/mL時，抑制率達(dá)到了92.59%±0.47%。鑒于阿卡波糖是生物合成藥物，具有一定的副作用，而天然活性成分LBP對α-淀粉酶活性具有積極的抑制效果，具有作為α-淀粉酶抑制劑成分的潛力。

圖1 LBP對α-淀粉酶活性的抑制

2.1.2 LBP對α-葡萄糖苷酶活性的抑制

LBP對α-葡萄糖苷酶活性的抑制機(jī)理與α-淀粉酶相似，通過抑制α-葡萄糖苷酶的活性可以使碳水化合物轉(zhuǎn)變?yōu)榭晌諉翁堑乃俣茸兟?，從而有效控制餐后血糖水平[15]。由圖2可知，隨著LBP濃度的增加，其對α-葡萄糖苷酶的抑制率顯著增加，但整體抑制率低于阿卡波糖。當(dāng)阿卡波糖濃度為6 mg/mL時，抑制率為98.44%±0.43%。此時，LBP對α-葡萄糖苷酶的抑制率為92.09%±0.21%，表明LBP對α-葡萄糖苷酶具有較好的抑制能力。

圖2 LBP對α-葡萄糖苷酶活性的抑制

2.2 LBP的體內(nèi)降血糖活性

2.2.1 T2MD大鼠造模情況

對于此次試驗建造的T2MD大鼠，注射STZ后測其FBG，測得結(jié)果為大鼠的FBG值均在11.1～25 mmol/L之間，視為造模成功。

2.2.2 LBP對T2MD大鼠飲水量的影響

由表1可知，0周時，即未進(jìn)行LBP干預(yù)時，與對照組相比，其他四組的大鼠飲水量均極顯著高于對照組（P＜0.01）。模型組大鼠的飲水量隨著時間的增加而增加，且極顯著于對照組（P＜0.01）。而LBP三組大鼠的飲水量都逐漸減少，當(dāng)LBP干預(yù)4周時LBP三組大鼠飲水量均顯著低于模型組（P＜0.05或P＜0.01），并逐漸趨于正常。這表明，T2MD大鼠會出現(xiàn)典型的多飲癥狀，LBP可以明顯改善這一癥狀。

表1 LBP對T2MD大鼠飲水量的影響

2.2.3 LBP對T2MD大鼠BW的影響

由表2可知，在0周時，即T2MD大鼠在被LBP干預(yù)前，與對照組相比，其他組的大鼠BW均極顯著高于對照組（P＜0.01），由于這四組大鼠喂食高脂飼料。在LBP干預(yù)過程中，三組大鼠BW均逐漸增加。當(dāng)LBP干預(yù)8周時，LBP中劑量組和高劑量組大鼠的BW顯著高于模型組（P＜0.05或P＜0.01），并且趨于正常，這表明T2MD大鼠會出現(xiàn)體重減輕的癥狀，LBP對此消瘦癥狀有一定的改善作用。

表2 LBP對T2MD大鼠BW的影響

2.2.4 LBP對T2MD大鼠FBG的影響

由表3可知，0周時，即未進(jìn)行LBP干預(yù)時，與對照組相比，其他四組的大鼠血糖值均極顯著高于對照組（P＜0.01）。模型組大鼠的血糖值均極顯著高于對照組（P＜0.01），LBP低劑量組在6周時，大鼠血糖顯著低于模型組。當(dāng)LBP干預(yù)2周時，LBP中劑量組和高劑量組大鼠血糖顯著低于模型組（P＜0.05或P＜0.01）。當(dāng)LBP干預(yù)8周時。LBP三組大鼠血糖值均極顯著低于模型組（P＜0.01）。這表明LBP能較好地改善T2MD大鼠的血糖值。

表3 LBP對T2MD大鼠FBG的影響

2.2.5 LBP對T2MD大鼠口服葡萄糖耐量的影響

口服葡萄糖耐量試驗（OGTT）是一種用來評估胰島β細(xì)胞功能的葡萄糖負(fù)荷試驗，被廣泛應(yīng)用于臨床確診T2MD[16]。由圖3可知，5組大鼠給予葡萄糖30 min時，血糖值均為最高。T2MD模型組大鼠血糖值極顯著高于對照組（P＜0.01），表明OGTT異常。LBP高劑量組大鼠的血糖值極顯著低于模型組（P＜0.01），并且在120 min時恢復(fù)正常水平。這表明LBP可極顯著抑制大鼠OGTT造成的血糖值的升高（P＜0.01）。由圖4可知，模型組AUC極顯著高于對照組（P＜0.01），LBP三組的AUC顯著低于模型組（P＜0.05或P＜0.01），表明LBP能明顯改善T2MD大鼠的葡萄糖耐受，并且可以快速降低餐后血糖。

圖3 LBP對T2MD大鼠口服糖耐量的影響

圖4 LBP對T2MD大鼠AUC的影響

2.2.6 LBP對T2MD大鼠血清中氧化應(yīng)激水平的影響

由圖5可知：與對照組相比，T2MD模型組大鼠血清中的SOD、CAT、GSH水平極顯著降低（P＜0.01），MDA水平極顯著升高（P＜0.01），說明模型組大鼠出現(xiàn)了氧化應(yīng)激狀態(tài)。與模型組相比，LBP低劑量組大鼠的SOD活性顯著升高（P＜0.05），LBP中劑量和高劑量組極顯著升高（P＜0.01），LBP低、中、高劑量組大鼠的CAT和GSH水平均極顯著升高（P＜0.01），LBP中劑量組和高劑量組極顯著降低了MDA水平（P＜0.01）。結(jié)果表明，LBP可以較好地改善T2MD大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

圖5 LBP對T2MD大鼠血清氧化應(yīng)激水平的影響

2.2.7 LBP對T2MD大鼠Ins水平的影響

由圖6可知，與對照組相比，模型組大鼠的Ins水平極顯著降低（P＜0.01），表明大鼠胰島β細(xì)胞功能被破壞，產(chǎn)生了胰島素抵抗[17]。與模型組相比，LBP三組大鼠的Ins水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），其中LBP高劑量組大鼠的Ins水平為模型組大鼠的1.54倍，接近對照組水平，恢復(fù)了胰島的功能水平。

圖6 LBP對T2MD大鼠Ins水平的影響

3 結(jié)論

在此LBP體外降血糖活性研究中，LBP可以降低α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性，對其有一定的抑制作用，在LBP濃度為6 mg/mL時，其對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的抑制率分別達(dá)到92.59%±0.47%和92.09%±0.21%，具有良好的降血糖活性。在動物試驗中，與模型組相比，LBP組T2MD大鼠的體質(zhì)量和飲水量有明顯的改善。經(jīng)LBP干預(yù)，LBP組大鼠的空腹血糖值明顯低于模型組，120 min后FBG趨于正常，Ins水平明顯升高，表明LBP對T2MD大鼠有明顯的降血糖活性。LBP干預(yù)后的大鼠血清中SOD、CAT和GSH水平均明顯高于模型組，有效改善了T2MD大鼠的氧化應(yīng)激水平，使其能夠有效避免胰島β細(xì)胞受損，進(jìn)而防止T2MD的發(fā)生。綜上，LBP具有預(yù)防或改善T2MD的作用。