宮慧，張藝藍(lán)，劉政，王會

錦州醫(yī)科大學(xué)食品與健康學(xué)院（錦州 121001）

肺癌是一種嚴(yán)重危害人群身體健康的且有很高死亡率的疾病，目前居我國癌癥死亡的第一位[1]。從天然植物中尋找高效、低毒、安全的抗肺癌藥物是目前抗癌研究的熱點(diǎn)。根皮素（Phloretin）在自然界中廣泛存在于草莓、梨、蘋果等水果的根皮與果皮中，是一種帶有二氫查耳酮結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物，化學(xué)結(jié)構(gòu)中存在多個羥基，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示。根皮素具有多種生物學(xué)活性，能夠抑制皮膚中黑色素生成和聚合，具有增白效果[2-3]，能夠清除生物體內(nèi)自由基，具有抗氧化功能[4]，能夠調(diào)節(jié)血管的張力，具有保護(hù)血管作用[5]。根皮素具有對前列腺癌、乳腺癌、消化道腫瘤等多種腫瘤的抑制作用[6-8]，目前有關(guān)根皮素對肺癌細(xì)胞增殖及凋亡的研究較為少見。此試驗(yàn)研究了根皮素對肺癌細(xì)胞A549的增殖及凋亡的影響，為進(jìn)一步研究根皮素誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制提供試驗(yàn)依據(jù)。

圖1 根皮素的結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人肺癌A539細(xì)胞（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)所遺傳資源實(shí)驗(yàn)室）；根皮素（純度≥99.99%）、喜樹堿（純度≥98.0%）：Sigma公司；胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基（美國GIBCO有限公司）；碘化丙啶（propidium iodide，PI，美國Sigma公司）；Fluo-3/AM（美國Invitrogen公司）；JC-1探針、Annexin V-TIC Apoptosis Density試劑盒（美國BD有限公司）。

Multiskan FC酶標(biāo)儀（美國Thermo fisher公司）；BB15 CO2培養(yǎng)箱（德國Heraeus公司）；FC-500流式細(xì)胞儀（美國Beckman公司）；IX-71倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

A549細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）中，培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、5% CO2、飽和濕度。使用0.25%的胰酶對匯合度為70%～80%細(xì)胞進(jìn)行消化后按1∶2或1∶3的比例傳代培養(yǎng)。

1.2.2 藥物配制

使用二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解喜樹堿和根皮素配制成儲備原液，于-20 ℃保存。進(jìn)行試驗(yàn)時，儲備原液分別溶解于DMEM培養(yǎng)基中（DMSO終濃度小于0.05%），使得培養(yǎng)基中根皮素質(zhì)量濃度分別為10，20，40和80 μg/mL，喜樹堿質(zhì)量濃度分別為6，12和24 μg/mL。

1.2.3 細(xì)胞毒性分析

將常規(guī)消化細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞（濃度為3×104個/mL）接種于96孔培養(yǎng)板，每孔180 μL。在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)入對數(shù)生長期之后，分別換用含有10，20，40和80 μg/mL根皮素的培養(yǎng)基培養(yǎng)，并設(shè)有空白對照組（含終濃度為 0.05% DMSO的培養(yǎng)基處理）和陽性對照組（分別用6，12和24 μg/mL喜樹堿處理），每組設(shè)5個復(fù)孔。培養(yǎng)時間分別為12，24，36和48 h，每孔添加20 μL 5 mg/mL的3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出孔中的液體。將200 μL DMSO注入96孔板的每個孔中，采用酶標(biāo)儀測定吸光度，波長設(shè)置為490 nm。

1.2.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

在六孔板中接種細(xì)胞懸液，密度為3.0×105個/孔，待細(xì)胞貼壁進(jìn)入對數(shù)生長期，每孔分別用含10，20，40和80 μg/mL根皮素的培養(yǎng)基處理細(xì)胞24 h，同時設(shè)置空白對照組（用含濃度為0.5% DMSO的培養(yǎng)基處理）和陽性對照組（24 μg/mL喜樹堿處理細(xì)胞）。倒置相差顯微鏡觀察。

1.2.5 Annexin V-FITC及PI 染色測定凋亡率

采用常規(guī)方法收集處理組（根皮素處理質(zhì)量濃度10，20，40和80 μg/mL）、陽性對照組（喜樹堿處理質(zhì)量濃度27.84 μg/mL）及空白對照組（用含濃度0.5%DMSO的培養(yǎng)基處理）分別處理12，24，36和48 h的細(xì)胞，稀釋細(xì)胞使其濃度為5.0×105細(xì)胞/樣品，每個樣品加入100 μL緩沖液重懸，同時加入5 μL AnnexinVFITC及5 μL PI，混勻。避光孵育15 min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀定量檢測。

1.2.6 細(xì)胞周期檢測

采用常規(guī)方法收集處理組（根皮素處理質(zhì)量濃度10，20，40和80 μg/mL）及空白對照組（用含濃度0.5% DMSO的培養(yǎng)基處理）處理24 h的細(xì)胞，稀釋細(xì)胞使其濃度為5.0×105細(xì)胞/樣品，在4 ℃條件下用70%無水乙醇處理細(xì)胞12 h。經(jīng)PBS漂洗，加入0.5 mL PI染液處理8 min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.7 線粒體膜電位檢測

采用常規(guī)方法收集處理組（根皮素處理質(zhì)量濃度10，20，40和80 μg/mL）及空白對照組（用含濃度0.5% DMSO的培養(yǎng)基處理）處理24 h的細(xì)胞，稀釋細(xì)胞使其濃度為5.0×105細(xì)胞/樣品，加入0.5 mL JC-1染液，于37 ℃孵育10 min，經(jīng)PBS洗滌、懸浮，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.8 細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的測定

采用常規(guī)方法收集處理組（根皮素處理質(zhì)量濃度10，20，40和80 μg/mL及空白對照組（用含濃度0.5%DMSO的培養(yǎng)基處理）處理24 h的細(xì)胞，稀釋細(xì)胞使其濃度為5.0×105細(xì)胞/樣品。加入Fluo-3/Am（終濃度為7 μmol/L），于37 ℃孵育25 min，設(shè)置陰性對照（無Fluo-3/Am處理）。經(jīng)PBS漂洗、重懸，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，正態(tài)計量數(shù)據(jù)用“X±S”表示，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞毒性分析

MTT法是細(xì)胞毒性分析的經(jīng)典方法，可以準(zhǔn)確檢測細(xì)胞存活和增殖情況。A490值反映活細(xì)胞數(shù)量，A490值小指示活細(xì)胞少。根皮素對A549細(xì)胞生長的影響如表1所示。根皮素處理細(xì)胞12 h，處理組與空白對照組比較，80 μg/mL處理組A490值減小，差異顯著（P＜0.05）。40 μg/mL處理組A490值大于20 μg/mL處理組，組間比較差異不顯著，20 μg/mL處理組A490值大于10 μg/mL處理組，組間比較差異不顯著，推測出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是12 h處理時間內(nèi)兩個濃度的根皮素未對細(xì)胞產(chǎn)生差異的毒性影響。根皮素處理細(xì)胞24 h，40和80 μg/mL處理組與空白對照組比較，A490值減小，差異顯著（P＜0.05）。根皮素處理細(xì)胞36、48 h，20，40，80 μg/mL處理組分別與空白對照組相比，A490值均減小，差異極顯著（P＜0.01）。在相同處理時間，隨著處理組濃度增大其A490值逐漸減小，指示活細(xì)胞數(shù)下降，呈現(xiàn)濃度相關(guān)性。喜樹堿處理的陽性對照組細(xì)胞A490值也呈現(xiàn)量效關(guān)系。根皮素處理組與陽性對照組比較，具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，為凋亡作用研究奠定基礎(chǔ)。

表1 根皮素對A549細(xì)胞生長的影響（，n=3）

表1 根皮素對A549細(xì)胞生長的影響（，n=3）

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

對照組細(xì)胞貼壁生長，胞體飽滿、排列緊密，立體感、折光度好，邊緣清晰。80 μg/mL根皮素處理組胞體皺縮，出現(xiàn)空泡，胞間連接消失，出現(xiàn)細(xì)胞碎片，部分細(xì)胞表現(xiàn)出凋亡晚期甚至壞死特征。陽性對照喜樹堿24 μg/mL處理組細(xì)胞凋亡情況與根皮素80 μg/mL處理組相近（圖2）。

圖2 根皮素處理細(xì)胞A549 48 h細(xì)胞形態(tài)（40×）

2.3 細(xì)胞凋亡率的測定

應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記法定量分析細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞經(jīng)處理12 h，40和80 μg/mL根皮素處理組與空白對照組相比，凋亡率增高，差異極顯著（P＜0.01）。細(xì)胞處理24和36 h時，20 μg/mL根皮素處理組與空白對照組比較，凋亡率上升，差異顯著（P＜0.05）。40和80 μg/mL根皮素處理組與空白對照組相比，凋亡率上升，差異極顯著（P＜0.01）。細(xì)胞處理48 h時，20，40和80 μg/mL根皮素處理組與空白對照組相比，凋亡率上升，差異極顯著（P＜0.01）。根皮素濃度和凋亡率之間呈濃度依賴性。各處理時長的80 μg/mL根皮素處理組凋亡率小于陽性對照喜樹堿24 μg/mL處理組（表2），根皮素表現(xiàn)出良好的誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的作用。

表2 根皮素處理A549細(xì)胞凋亡率（，n=3）單位：%

表2 根皮素處理A549細(xì)胞凋亡率（，n=3）單位：%

2.4 細(xì)胞周期檢測

細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動的重要事件之一，其時相紊亂會影響細(xì)胞增殖進(jìn)程從而擾亂生命活動，藥物對細(xì)胞周期的影響具有時相特異性。此研究通過PI標(biāo)記結(jié)合流式細(xì)胞法測定細(xì)胞周期的變動，結(jié)果顯示，根皮素作用細(xì)胞24 h，20 μg/mL根皮素處理組和空白對照組相比，在G1期細(xì)胞中的數(shù)目增加，差異顯著（P＜0.05）。處于S期細(xì)胞的數(shù)目減少，差異顯著（P＜0.05）。40和80 μg/mL根皮素處理組和空白對照組相比，在G1期細(xì)胞的數(shù)目增加，差異極顯著（P＜0.01）。處于S期細(xì)胞的數(shù)目減少，差異極顯著（P＜0.01）。80 μg/mL根皮素處理組與空白對照組相比，在G2期細(xì)胞的數(shù)目減少，差異極顯著（P＜0.01）。細(xì)胞在經(jīng)根皮素處理后周期停滯于G1期，從而阻滯了DNA合成，并呈現(xiàn)出劑量依賴性（表3）。

表3 根皮素處理A549細(xì)胞24 h，細(xì)胞周期的變化（，n=3）單位：%

表3 根皮素處理A549細(xì)胞24 h，細(xì)胞周期的變化（，n=3）單位：%

2.5 線粒體膜電位檢測

線粒體對細(xì)胞凋亡起著重要的作用，線粒體膜電位的降低是細(xì)胞凋亡過程的早期事件。細(xì)胞經(jīng)根皮素處理24 h，20，40和80 μg/mL根皮素處理組與空白對照相比，線粒體膜電位降低差異極顯著（P＜0.01）（表4）。根皮素處理濃度與線粒體膜電位呈現(xiàn)量效關(guān)系。

表4 根皮素處理A549細(xì)胞24 h，線粒體膜電位變化（，n=3）

表4 根皮素處理A549細(xì)胞24 h，線粒體膜電位變化（，n=3）

2.6 細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子測定

鈣離子作為第二信使影響細(xì)胞的增殖、死亡等一系列生命現(xiàn)象，細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子被認(rèn)為可以啟動細(xì)胞凋亡。細(xì)胞經(jīng)根皮素作用24 h，10 μg/mL根皮素處理組與空白對照比較，胞內(nèi)游離鈣離子濃度升高差異顯著（P＜0.05）。20，40和80 μg/mL根皮素處理組與空白對照比較，胞內(nèi)游離鈣離子濃度升高，差異極顯著（P＜0.01）（表5）。根皮素處理濃度與胞內(nèi)游離鈣離子濃度呈現(xiàn)量效關(guān)系。

表5 根皮素處理A549細(xì)胞24 h，胞內(nèi)Ca2+濃度的變化（，n=3）

3 討論與結(jié)論

多基因調(diào)控失調(diào)使得細(xì)胞增殖失控和凋亡受阻是腫瘤的發(fā)生和發(fā)展的本質(zhì)。細(xì)胞凋亡是生物體在生理或病理情況下，為了維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，由基因控制的自發(fā)性的有序的細(xì)胞死亡。對凋亡機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，引起癌癥細(xì)胞凋亡是防治癌癥的有效手段之一。根皮素是一類有抑制癌細(xì)胞增殖潛力的類黃酮物質(zhì)，可誘發(fā)癌細(xì)胞凋亡[9]。

先前研究表明根皮素可以抑制肝癌細(xì)胞增殖，且抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性[10-11]，此研究表明與先前研究相似，根皮素抑制肺癌細(xì)胞A549生長，并呈現(xiàn)濃度依賴性，凋亡率測定結(jié)果與細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析及細(xì)胞毒性研究結(jié)果一致。

研究表明細(xì)胞無限增殖、惡性轉(zhuǎn)化是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的原因之一[12]，因此，利用藥物影響細(xì)胞周期進(jìn)程抑制細(xì)胞增殖、促使細(xì)胞凋亡是抗癌癥作用的突破口之一。研究結(jié)果表明：根皮素使得A549細(xì)胞周期進(jìn)程發(fā)生改變，細(xì)胞停滯在G1期，導(dǎo)致細(xì)胞無法進(jìn)入S期與G2期，細(xì)胞分裂受阻，發(fā)生凋亡作用。先前研究表明，根皮素可以干預(yù)白血病K562細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖，從而引起白血病細(xì)胞的凋亡[13]。

線粒體是能夠進(jìn)行氧化磷酸化的半自主性細(xì)胞器，是細(xì)胞的能量工廠，線粒體功能對細(xì)胞乃至整個機(jī)體具有重要意義。線粒體和細(xì)胞凋亡之間存在著密切的關(guān)聯(lián)，其功能失調(diào)可引發(fā)細(xì)胞凋亡，如膜電位的降低就導(dǎo)致了膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔打開，這也是細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)中較早出現(xiàn)的生物化學(xué)反應(yīng)，此后，線粒體中的細(xì)胞色素C，凋亡誘導(dǎo)因子如AIF等進(jìn)入胞質(zhì)，便開啟了凋亡過程[14]。根皮素是一類解偶聯(lián)劑，能夠控制線粒體的氧化磷酸化過程，ATP合成被干擾，無法產(chǎn)生能量，從而導(dǎo)致細(xì)胞壞死[15]。文章中線粒體膜電位檢測結(jié)果表明，根皮素作用A549細(xì)胞使得線粒體膜電位下降，且根皮素處理濃度與線粒體膜電位下降呈現(xiàn)量效關(guān)系。

在生理狀態(tài)下胞內(nèi)大部分Ca2+與蛋白質(zhì)結(jié)合形成結(jié)合鈣，存在線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，只有很少一部分游離Ca2+。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時結(jié)合鈣轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞xCa2+作為第二信使，在機(jī)體生命活動的細(xì)胞的反應(yīng)、基因的表達(dá)等多方面發(fā)揮重要作用，游離Ca2+的大量聚集是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡發(fā)生的原因之一[16]。

此研究結(jié)果顯示，當(dāng)根皮素處理A549細(xì)胞時，胞內(nèi)游離Ca2+濃度增多，鈣穩(wěn)態(tài)被打破，根皮素誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生了凋亡作用。同時檢測到線粒體膜電位下降，推斷胞質(zhì)內(nèi)游離Ca2+來源之一為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)結(jié)合鈣，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，根皮素可抑制肺癌A549細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制可能為打破正常的細(xì)胞周期進(jìn)程與鈣離子穩(wěn)態(tài)從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的。