李倩，孫勇康，安瓊，王貞香，張振，梁艷婷

河西學院醫(yī)學院，甘肅省河西走廊特色資源利用重點實驗室（張掖 734000）

自由基是機體內(nèi)正常的物質(zhì)代謝所產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物[1]，化學性質(zhì)極為活潑，氧化性強，體內(nèi)蓄積會氧化蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸，導致細胞膜受損，引起心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)疾病[2]，并加速衰老，直至死亡[3]?？寡趸瘎┛山档妥杂苫幕钚?，通過有效清除自由基起到預(yù)防疾病的目的[4]。因此，從天然產(chǎn)物中開發(fā)安全、綠色的抗氧化組分，并將其應(yīng)用于醫(yī)療、保健品、食品等，成為當前研究的熱點[5]。查閱文獻，目前常用的天然抗氧化劑主要來自包括黃酮、多酚和糖類等代謝產(chǎn)物[3]。

苜蓿（Medicago sativaL.）是豆科苜蓿屬的通稱，為多年生草本植物，是一種被世界各國公認的可持續(xù)發(fā)展的綠色能源。苜蓿具有蛋白質(zhì)種類豐富、能適應(yīng)各種不同的生長環(huán)境、產(chǎn)量高、再生快等優(yōu)點[6-7]，是優(yōu)良的豆科飼料，在很多國家作為牧草大量種植，有著“牧草之王”的美稱[8]。苜蓿的地上部分富含多種有益于人類健康的營養(yǎng)成分，主要包括黃酮類、多糖、皂苷類、香豆素類、氨基酸以及其他活性成分[9-11]。研究表明，苜蓿具有抗氧化、抗動脈粥樣硬化、消炎、降血脂、增強免疫力等多種功效[12-13]，是極具發(fā)展前景的植物。但目前對苜蓿不同極性部位的黃酮類、酚類和多糖類含量的測定及抗氧化活性的研究很少報道。

我國的苜蓿資源雖然十分豐富，但目前主要是作為動物飼料，應(yīng)用在農(nóng)業(yè)與畜牧業(yè)方面，并未得到充分開發(fā)與利用，且市面上可以見到的苜蓿類功能食品也十分少[14]。如果把苜蓿應(yīng)用于食品，不僅可以增加市面上的功能食品的類型，也將大大增加苜蓿的利用價值。此研究首次對苜蓿不同極性部位的活性成分及抗氧化活性進行分析，為以后進一步開發(fā)苜蓿資源，充分挖掘天然抗氧化產(chǎn)品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苜蓿（2023年4月份采自甘肅省天水市秦州區(qū)），經(jīng)河西學院張勇教授鑒定為豆科苜蓿屬的紫花苜蓿。

蘆丁標準品（博美生物科技，LC202007）；沒食子酸標準品（上海源葉，C17D10C105997）；葡萄糖標準品（致遠化學試劑，20211101810）；無水乙醇（利安隆博華醫(yī)藥化學公司，20230113）；石油醚（致遠化學試劑，2019091062）；乙酸乙酯（致遠化學試劑，2019091042）；正丁醇（致遠化學試劑，2019092085）；福林酚（上海源葉，F(xiàn)15IS207169）；萘酚（上海麥克林生化科技，C14490323）；苯酚（成都科隆化學品，2021032301）；硝酸鋁（成都科隆化學品，2021060403）；亞硝酸鈉（天津百世化工，20200603）；鎂粉（天津大茂化學試劑廠，20220701）；DPPH試劑（上海麥克林生物科技有限公司，C12998355）；ABTS試劑（上海麥克林生物科技有限公司，C12824507）；抗壞血酸（致遠化學試劑，20220303）。

1.2 設(shè)備與儀器

UV-2600紫外可見分光光度計（日本島津公司）；JC-QX-10L超聲波清洗器（青島聚創(chuàng)環(huán)保設(shè)備有限公司）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；PT-124/85S分析天平（福州華志科學儀器有限公司）；SY-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.3 研究方法

1.3.1 制備苜蓿醇提物不同極性部位

參考劉學貴等[15]紫花苜蓿提取物的方法。將200 g苜蓿粗粉，在70%乙醇、80 ℃、2 h、提取次數(shù)2次、料液比1∶10（g/mL）的提取條件下回流提取，將提取液進行合并、過濾，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濾液減壓濃縮至無醇味，將得到的溶液進一步濃縮。將濃縮到一定程度的溶液以1∶3混合于蒸餾水中，以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇為溶劑，按極性由小到大的順序等量萃取7次，得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位。

1.3.2 不同極性部位黃酮類、酚類、糖苷的鑒別

取石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位溶液各1 mL于試管中，備用。根據(jù)標準方法對植物粗提物進行植物化學評估，通過顏色的變化以確定是否存在黃酮類、多酚類和糖苷[3,16-18]。

1.3.2.1 黃酮類

在供試品溶液中加入適量鎂粉，振搖之后加入幾滴濃鹽酸，1～2 min之后觀察顏色變化。若含有黃酮類物質(zhì)，溶液一般顯紅色到紫紅色，個別顯藍或綠。

1.3.2.2 酚類

在供試品溶液中加入少量FeCl3溶液，若有藍紫或紫紅色出現(xiàn)，表明該溶液中有酚類物質(zhì)的存在。

1.3.2.3 糖苷

在供試品溶液中加入0.2 mL的乙醇-萘酚（20%）溶液，混勻，沿試管壁緩緩加入2 mL濃硫酸，試管中的溶液分成2層，在兩層的交界處出現(xiàn)紫紅色環(huán)，則說明有糖苷的存在[19]。

1.3.3 蘆丁標準曲線的制備

參考江春陽等[20]繪制蘆丁標準曲線的方法，精確稱取10.89 mg的蘆丁標準品，置于25 mL的容量瓶中，以60%乙醇溶于其中，定容至刻度，分別取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9和1.0 mL蘆丁標準品的溶液，放入10 mL容量瓶中，各加入0.9 mL亞硝酸鈉溶液（5%），振搖使其混合均勻，放置3 min，再加入0.6 mL硝酸鋁溶液（10%），振搖使其混合均勻，4 min后加入4.8 mL氫氧化鈉溶液（4%），用60%的乙醇定容至刻度線，混勻，放置11 min。用蒸餾水作為空白對照，在波長510 nm處測吸光度，平行3次，取平均值。以吸光度為縱坐標，蘆丁對照品溶液的濃度為橫坐標，制作標準曲線，得到回歸方程：Y=0.012 3X+0.001 1，R2=0.999 4，濃度和吸光度線性關(guān)系良好，可用于黃酮含量的測定。

1.3.4 沒食子酸標準曲線的制備

參考譚曉舒等[21]繪制沒食子酸標準曲線的方法。精確稱取12.18 mg沒食子酸標準品置于10 mL容量瓶中，以蒸餾水溶解并定容到刻度，精密量取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7和0.8 mL放入不同的棕色容量瓶中，將溶液稀釋并定容至刻度，再分別精密量取0.7 mL不同濃度的沒食子酸對照品溶液放入不同試管中，每個試管中加入2.5 mL 0.1 mol/L的福林酚溶液，10 min后量取2.5 mL 7%的碳酸鈉溶液加入各個試管中，將其放在暗處，避光反應(yīng)1 h。用對應(yīng)試劑作為空白對照，在波長765 nm處測吸光度，平行3次，取平均值。將吸光度作為縱坐標，沒食子酸對照品溶液濃度作為橫坐標，繪出標準曲線，得到回歸方程：Y=0.012 5X-0.002 7，R2=0.999 4，濃度和吸光度線性關(guān)系良好，可用于多酚含量的測定。

1.3.5 葡萄糖標準曲線的制備

參考李蕭娜等[22]繪制葡萄糖標準曲線的方法。精確稱取10.66 mg葡萄糖標準品，置于100 mL容量瓶內(nèi)，用蒸餾水定容至刻度，精密量取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4和1.6 mL的葡萄糖標準品溶液于試管中，補加蒸餾水至2 mL各試管中再分別加入1 mL 5%的苯酚溶液和5 mL濃硫酸，室溫下放置10 min，沸水浴20 min，冷卻至室溫。用對應(yīng)的試劑作空白對照，于490 nm波長處測吸光度，平行3次，取平均值。以吸光度作為縱坐標，葡萄糖對照品溶液濃度作為橫坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程：Y=0.060 8X-0.004 5，R2=0.999 6，濃度和吸光度線性關(guān)系良好，可用于糖含量的測定。

1.3.6 不同極性部位成分的含量測定

根據(jù)對各極性部位成分鑒別的結(jié)果，使用可見分光光度法測定不同極性部位所含黃酮、酚酸和糖的濃度，并按式（1）計算苜蓿各成分質(zhì)量（%）。

式中：C為根據(jù)標準曲線計算得到的質(zhì)量濃度，μg/mL；D為稀釋倍數(shù)；V為萃取液體積，mL；M為苜蓿質(zhì)量，g。

1.3.7 抗氧化活性檢測

將2.1小節(jié)中得到的不同極性部位的提取物溶液濃縮成浸膏。將各極性部位的浸膏配制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的溶液，精密量取0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 mL配制好的提取物溶液，置于5 mL的容量瓶中，將其稀釋定容至刻度，備用。配制5 mg/mL的維生素C溶液，作為陽性對照組。精密量取0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 mL維生素C對照品溶液，放入5 mL的容量瓶中，定容至刻度線，備用。

1.3.7.1 ABTS自由基清除能力測定

ABTS工作液：準確量取5.0 mL 7.0 mmoL/L的ABTS溶液，5.0 mL 2.45 mmoL/L的過硫酸鉀水溶液，將其混勻，在室溫下，放置在黑暗處反應(yīng)12～16 h后，用無水乙醇進稀釋，當它在波長734 nm處測定的吸光度為0.70±0.03時，停止稀釋，該溶液可以進行抗氧化活性試驗。

參考劉敏卓等[23]的體外抗氧化活性分析方法。取0.1 mL的不同濃度的不同極性部位溶液與不同濃度的維生素C對照品溶液，分別加入0.9 mL的ABTS工作液，振搖，混均，于30 ℃水浴5 min。在波長734 nm處測定吸光度。平行3次，求平均值。ABTS自由基清除率按式（2）計算。

式中：A0為0.1 mL無水乙醇溶液+0.9 mL ABTS工作液的吸光度；A1為0.1 mL供試品溶液+0.9 mL ABTS工作液的吸光度。

淮河流域多年平均降水量的地區(qū)分布很不均勻，大致從流域東南部向西北部遞減，而地表徑流的分布受地形的影響，在地域上變化幅度較大。因為水資源的稟賦與旱災(zāi)的形成具有密切的關(guān)系，因此，在進行干旱分區(qū)時應(yīng)將該因素納入考慮范疇。

1.3.7.2 DPPH自由基清除能力測定

參考陳建雙等[24]的方法。量取0.2 mL的不同濃度的不同極性部位溶液、不同濃度的維生素C對照品溶液，在各個溶液中分別加入0.2 mL DPPH溶液，振搖使其混合均勻，在室溫下暗處放置30 min。在517 nm波長處測定吸光度，平行3次，取平均值。DPPH自由基清除率按式（3）計算。

式中：A0為無水乙醇和DPPH各0.2 mL混勻后溶液的吸光度；A1為供試品溶液和DPPH溶液各0.2 mL混勻后溶液的吸光度。

1.3.7.3 羥自由基清除能力測定

參考陳建雙等[24]的方法。分別取1.0 mL H2O2（8.8 mmol/L）、FeSO4（10.0 mmol/L）和水楊酸（10.0 mmol/L，溶于無水乙醇），放入37±2 ℃水浴中，加入1.0 mL待測樣品，再加入1.0 mL H2O2用以啟動反應(yīng)，計時30 min，反應(yīng)結(jié)束后，迅速將反應(yīng)液放置于波長510 nm處測定吸光度，并以蒸餾水代替樣品作空白對照。羥自由基清除率按式（4）計算。

式中：A1為供試品溶液+試劑的吸光度；A0為蒸餾水+試劑的吸光度。

1.3.7.4 鐵離子還原能力測定

參考徐晨晨等[25]的測定方法。取不同濃度的不同極性部位溶液與不同濃度的維生素C對照品溶液各1.0 mL，加入1%的鐵氰化鉀、PBS緩沖液（pH 6.6）各1 mL，在50 ℃的水浴中靜置20 min，快速冷卻后加入1.0 mL 10%的三氯乙酸溶液，混勻后按3 000 r/min離心10 min，取1 mL的上清液，加入等體積的蒸餾水和0.05%三氯化鐵，混勻，在波長700 nm處測吸光度，平行3次，取平均值。一定程度上吸光度與還原能力呈正比?？傔€原能力（A）按式（5）計算。

式中：A1為加入樣品后的吸光度；A0為溶劑本身的吸光度。吸光度越大，表明該樣品還原能力越強。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同極性部位黃酮類、酚類、糖苷的鑒別結(jié)果

鹽酸-鎂粉是最常見的鑒別黃酮的反應(yīng)之一，大部分黃酮、黃酮醇、二氫黃酮及二氫黃酮醇類化合物在鹽酸-鎂粉體系中會顯橙紅到紫紅色，還有少數(shù)顯紫～藍色，而且當B環(huán)上存在—OH取代時，顏色變化會更加明顯。試驗結(jié)果顯示，石油醚部位顯示出綠色，在乙酸乙酯部位顯示出紅色，表明黃酮主要分布在石油醚部位和乙酸乙酯部位。

大多數(shù)具有羥基和SP2雜化的碳原子結(jié)構(gòu)的化合物（碳碳雙鍵上的碳原子）都能與三氯化鐵溶液發(fā)生顯色反應(yīng)。酚羥基直接連在芳環(huán)上，相當于烯醇結(jié)構(gòu)，所以也可以與三氯化鐵溶液發(fā)生顯色反應(yīng)。試驗結(jié)果顯示，乙酸乙酯部位和正丁醇部位出現(xiàn)了明顯的紫紅色，表明酚類主要分布于乙酸乙酯部位和正丁醇部位。

硫酸-萘酚反應(yīng)可以識別提取物中的糖，在濃硫酸或濃鹽酸的作用下，糖類脫水形成糠醛及其衍生物，后者與α-萘酚反應(yīng)生成紫紅色絡(luò)合物，在含有糖的溶液和濃硫酸溶液的液面交界處形成紫紅色環(huán)。Molisch反應(yīng)是鑒別糖的最常見的反應(yīng)。試驗結(jié)果顯示，在水部位與石油醚部位出現(xiàn)了紫紅色環(huán)，表明糖主要分布在水部位與石油醚部位部位。

2.2 不同極性部位成分的含量測定

不同極性部位黃酮、酚酸和糖的含量測定結(jié)果如表1所示。

表1 不同極性部位黃酮、酚酸和糖的含量

由蘆丁標準曲線可得，黃酮在乙酸乙酯部位濃度最高為0.144 6 mg/mL，水部位濃度最低為0.067 1 mg/mL，由公式（1）可知，黃酮在乙酸乙酯部位含量為0.100 4%，在水部位含量為0.077 3%。

由沒食子酸標準曲線可得，酚類在乙酸乙酯部位和正丁醇部位的濃度為2.697 5和2.574 9 mg/mL，由公式（1）可知，多酚在乙酸乙酯部位和正丁醇部位的含量為3.117 5%和2.975 1%。

由葡萄糖標準曲線可得，糖類在水部位的濃度為1.154 2 mg/mL，在石油醚部位濃度為1.069 9 mg/mL。由公式（1）可知，糖類在水部位含量為1.334 4%，在石油醚部位的含量為1.236 2%。

2.3 抗氧化活性測定

2.3.1 ABTS自由基清除率

ABTS+是被用來測定純度較高的物質(zhì)或水溶液的總抗氧化能力的基礎(chǔ)。ABTS會被一些氧化劑氧化，如MnO2或H2O2等試劑，生成呈現(xiàn)藍綠色的自由基陽離子ABTS+。在一些可以提供電子的抗氧化劑（如酚類物質(zhì)）存在的情況下，則生成沒有顏色的ABTS[26]。采用過硫酸鉀氧化法制備的ABTS+，這種自由基的強吸收出現(xiàn)在波長734 nm附近。苜蓿不同極性部位萃取液對ABTS自由基的清除率結(jié)果見圖1。石油醚部位的清除能力最低，乙酸乙酯與正丁醇部位清除能力高于石油醚部位，都比對照品維生素C的清除率低，隨著濃度的增大，乙酸乙酯部位與正丁醇部位的清除能力越來越接近。水相部位在濃度低于2.986 2 mg/mL時，清除能力低于對照品維生素C的清除能力，隨著濃度逐漸增大，水部位的清除能力也逐漸升高，超過了對照品VitC的自由基清除能力，并在濃度大于2.986 2 mg/mL時，上升趨勢逐漸趨于平緩。水相、正丁醇部位、乙酸乙酯部位、石油醚部位清除能力相比：水＞正丁醇＞乙酸乙酯＞石油醚。

圖1 苜蓿醇提取物不同極性部位的ABTS清除率

2.3.2 DPPH自由基清除率

在乙醇溶液中，DPPH是一種相對穩(wěn)定的自由基，在乙醇溶液中顯紫紅色，添加抗氧化劑之后，DPPH自由基溶液的顏色從紫紅色變?yōu)辄S色[27]。孤對電子的強吸收出現(xiàn)在波長517 nm附近，孤對電子與自由基清除劑配對以后，吸收將會減弱或消失。吸收減弱的多少可以反映出自由基清除劑活性的高低，DPPH清除率越高，說明抗氧化能力越強。

苜蓿不同極性部位萃取液對DPPH自由基的清除率結(jié)果見圖2。石油醚組與乙酸乙酯組的清除能力基本無差異，正丁醇組清除率較強，但石油醚組，乙酸乙酯組，正丁醇組清除能力均低于對照品維生素C。水相部位在0.995 4 mg/mL的濃度時清除率低于對照品維生素C，1.990 8～3.981 6 mg/mL時高于對照品維生素C，4.997 mg/mL時清除率出現(xiàn)下降趨勢。水相、正丁醇部位、乙酸乙酯部位、石油醚部位清除能力相比：水＞正丁醇＞乙酸乙酯＞石油醚。

圖2 苜蓿醇提取物不同極性部位的DPPH清除率

2.3.3 羥自由基清除率

利用Fenton反應(yīng)先產(chǎn)生羥自由基：H2O2+Fe2+=·OH+H2O+Fe3+。若加入水楊酸，則羥自由基與水楊酸會反應(yīng)生成2.3-二羥基苯甲酸，在510 nm波長處有吸收峰。如果向反應(yīng)體系中加入能清除羥自由基的物質(zhì)，則羥自由基的生成就會減少，從而使有色化合物的生成量相應(yīng)減少[28]。采用固定反應(yīng)時間法，在波長510 nm處測量含被測物反應(yīng)液的吸光度，通過比較，判斷被測物質(zhì)清除羥自由基的能力。

苜蓿不同極性部位萃取液對羥基自由基清除率結(jié)果見圖3。石油醚組清除能力最低，乙酸乙酯組與正丁醇組清除能力接近，正丁醇組在0.995 4～1.990 8 mg/mL時，清除率呈下降趨勢，在1.990 8～4.977 mg/mL時為上升趨勢，在1.990 8 mg/mL時清除率低于乙酸乙酯組，水相的清除能力最高。水相、正丁醇部位、乙酸乙酯部位、石油醚部位清除能力相比：水＞正丁醇＞乙酸乙酯＞石油醚。

圖3 苜蓿醇提取物不同極性部位的羥自由基清除率

2.3.4 鐵離子還原能力測定

鐵氰化鉀的Fe3+被樣品的抗氧化作用還原成Fe2+（亞鐵氰化鉀），生成的Fe2+（亞鐵氰化鉀）進一步和Fecl3反應(yīng)，生成普魯士藍，在波長700 nm處有最大吸光度，因此測定此處吸光度值可以間接反映抗氧化劑的還原能力大小[3,29]，二者大小呈正比。

苜蓿不同極性部位萃取液對鐵離子還原能力結(jié)果見圖4。石油醚組與乙酸乙酯組的清除能力相近，正丁醇組抗氧化能力強于石油醚組和乙酸乙酯組，石油醚組、乙酸乙酯組、正丁醇組的鐵離子還原能力隨濃度的增大，上升的趨勢比較緩慢。水相的鐵離子還原能力隨濃度的增大，上升的趨勢較快。水相、正丁醇部位、乙酸乙酯部位、石油醚部位還原能力相比：水＞正丁醇＞乙酸乙酯＞石油醚。

圖4 苜蓿醇提取物不同極性部位的總還原能力

3 討論與結(jié)論

此研究采用了液-液萃取法，將苜蓿醇提物分為石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位。采用鹽酸-鎂粉法、三氯化鐵試劑和硫酸-萘酚反應(yīng)鑒別提取物中的黃酮類、酚類和糖。此研究結(jié)果表明，紫花苜蓿提取物各極性部位黃酮、多酚和糖類化合物的分布各不相同，其中乙酸乙酯部位含有黃酮和多酚類化合物最多，水部位含有糖類物質(zhì)最多。

通過測定苜蓿的不同極性部位對DPPH自由基、ABTS自由基、羥自由基清除能力和總還原能力，結(jié)果表明紫花苜蓿不同極性部位均具有抗氧化能力，且在所測范圍內(nèi)有計量相關(guān)性，其抗氧化能力強弱順序為水＞正丁醇＞乙酸乙酯＞石油醚，由此可見，紫花苜蓿抗氧化的活性成分集中在水部位，而糖類主要分布在水相中，提示糖是紫花苜?？寡趸闹饕煞?，而酚羥基是構(gòu)成多糖類化合物的主要基團之一，使其具備有效的抗氧化的能力[30]。另外，紫花苜蓿的抗氧化能力除了與活性物質(zhì)的含量有關(guān)，也可能受到其他因素的影響。本試驗通過萃取實現(xiàn)了紫花苜蓿醇提物中抗氧化成分的富集。

以上結(jié)果表明，紫花苜蓿各極性部位中活性成分差異較大，各部位抗氧化程度不同。此研究為苜蓿資源的進一步開發(fā)研究提供了理論支持，對天然抗氧化劑的開發(fā)提供更充分的理論依據(jù)。