向晨曦，付文軍，張陽陽 ，孫鶴，趙子旭，焦豫慧

1.信陽農(nóng)林學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院（信陽 464000）；2.信陽云尖茶葉有限公司（信陽 464000）

茶樹花是山茶科山茶屬茶樹開的花，含有大量黃酮類物質(zhì)及茶多酚等活性成分，具有解毒、降糖、延緩衰老、防癌抗癌、清除自由基、增強細胞活性、增強免疫力等作用[1-2]。作為一種優(yōu)質(zhì)的天然食品新資源，茶樹花以往通常被當作農(nóng)林廢棄物進行處置，造成資源的大量浪費[3]。茶樹花逐步受到各界廣泛關(guān)注，但其開發(fā)利用依然十分有限。

植物精油是植物芳香的精華，具有獨特的芳香氣味。它一般可以從植物的葉、根、花、莖、果實等部位獲得，成分復(fù)雜，由幾十到幾百種化合物組成，如醛類、酮類、酚類、酸類、萜類和芳香族化合物等，所含醛類、酚類、萜類等成分具有良好的抗氧化能力及抑菌活性。植物精油種類較多，關(guān)嘉文等[4]采用超聲波輔助索式抽提法提取柚皮精油，白玉潔等[5]對杉木精油進行提取和成分鑒定，劉勁蕓等[6]優(yōu)化超臨界CO2萃取滇紅玫瑰精油的提取工藝，此外還有陳皮精油[7]、薰衣草精油[8]、金盞花精油[9]等。關(guān)于茶樹花精油的研究主要集中在萃取工藝優(yōu)化和不同萃取方法對比等方面，而對茶樹花精油化學(xué)物質(zhì)分析和生理活性功能的研究較少。

試驗以信陽本地茶樹花為原料，經(jīng)過干燥、粉碎等預(yù)處理，運用索氏抽提的方法從信陽茶樹花中提取出精油，采用氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）分析鑒定其化學(xué)成分進行并進一步通過試驗分析茶樹花精油的抗氧化能力和抑菌能力，以期為茶樹花資源的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶樹花（河南茶樹花農(nóng)業(yè)科技有限公司茶基地）。

牛肉膏蛋白胨（YPD）、馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA），均為上海展云化工有限公司；叔丁基對苯二酚（TBHQ，上海染料研究所有限公司）；丁基羥基茴香醚（BHA，梯希愛上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司）；2,6-二叔丁基對甲酚（BHT，上海源葉生物科技有限公司）；ABTS自由基清除能力檢測試劑盒（索萊寶生物科技有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見分光光度計[A390，翱藝儀器（上海）有限公司]；雙人單面凈化工作臺（SW-CJ-1C，蘇州凈化設(shè)備有限公司）；生化培養(yǎng)箱（SHP，北京中興偉業(yè)世紀儀器有限公司）；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（7890A-7000B，美國安捷倫公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52CS，上海圣科儀器設(shè)備有限公司）；萬能粉碎機（FW100，無錫久平儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 茶樹花精油的提取

參考劉艷霞[10]、朱貝貝[11]采用的索氏抽提法，并稍作改進。稱取20 g經(jīng)過干燥粉碎的茶樹花粉末，用定性濾紙做成濾紙包放入提取管中，加入無水乙醇（與茶樹花粉末比例11∶1），進行加熱、回流提取，待回流4次后，回收提取瓶中的無水乙醇，回收結(jié)束后停止加熱，冷卻后倒入分液漏斗中進行萃取，待分液漏斗中的液體出現(xiàn)分層后收集上層較為清澈的液體，即為精油。

1.3.2 茶樹花精油的成分分析

采用GC-MS對茶樹花精油的成分組成進行檢測分析。稱取0.50 g樣品于20 mL頂空瓶內(nèi)，置于固相微萃取裝置上，插入萃取纖維頭，于50 ℃保溫萃取30 min，進行GC-MS分析。GC-MS參數(shù)：采用型號DB-5MS UI型號的毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），進樣口溫度200 ℃，不分流進樣，柱箱溫度50℃保持2 min，并以20 ℃/min升溫至240 ℃保持2 min，選擇高純氮氣為載氣，載氣流速1 mL/min，MS接口溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，燈絲電流35 mA，采用全掃描，掃描離子范圍（m/z）20～500。

1.3.3 茶樹花精油的抗氧化性分析

1.3.3.1 BHA標品、BHT標品、TBHQ標品溶液配制

分別稱取100，200，300，400和500 mg各樣品，在10 mL容量瓶中進行定容，同時用無水乙醇配制質(zhì)量濃度10，20，30，40和50 mg/mL的茶樹花精油備用。對不同質(zhì)量濃度的溶液進行IC50值的測定。

1.3.3.2 總還原力測定

參照李建芳等[12]、張玉龍等[13]的方法并略加修改。取2.5 mL磷酸緩沖液（0.2 mol/L，pH 6.6），將2.5 mL不同稀釋濃度的樣品提取液加入其中，將2.5 mL鐵氰化鉀溶液（1%）加入將其混合均勻，于50 ℃恒溫水浴中反應(yīng)20 min，冷卻后加入2.5 mL三氯乙酸溶液（10%）終止反應(yīng)，于離心機中以4 000 r/min離心10 min。取5 mL離心后得到的上清液，與0.5 mL三氯化鐵溶液（0.1%）、4 mL蒸餾水混合，靜置10 min后于700 nm處測吸光度A1，測定3次平行試驗?？傔€原力按式（1）計算。

式中：A為總還原力；A1為樣品吸光度；A0為空白對照。

1.3.3.3 ABTS+自由基清除能力測定

使用試劑盒進行茶樹花精油對ABTS+自由基清除能力的測定。以BHA、BHT、TBHQ作為陽性對照，將茶樹花精油、BHA、BHT、TBHQ用試劑盒中的提取液配制成10，20，30，40和50 mg/mL的待測液，備用。在EP管中依次加入各試劑，制成空白管、測定管、對照管、陽性對照管，充分混勻，室溫避光靜置6 min。將紫外分光光度計波長設(shè)置為405 nm，分別記為A空白，A測定，A對照和A陽性對照。測定3次平行試驗。ABTS+自由基清除能力按式（2）和（3）計算。

式中：DY為陽性對照的ABTS+自由基清除率，%；D為樣本的ABTS+自由基清除率，%。

1.3.3.4 DPPH自由基清除能力測定

參照金玉霞[14]、Liu等[15]的方法并稍作修改。將茶樹花精油用無水乙醇配成濃度不同的待測液（0，10，20，30，40和50 mg/mL），以BHA、BHT、TBHQ作為陽性對照。分別取2 mL待測液與4 mL DPPH溶液（0.1 mmol/L）混合，置于暗處反應(yīng)30 min，在517 nm處測其吸光度（A1），同時將2 mL樣品溶液與4 mL無水乙醇混合后進行吸光度（A2）的測定以及對4 mL DPPH溶液與2 mL無水乙醇混合后的吸光度（A0）進行測定。測定3次平行試驗。DPPH自由基清除率按式（4）計算。

1.3.4 茶樹花精油的抑菌試驗

1.3.4.1 菌懸液的制備

取活化好的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌接種于YPD固體培養(yǎng)基中，酵母菌接種于PDA固體培養(yǎng)基中。挑取長勢良好的供試菌單個菌落分別接種于50 mL無菌液體培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫振蕩過夜培養(yǎng)后將其濃度稀釋至106CFU/mL，置于4 ℃?zhèn)溆肹16]。

1.3.4.2 抑菌圈直徑的測定

受試樣品的制備：用無水乙醇作為溶劑配制精油樣品，最終配制成50 mg/mL的樣品溶液，配制濃度相同的慶大霉素溶液以無菌水（蒸餾水121 ℃滅菌20 min）為溶劑，將配制好的溶液裝瓶備用。

以生理鹽水為空白對照，并以慶大霉素和市面上已有的山茶花精油、薰衣草精油為陽性對照，取液體菌懸液0.2 mL在固體培養(yǎng)基中涂布均勻，凝固后將經(jīng)過滅菌的牛津杯均勻垂直地放在每個含菌培養(yǎng)基的表面并于杯內(nèi)加入100 μL的樣品溶液，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌培養(yǎng)皿在37 ℃下培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈的直徑；酵母菌培養(yǎng)皿在37 ℃下培養(yǎng)72 h后測量抑菌圈的直徑[17]。

1.3.4.3 最小抑菌濃度的測定

以液態(tài)營養(yǎng)瓊脂做空白對照，將茶樹花精油用無水乙醇分別配制成精油含量為5%，10%，15%，20%，25%，30%，35%和40%的溶液，取滅菌后的牛津杯垂直放置于各含菌培養(yǎng)皿中，并輕輕施加壓力，使得牛津杯與培養(yǎng)基接觸無空隙。在37 ℃下培養(yǎng)24 h后對金黃色葡萄球菌培養(yǎng)皿、大腸桿菌培養(yǎng)皿進行觀察，在37 ℃下培養(yǎng)72 h后對酵母菌培養(yǎng)皿進行觀察，測量各抑菌圈的大小，初次出現(xiàn)抑菌圈的濃度即為最小抑菌濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹花精油揮發(fā)性組分分析

茶樹花精油的揮發(fā)性組分及其相對含量見表1。根據(jù)NIST數(shù)據(jù)庫對揮發(fā)性組分進行定性和半定量分析，從索氏抽提法提取的茶樹花精油中共分離鑒定出18種化合物，主要包括5種醇類、3種脂肪酸類、3種烷烴類、3種酮類、2種萜烯類、1種醛類及1種酚類。鑒定成分中醇類占總含量的56.12%，占比最高；其次是脂肪酸類，占總含量的28.06%；再次是萜烯類，占總含量的12.82%。王娟等[18]采用超臨界CO2、亞臨界CO2和石油醚3種方法萃取茶樹花精油分別得到55，50和54種揮發(fā)性成分，主要包括苯乙酮、苯乙醇、α-苯乙醇、苯甲醇和氧化芳樟醇等，與此次研究的結(jié)果有所差異，這可能是與原料品種和提取方法等因素有關(guān)。

表1 茶樹花精油揮發(fā)性組分

在茶樹花精油揮發(fā)性組分中，相對含量最高的3種化合物依次是苯乙醇（26.09%）、棕櫚酸（17.93%）和氧化芳樟醇（13.21%）。苯乙醇多存在于玫瑰、香蕉、茉莉花等植物中，具有花香氣味，有良好的抗菌效果；而相關(guān)研究也表明脂肪酸類、萜烯類和酮類等化合物具有較強的抗氧化活性[19-20]。

2.2 茶樹花精油抗氧化性分析

2.2.1 總還原力

茶樹花精油的總還原力與質(zhì)量濃度的關(guān)系如圖1所示。吸光度越大，總還原力越強，也代表其具有的抗氧化能力越強。茶樹花精油的吸光度隨著質(zhì)量濃度的增加而增大，表明茶樹花精油的抗氧化能力隨著濃度增大而逐漸升高。在相同濃度下，陽性對照組TBHQ、BHT和BHA的抗氧化活性均高于茶樹花精油。質(zhì)量濃度50 mg/mL時，茶樹花精油、BHA、BHT和TBHQ的吸光度分別為0.31，2.04，2.41和2.54。從抗氧化活性隨著質(zhì)量濃度變化的趨勢可知，隨著樣品濃度增加，茶樹花精油抗氧化能力增加速率顯著低于陽性對照組BHA、BHT和TBHQ，其中TBHQ的總抗氧化活性最強。陳少澤等[19]研究發(fā)現(xiàn)蛋黃油抗氧化性與油酸等不飽和脂肪酸含量呈正相關(guān)，因此茶樹花精油表現(xiàn)出的抗氧化能力可能是由于其組分中醇類、脂肪酸類和萜烯類化合物含量較高。

2.2.2 ABTS+自由基清除能力

由圖2可知，茶樹花精油對ABTS+自由基具有一定清除能力。在相同濃度下茶樹花精油對ABTS+自由基清除率低于陽性對照組BHA、BHT、TBHQ，但隨著茶樹花精油質(zhì)量濃度的增大，其對ABTS+自由基清除能力逐漸增強，二者表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。質(zhì)量濃度50 mg/mL時，茶樹花精油對ABTS+自由基清除率為53.18%，而在同濃度下測得的BHA、BHT、TBHQ對ABTS+自由基的清除率分別達到62.34%，67.73%和70.11%。IC50值是半抑制濃度，指自由基清除率50%時對應(yīng)的質(zhì)量濃度，該值越小表明其對ABTS+自由基清除能力越強[21]。茶樹花精油、BHA、BHT、TBHQ對ABTS+自由基的IC50值分別為48.47，36.13，29.69和26.03 mg/mL。3組陽性對照中TBHQ對ABTS+自由基清除能力是最強的，BHA最弱。

圖2 茶樹花精油對ABTS+自由基的清除能力

2.2.3 DPPH自由基清除能力

DPPH是一種以氮原子為中心的比較穩(wěn)定的脂溶性自由基，其氮端有單電子，醇溶液呈紫色，在517 nm處有最大吸收峰，當加入自由基清除劑與其反應(yīng)后會使紫色褪去，使其在517 nm處吸收減少，因此可通過測定吸光度來評價抗氧化劑對DPPH自由基的清除能力[22]。茶樹花精油對DPPH自由基的清除能力如圖3所示，在10～50 mg/mL范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度越高，DPPH自由基清除率越大，二者呈現(xiàn)出較好的量效關(guān)系。陽性對照組DPPH自由基清除率要高于茶樹花精油，質(zhì)量濃度50 mg/mL時，茶樹花精油對DPPH自由基清除率達到53.21%，而BHA可達到55%以上，且BHT和TBHQ均可達到65%以上。茶樹花精油、BHA、BHT、TBHQ對DPPH自由基的IC50值分別為44.93，25.51，23.27和17.87 mg/mL。3組陽性對照中TBHQ對DPPH自由基清除能力最強，BHA最弱。植物精油中的醇類、烯萜類和酚類化合物被證明與其DPPH自由基清除能力相關(guān)，這表明茶樹花精油具有一定的DPPH自由基清除活性主要與其中所含有的萜烯類和醇類物質(zhì)有關(guān)[20]。

圖3 茶樹花精油對DPPH自由基的清除能力

2.2.4 茶樹花精油的抗氧化能力對比

根據(jù)不同質(zhì)量濃度下茶樹花精油對ABTS+自由基清除率和DPPH自由基清除率的大小得到回歸方程及IC50值。由表2可知，在試驗所測的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)（10～50 mg/mL），茶樹花精油的2種抗氧化指標的最大值分別是DPPH自由基清除率53.21%、ABTS+自由基清除率53.18%，表明茶樹花精油對這2種自由基都有一定清除能力；茶樹花精油對DPPH自由基的IC50值為44.93 mg/mL，ABTS+自由基的IC50值為48.47 mg/mL，比較兩者的IC50值可知，其抗氧化活性大小次序為DPPH自由基＞ABTS+自由基。由此可知，茶樹花精油對DPPH自由基的清除能力更強。

表2 茶樹花精油的抗氧化性能力

2.3 茶樹花精油的抑菌性分析

2.3.1 抑菌圈的測定結(jié)果

抑菌圈直徑大小能直接反映抑菌活性的大小。由表3可以看出，茶樹花精油對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、酵母菌都具有一定抑菌作用，尤其是對革蘭陽性菌（金黃色葡萄球菌）的抑制作用最強，抑菌圈直徑為15.3±0.2 mm，其次是革蘭陰性菌（大腸桿菌），抑菌圈直徑為13.8±0.1 mm，相比之下對真菌（酵母菌）的抑菌活性較弱。此外，茶樹花精油對前2種菌種的抑菌效果明顯優(yōu)于陽性對照山茶花精油。由此可以判斷茶樹花精油具有良好的抑菌活性。

表3 茶樹花精油的抑菌作用

2.3.2 最小抑菌濃度的測定結(jié)果

茶樹花精油對3種供試菌的最小抑菌濃度如表4所示。最小抑菌濃度值越小表明抑菌效果越好，茶樹花精油對革蘭陽性菌（金黃色葡萄球菌）、革蘭陰性菌（大腸桿菌）和真菌（酵母菌）的最小抑菌濃度值分別為10%，15%和30%，說明茶樹花精油對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最為明顯，其次是大腸肝菌，最后是酵母菌。因此，相比真菌，茶樹花精油對細菌的抑制作用更強，其中對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好。研究發(fā)現(xiàn)，植物精油的抑菌作用與其組分中所含物質(zhì)有很大關(guān)系，如醇類、酚類和萜烯類化合物等[24]。因此茶樹花精油具有較好的抑菌效果可能與其組成中所含的醇類和萜烯類化合物有關(guān)。

表4 茶樹花精油的最小抑菌濃度試驗結(jié)果

3 結(jié)論

經(jīng)索氏抽提法提取的信陽茶樹花精油通過GC-MS分析鑒定出18種化合物，以醇類、脂肪酸類和萜烯類為主，其中苯乙醇（26.09%）和棕櫚酸（17.93%）相對含量較高。茶樹花精油具有一定清除DPPH自由基和ABTS+自由基能力，與其質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，表現(xiàn)出良好的體外抗氧化活性。此外，茶樹花精油還能明顯抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和酵母菌的生長，尤其是對金黃色葡萄球菌，其抑制效果最佳。茶樹花精油具有較好的抗氧化性和抑菌活性可能與其成分中所含的醇類、脂肪酸類和萜烯類等化合物有關(guān)，今后在開發(fā)新型香精香料、天然抗氧化劑和抑菌產(chǎn)品等方面具有一定應(yīng)用潛力。