雙楊，趙燕，夏林林，吳磊磊，陳銀華

1.十堰市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)所（十堰 442000）；2.十堰市黃龍鎮(zhèn)中心小學(xué)（十堰 442000）

瘦肉精根據(jù)其結(jié)構(gòu)差異主要分為克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、硫酸沙丁胺醇、硫酸特布他林、西巴特羅和鹽酸多巴胺7種[1]?？藗愄亓_、萊克多巴胺、沙丁胺醇屬于β-腎上腺素受體激動(dòng)劑類藥物，該類藥物能夠促進(jìn)動(dòng)物體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)重新分配，增加肌肉蛋白沉積，從而顯著提高動(dòng)物酮體的瘦肉率[2]。因此，該類藥物被大量非法用于畜牧生產(chǎn)，這也導(dǎo)致食用其飼料的動(dòng)物組織和肌肉中都會(huì)存在不同程度殘留。

人類長(zhǎng)期食用含有β-腎上腺素受體激動(dòng)劑類殘留的動(dòng)物源性食品會(huì)對(duì)人體健康造成極大的損害，可能會(huì)引起急性中毒，患者出現(xiàn)肌肉震顫、心悸、頭部和肌肉疼痛等癥狀[3-4]。我國(guó)明令禁止使用克倫特羅、萊克多巴胺及沙丁胺醇的使用，但在許多地方仍在非法使用，同時(shí)一些肉制品加工企業(yè)由于缺乏質(zhì)量控制意識(shí)，原料把關(guān)不嚴(yán)，使用存在殘留的動(dòng)物源食品加工，導(dǎo)致市場(chǎng)上一些加工肉制品也含有藥物殘留。

β-腎上腺素受體激動(dòng)劑類殘留的檢測(cè)方法主要有氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[5-6]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7]、酶聯(lián)免疫法[8-9]、電化學(xué)法[10]和高效液相色譜法[11]等，各種方法均有其相應(yīng)的實(shí)用性。主要參照GB 31658.22—2022《動(dòng)物性食品中β-受體激動(dòng)劑殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》探索高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)豬肉中β-腎上腺素受體激動(dòng)劑克倫特羅、萊克多巴胺及沙丁胺醇的方法學(xué)驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

AB Sciex QTRAP 4500液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)AB SCIEX公司）；LYZD-822水浴恒溫?fù)u床（常州金壇良友儀器有限公司）；WH966渦旋混合器（上海康華生化儀器制造有限公司）；高速組織搗碎機(jī)（江蘇金壇）；80-1型高速離心機(jī)（上海手術(shù)器械廠）；B30002電子天平（德國(guó)賽多利斯）。

甲醇、乙酸銨、乙酸乙酯、甲酸、叔丁基甲醚（均為色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；高氯酸（分析純，南京化學(xué)試劑股份有限公司）；氨水（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；β-葡萄糖醛酶/芳基硫酸酯酶（默克中國(guó)）；水為GB/T 6682—2008 《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》規(guī)定的一級(jí)水（自制）；混合陽(yáng)離子交換固相萃取柱（60 mg/3 mL，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；克倫特羅-D9內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液（濃度100 μg/mL，tmstandard公司）；萊克多巴胺-D6內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液（濃度100 μg/mL，tmstandard公司）；沙丁胺醇-D3內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液（濃度100 μg/mL，tmstandard公司）；克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（濃度100 μg/mL，壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司）；萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（濃度100 μg/mL，壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司）；沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（濃度100 μg/mL，壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制

混合內(nèi)標(biāo)工作溶液：精密量取克倫特羅-D9、萊克多巴胺-D6、沙丁胺醇-D3標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.5 mL至100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制成500 ng/mL混合內(nèi)標(biāo)工作溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：精密量取克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.5 mL至100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制成500 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

按表1精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和混合內(nèi)標(biāo)工作溶液，分別用甲醇-0.1%甲酸溶液（10+90，V/V）定容至25 mL，制成質(zhì)量濃度分別為1，2，5，10，20和50 ng/mL，內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度5 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

表1 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制

1.3 樣品溶液的配制

1.3.1 酶解與提取

準(zhǔn)確稱取2 g左右樣品于50 mL聚丙烯離心管中，加6 mL 0.2 mol/L乙酸銨緩沖溶液、40 μLβ-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶，渦旋混勻，于37 ℃避光水浴振蕩16 h，放置至室溫，備用。

1.3.2 萃取、凈化與濃縮

取備用液，加100 μL 100 ng/mL內(nèi)標(biāo)工作液，渦旋混勻，按8 000 r/min離心8 min，取上清液，加5 mL 0.1 mol/L高氯酸溶液，渦旋混勻，用高氯酸調(diào)至pH 1.0，按8 000 r/min離心8 min后，將上清液用10 mol/L NaOH溶液調(diào)至pH 10.0。加15 mL乙酸乙酯，中速振蕩5 min，按5 000 r/min離心5 min，取上層有機(jī)相。下層水相中加入10 mL叔丁基甲醚，中速振蕩5 min，按5 000 r/min離心5 min，取上層有機(jī)相，合并，在50 ℃下氮?dú)獯蹈?，? mL 2%甲酸溶液溶解，備用。

取混合型陽(yáng)離子交換固相萃取柱，依次用甲醇、2%甲酸溶液各3 mL，活化，取備用液過柱，依次用2%甲酸溶液、甲醇各3 mL淋洗，抽干，用5%氨化甲醇溶液3 mL洗脫，洗脫液在50 ℃下氮?dú)獯蹈?。殘留物中加?.5 mL甲醇-0.1甲酸溶液（10+90，V/V），充分溶解，過0.22 μm微孔濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱Kinetex?2.6 μm C18100A（100 mm×2.1 mm，美國(guó)飛諾美）；流速0.4 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；柱溫30 ℃；流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸乙腈溶液；梯度洗脫程序見表2。

表2 克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇的梯度洗脫條件

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子源；掃描方式為正離子掃描；監(jiān)測(cè)模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；氣簾氣壓力35 psi；噴撞氣壓力9 psi；離子化電壓5500 V；溫度550℃；噴霧氣壓力55 psi；輔助加熱氣壓力55 psi。

1.5 定性與定量測(cè)定方法

在同樣的測(cè)試條件下，試樣溶液的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液保留時(shí)間的偏差應(yīng)在±2.5%之內(nèi)；試樣溶液中的離子相對(duì)豐度比與標(biāo)準(zhǔn)溶液中的離子豐度相比，應(yīng)符合表3的要求。

表3 試樣溶液中離子相對(duì)豐度的允許偏差范圍

定量采用內(nèi)標(biāo)法，克倫特羅以克倫特羅-D9為內(nèi)標(biāo)物，萊克多巴胺以萊克多巴胺-D6為內(nèi)標(biāo)物，沙丁胺醇以沙丁胺醇-D3為內(nèi)標(biāo)物。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別取300 ng/mL的克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、克倫特羅-D9、萊克多巴胺-D6、沙丁胺醇-D3標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過針泵注入質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化。在正離子模式下進(jìn)行全掃描，掃描范圍為質(zhì)荷比（m/z）200～400，根據(jù)質(zhì)譜圖選擇響應(yīng)最高的離子作為母離子。不斷增加CE值，改變碰撞能使母離子破碎，選擇響應(yīng)值較強(qiáng)的2個(gè)離子作為定量離子和定性離子，在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式下，優(yōu)化碰撞能（CE）及去簇電壓（DP）。優(yōu)化后的克倫特羅、萊克多巴胺及沙丁胺醇的質(zhì)譜參數(shù)見表4。

表4 克倫特羅、萊克多巴胺及沙丁胺醇的質(zhì)譜參數(shù)

2.2 色譜柱的優(yōu)化

選擇高效的色譜柱是檢測(cè)克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇的基礎(chǔ)，分別選擇色譜柱Kinetex?2.6 μm F5 100A（100 mm×2.1 mm）、Kinetex?2.6 μm Phenyl-Hexyl 100A（100 mm×2.1 mm）及Kinetex?2.6 μm C18100A（100 mm×2.1 mm）的3種色譜柱進(jìn)行試驗(yàn)，檢測(cè)它們對(duì)3種化合物的分離效果。結(jié)果表明，色譜柱型號(hào)Kinetex?2.6 μm C18100A（100 mm×2.1 mm）的效果最好，總離子流圖，克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇及內(nèi)標(biāo)特征離子色譜圖如圖1～圖4所示。因此，選擇Kinetex?2.6 μm C18100A（100 mm×2.1 mm）色譜柱進(jìn)行試驗(yàn)。

圖1 克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇質(zhì)量濃度50 ng/mL時(shí)的總離子流圖

圖2 克倫特羅及內(nèi)標(biāo)特征離子色譜圖

圖3 萊克多巴胺及內(nèi)標(biāo)特征離子色譜圖

圖4 沙丁胺醇及內(nèi)標(biāo)特征離子色譜圖

2.3 方法線性范圍的驗(yàn)證

將配制好的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液按照濃度由低到高的順序進(jìn)樣測(cè)定。以待測(cè)藥物定量離子峰面積和對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)定量離子峰面積比為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?？藗愄亓_、萊克多巴胺、沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)曲線圖譜如圖5所示，線性范圍、線性方程及相關(guān)系數(shù)見表5。

圖5 克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

表5 克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇的線性范圍、線性方程及相關(guān)系數(shù)

由圖5和表5可知，克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇在1.0～50.0 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，3種化合物線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)均大于0.999，滿足方法線性要求。

2.4 檢出限和定量限的驗(yàn)證

2.4.1 檢出限

按GB 31658.22—2022《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 動(dòng)物性食品中β-受體激動(dòng)劑殘留量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》中取樣量2.00 g，定容體積0.5 mL，檢出限要求0.2 μg/kg計(jì)算，此時(shí)克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇的濃度為0.8 ng/mL，用適量混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制濃度0.8 ng/mL的溶液進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定其信噪比?？藗愄亓_、萊克多巴胺、沙丁胺醇檢出限相關(guān)檢驗(yàn)數(shù)據(jù)見表6。

表6 克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇檢出限檢驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.4.2 定量限

按GB 31658.22—2022《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 動(dòng)物性食品中β-受體激動(dòng)劑殘留量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》中取樣量2.00 g，定容體積0.5 mL，定量限要求0.5 μg/kg計(jì)算，此時(shí)克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇質(zhì)量濃度為2.0 ng/mL，用質(zhì)量濃度2.0 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得其信噪比。克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇定量限具體檢驗(yàn)數(shù)據(jù)見表7。

表7 克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇定量限檢驗(yàn)數(shù)據(jù)

由表6好表7可知，當(dāng)使用克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇的方法檢出限0.2 μg/kg驗(yàn)證時(shí)，3種化合物測(cè)定的性噪比均大于3，滿足方法檢出限的要求；當(dāng)使用克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇的方法定量限0.5 μg/kg驗(yàn)證時(shí)，3種化合物測(cè)定的性噪比均大于10，滿足方法定量限的要求。

2.5 回收率的驗(yàn)證

向陰性樣品中添加克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平分別為1.0，4.0和8.0 μg/kg，按GB 31658.22—2022《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 動(dòng)物性食品中β-受體激動(dòng)劑殘留量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》進(jìn)行處理檢測(cè)?？藗愄亓_、萊克多巴胺和沙丁胺醇3種化合物加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果見表8。

表8 陰性樣品中添加克倫特羅、萊克多巴胺及沙丁胺醇的回收率

3種化合物克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇的回收率在81.0%～94.0%，滿足方法回收率要求。

2.6 精密度的驗(yàn)證

取添加濃度水平4.0 μg/kg克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品的陰性樣品，按GB 31658.22—2022《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 動(dòng)物性食品中β-受體激動(dòng)劑殘留量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》進(jìn)行處理并重復(fù)測(cè)定7次?？藗愄亓_、萊克多巴胺和沙丁胺醇3種化合物測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差試驗(yàn)結(jié)果見表9。

表9 陰性樣品中添加克倫特羅、萊克多巴胺及沙丁胺醇的精密度（n=7）

重復(fù)測(cè)定加標(biāo)樣品中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.83%，3.07%和3.50%，滿足方法精密度要求。

3 結(jié)論

通過采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豬肉中的克倫特羅、萊克多巴胺及沙丁胺醇，并從線性、檢出限、定量限、回收率、精密度等方面對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證。試驗(yàn)結(jié)果表明：在線性方面，克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇在1.0～50.0 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，3種化合物線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)均大于0.999；在檢出限及定量限驗(yàn)證方面，當(dāng)方法檢出限為0.2 μg/kg時(shí)，3種化合物測(cè)定響應(yīng)值均大于3，方法定量限為0.5 μg/kg時(shí)，3種化合物測(cè)定響應(yīng)值均大于10；在回收率方面，3種化合物克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇的回收率在81.0%～94.0%；在精密度方面，重復(fù)測(cè)定的樣品中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.83%，3.07%和3.50%。因此，上述幾個(gè)方面均滿足方法驗(yàn)證要求。