常 暢，高 靜，李志強(qiáng)，張 帥

(河北北方學(xué)院附屬第二醫(yī)院病理科，河北 張家口 075100)

宮頸癌是已婚婦女常見惡性腫瘤，2020年全球癌癥統(tǒng)計系列報告顯示全球新發(fā)宮頸癌人數(shù)占女性新發(fā)癌癥總?cè)藬?shù)的6.5%，為影響婦女健康的第四位高發(fā)癌癥[1-2]。宮頸鱗狀細(xì)胞癌(cervical squamous cell carcinoma，CSCC)是宮頸癌最常見的組織學(xué)類型，約占宮頸癌的80%～85%，多發(fā)于35歲以上女性人群，呈年輕化趨勢[3-4]。早期CSCC可通過手術(shù)、放療或化療綜合治療治愈，晚期患者預(yù)后較差。叉頭框蛋白A1(FOXA1)屬于FOX家族成員，基因位于染色體14q21.1，F(xiàn)oxA 1作為轉(zhuǎn)錄輔助因子，由472個氨基酸構(gòu)成，F(xiàn)oxA 1在多種組織中廣泛表達(dá)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄與DNA修復(fù)，在細(xì)胞生長、分化、胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生發(fā)展及能量代謝等過程中發(fā)揮重要作用。RNF6基因定位于人染色體13q12.2，其編碼的蛋白含有685個氨基酸，具有泛素連接酶活性。報道顯示，RNF6異常表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌、前列腺癌、胃癌、結(jié)腸直腸癌、乳腺癌、白血病等疾病相關(guān)，為潛在的預(yù)后因素和治療靶點(diǎn)[5-6]。我們探討了FoxA1及RNF6在CSCC中的表達(dá)及意義，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析河北北方學(xué)院附屬第二醫(yī)院2014-04—2019-04月收治的164例CSCC患者(PE組)及164例慢性宮頸炎患者(對照組)的臨床資料及保存良好的病理組織標(biāo)本。PE組納入標(biāo)準(zhǔn)：①均符合《WHO女性生殖器官腫瘤分類》CSCC相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；②術(shù)后病理學(xué)診斷均符合鱗狀細(xì)胞癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并宮頸腺癌、小細(xì)胞癌等其他病理組織學(xué)類型；②合并全身其它系統(tǒng)鱗狀細(xì)胞癌患者；③臨床及隨訪資料不完整者。PE組患者年齡32～75歲，平均(54.25±24.13)歲；對照組患者年齡28～75歲，平均(52.83±26.37)歲。2組患者年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

本研究經(jīng)河北北方學(xué)院附屬第二醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑及儀器

兔抗人FoxA1單克隆抗體及兔抗人RNF6單克隆抗體均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；免疫組織化學(xué)試劑盒及濃縮型二氨基聯(lián)苯胺(diaminobendine，DAB)試劑盒均購自中杉金橋生物系統(tǒng)有限公司；TRIzol裂解液、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及real time擴(kuò)增試劑盒均購自Takara公司；PCR儀(型號：TIB-8300)購自泰普生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)時定量PCR技術(shù)檢測FoxA1及RNF6 mRNA表達(dá)

按說明書提取保存完好的CSCC組織標(biāo)本和慢性宮頸炎宮頸組織標(biāo)本，總RNA反轉(zhuǎn)錄生成cDNA作為RT-qPCR擴(kuò)增模板，PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 12 s、40個循環(huán)，62 ℃ 1 min。引物序列：FoxA1上游引物為5′-GGAGCAACAGTGGTG-GAGTG-3′，下游引物為5′-GACGAAGGTCTGAGTA-CAGA-3′；RNF6上游引物為5′-AAGCGACAAC-CAGCTAGACTTTC-3′，下游引物為5′-TGGCGGAGT-GGACACAA-3′。記錄每個標(biāo)本的Ct值，采用實(shí)時定量PCR相對定量法分析，以2-△△Ct表示CSCC組織FoxA1及RNF6表達(dá)量相對于慢性宮頸炎宮頸組織表達(dá)量的變化倍數(shù)，其中△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，以△Ct作為校正得出△△Ct=△Ct(CSCC組織)-△Ct(慢性宮頸炎宮頸組織)。

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色法檢測FoxA1及RNF6蛋白表達(dá)水平

采用過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素(streptvaidin-peroxidase，SP)免疫組織化學(xué)染色法，操作嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。通過輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)將組織標(biāo)本蠟塊切片，厚度3～5 μm，切片放置于56～60℃烤箱1～2 h。常規(guī)脫蠟水化：玻片浸入二甲苯10 min，重復(fù)操作3次，組織徹底脫蠟，然后將玻片浸入濃度依次為100%、95%、85%、70%遞減的乙醇中水化，均浸泡5 min，最后將玻片浸入蒸餾水中5 min。放入pH8.0的EDTA中高壓抗原修復(fù)2 min 30 s，3% H2O2處理10 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，分別滴加FoxA1單克隆抗體(1∶100)、RNF6單克隆抗體(1∶100)，4 ℃冰箱過夜；PBS清洗3次后滴加抗小鼠/兔IgG過氧化物酶聚合物，37℃孵育30 min；洗滌后滴加新鮮配置DAB顯色液室溫顯色10 min，最后行蘇木素復(fù)染后放入乙醇梯度中脫水，二甲苯透明后進(jìn)行中性樹膠封片，顯微鏡觀察并拍照。

1.4 判定標(biāo)準(zhǔn)

在顯微鏡下觀察FoxA1及RNF6在CSCC及慢性宮頸炎宮頸組織中的染色情況，免疫組化染色結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)：每張切片隨機(jī)觀察5個高倍視野，每個高倍視野計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，采用半定量評分法評估蛋白表達(dá)情況，依據(jù)染色強(qiáng)度(不著色為陰性計0分；淡黃色為弱陽性計1分；淺棕色為中等陽性計2分；深棕色為強(qiáng)陽性計3分)和陽性細(xì)胞數(shù)量百分比(陰性計0分；1%～50%計1分；51%～74%計2分；大于75%計3分)的乘積確定最終得分：0分為陰性表達(dá)(-)；1～2分為弱表達(dá)(+)；3～4分為中度表達(dá)(2+)；6～9分為強(qiáng)表達(dá)(3+)[8]。

所有免疫組化玻片均由兩位高級職稱病理診斷醫(yī)師在不知道切片的HE染色情況及組織診斷情況下獨(dú)立審查并進(jìn)行評分，最大程度避免人為干擾。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 CSCC及慢性宮頸炎宮頸組織FoxA1及RNF6蛋白表達(dá)水平比較

CSCC增殖的鱗狀上皮侵入結(jié)締組織內(nèi)，形成許多互相連接的細(xì)胞巢、輪層狀小體，細(xì)胞核增大、可見核分裂象，F(xiàn)OXA1及RNF6蛋白表達(dá)均定位于細(xì)胞質(zhì)(圖1)。PE組FoxA1及RNF6蛋白的表達(dá)水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(表1)。

表1 2組FoxA1及RNF6蛋白表達(dá)比較

A：PE組HE組織形態(tài)；B：PE組FoxA1陽性表達(dá)；C：PE組RNF6陽性表達(dá)；D：對照組HE組織形態(tài)；E：對照組FoxA1陽性表達(dá)；F：對照組RNF6陽性表達(dá)

2.2 CSCC及慢性宮頸炎宮頸組織FoxA1及RNF6 mRNA表達(dá)水平比較

PE組FoxA1及RNF6 mRNA表達(dá)水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(表2)。

表2 2組FoxA1及RNF6 mRNA表達(dá)比較

3 討 論

有研究顯示，CSCC發(fā)病率和死亡率在發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家之間差異明顯[9-12]。臨床研究證實(shí)，浸潤性CSCC的侵襲性與轉(zhuǎn)移能力較強(qiáng)，死亡率達(dá)80%，腫瘤分化、侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致腫瘤死亡率升高的重要原因，晚期CSCC復(fù)發(fā)率高，5年生存率僅40%～50%[13]。早期明確診斷，尋找靶向治療的腫瘤生物標(biāo)志物對CSCC具有重要臨床意義。

FOXA是一種能夠影響基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用，其家族有FOXA1、FOXA2及FOXA3 3個成員。FOXA1是FOXA家族中第一個被發(fā)現(xiàn)的，也是近年來學(xué)者們研究最多的FOXA成員，可通過參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、細(xì)胞代謝、血管生成及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等過程參與腫瘤發(fā)生及惡性進(jìn)展。食管癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌、甲狀腺癌等中都存在基因擴(kuò)增及蛋白高表達(dá)，但其機(jī)制卻各有差異[14]。已有研究證實(shí)，F(xiàn)OXA1基因位于人染色體14q21.1，它的N端的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域、中間的叉頭框域及C端與組蛋白H3賴氨酸4相關(guān)的激活轉(zhuǎn)錄結(jié)合域3個區(qū)域，參與細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，在腫瘤侵襲起始階段結(jié)合染色質(zhì)后使其局部區(qū)域松解，該區(qū)G0/G1期細(xì)胞周期停滯，細(xì)胞增殖受到抑制[15-16]。RNF6是泛素-蛋白酶體系統(tǒng)中的一種E3泛素連接酶，基因長2 058 bp，編碼包括C-端RING-H2指及N端螺旋結(jié)構(gòu)域在內(nèi)的685個氨基酸，通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin、Akt/mTOR等通路、細(xì)胞凋亡過程中的caspases途徑、磷酸化Ser/Thr進(jìn)而抑制酪氨酸激酶活性磷酸化以及降解大部分短周期壽命蛋白的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)在腫瘤中發(fā)揮重要作用[17]。RNF6通過泛素化降解TLE3蛋白、SHP-1蛋白等促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖。RNF6還可穩(wěn)定糖皮質(zhì)激素受體、雌激素受體等，促進(jìn)骨髓瘤及乳腺癌細(xì)胞增殖。RNF6還可參與STAT3等多條信號通路的調(diào)節(jié)，參與腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲，影響放療敏感性。

本研究通過PCR及免疫組化檢測FOXA1在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)，證實(shí)FOXA1在CSCC組織中表達(dá)水平明顯高于慢性宮頸炎宮頸組織，提示FOXA1可能通過促進(jìn)CSCC侵襲、遷移及增殖能力發(fā)揮作用。本研究結(jié)果還表明，RNF6在CSCC組織中表達(dá)水平明顯高于慢性宮頸炎宮頸組織，其可能通過C-端RING-H2指結(jié)構(gòu)活化絲氨酸激酶，進(jìn)而被蛋白酶體降解，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖及分化等生長過程。

綜上，F(xiàn)oxA1、RNF6蛋白及mRNA在CSCC組織中表達(dá)水平明顯高于慢性宮頸炎宮頸組織，F(xiàn)OXA1作為轉(zhuǎn)錄因子可通過調(diào)節(jié)宮頸鱗狀細(xì)胞癌基因表達(dá)而增強(qiáng)侵襲能力，RNF6通過蛋白酶作用調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、分化等生長過程，在CSCC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。有待進(jìn)一步研究二者在CSCC中的具體作用及機(jī)制，為臨床治療CSCC提供新路徑。