劉珊珊 杜曉華，* 劉霞 吳亞娟 鄭麗平

（1甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

牦牛是青藏高原特有畜種和主要的畜禽遺傳資源，是世界上唯一能夠在高寒低氧、強(qiáng)紫外線、牧草營養(yǎng)短缺等極端環(huán)境中生存的大型反芻動物［1-2］。由于牦牛具有與低氧適應(yīng)相關(guān)的解剖結(jié)構(gòu)和生理特征，如較大的心和肺、較厚的體表覆蓋物和發(fā)達(dá)的皮膚腺，使其能夠適應(yīng)高寒低氧環(huán)境［1-3］。腦作為耗氧量較大的組織器官，在高原地區(qū)對氧分壓的變化十分敏感［4-5］。小腦是中樞神經(jīng)系統(tǒng)運(yùn)動協(xié)調(diào)的主要中心，與大腦運(yùn)動皮層保持著廣泛的神經(jīng)連接，盡管其體積僅為大腦總體積的10%，但其中包含了超過50%的神經(jīng)元［6-8］。缺氧可導(dǎo)致神經(jīng)元供能不足，引發(fā)多種異常生理活動，包括酶活性降低、細(xì)胞膜通透性改變、膜電位異常和神經(jīng)沖動傳導(dǎo)障礙，最終引起一系列高原?。?-11］。

神經(jīng)營養(yǎng)素-4（neurotrophin-4，NT-4）是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族重要的成員，也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的存活因子［12-13］，在促進(jìn)神經(jīng)元生長、發(fā)育、分化與成熟，維持神經(jīng)元存活以及促進(jìn)神經(jīng)元損傷后修復(fù)與再生及神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌等方面均發(fā)揮著重要作用［14-15］。神經(jīng)營養(yǎng)性酪氨酸激酶受體2（neurotrophic tyrosine kinase receptor type 2，NTRK2）是一種酪氨酸激酶受體，在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能［16-17］。研究發(fā)現(xiàn)，NT-4可促進(jìn)腦缺血缺氧后血管的增殖來抵抗缺血缺氧性腦損傷，當(dāng)NT-4與反應(yīng)神經(jīng)元表面受體NTRK2結(jié)合后，觸發(fā)受體激活，從而啟動復(fù)雜的細(xì)胞通路，并促進(jìn)神經(jīng)元的生存和發(fā)育，抑制細(xì)胞凋亡［18-19］。同時，NT-4通過表達(dá)上調(diào)激活受體NTRK2，組裝為NT-4-NTRK2復(fù)合物，能夠啟動細(xì)胞內(nèi)一系列反應(yīng)來調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducibe factor-1α，HIF-1α）的表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)節(jié)參與糖代謝和血管生成的下游蛋白的表達(dá)，進(jìn)而提高動物機(jī)體對低氧環(huán)境的耐受性［20-21］。此外，機(jī)體長期處于高原低氧環(huán)境下會導(dǎo)致活性氧（reactive oxygen species，ROS）蓄積，腦組織因ROS過量堆積而引起炎癥反應(yīng)［22-23］，星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞在腦內(nèi)炎癥反應(yīng)中明顯激活，釋放多種炎癥因子，并損傷腦組織及血管內(nèi)皮功能［24］。NT-4也可通過降低促炎因子的表達(dá)、減輕神經(jīng)炎癥以及改善神經(jīng)功能對缺血缺氧性腦損傷產(chǎn)生保護(hù)作用［25］。目前對NT-4及其受體NTRK2在神經(jīng)系統(tǒng)方面的研究主要集中在小鼠、大鼠、猴等物種的神經(jīng)損傷修復(fù)等領(lǐng)域，關(guān)于牦牛的研究尚鮮見報道。

鑒于此，本研究以牦牛和黃牛小腦組織為研究對象，通過蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin，HE）、免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）、實(shí)時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）、蛋白免疫印跡（Western blot，WB）對NT-4和NTRK2的分布及表達(dá)特征進(jìn)行研究，旨在闡明NT-4及其受體NTRK2在牦牛與黃牛小腦各區(qū)域中的表達(dá)規(guī)律，分析與牦牛腦組織適應(yīng)低氧環(huán)境的關(guān)系，以期為研究牦牛腦組織低氧適應(yīng)性機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

甘南牦牛（母，6歲）樣品在甘肅省甘南藏族自治州合作市采集，南陽黃牛（母，6歲）在河南省鄭州市采集，各3頭。分別采集不同區(qū)域小腦組織，置于液氮和4%多聚甲醛溶液中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑及儀器

TriQuick RNA提取試劑盒、放射免疫沉淀試驗(yàn)（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）組織快速裂解液，科寶（蘭州）生物科技有限公司；Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒，（長沙）艾科瑞生物工程有限公司；NT-4多克隆抗體（rabbit anti-NT-4 polyclonal antibody，DF6226），艾菲（美國）生物科技有限公司；神經(jīng)營養(yǎng)性酪氨酸激酶受體2（rabbit anti-NTRK2 monoclonal antibody，4603），上海優(yōu)寧維生物公司；兔抗β-actin多克隆抗體（rabbit anti-β-actin polyclonal antibody，bs-0061R）、山羊抗兔IgG/HRP （goat anti-rabbit IgG/HRP，bs-0295GHRP），博奧森（北京）生物技術(shù)有限公司；鏈霉卵白素-生物素法檢測（streptavidin peroxidase，SP）試劑盒，中杉金橋（北京）生物技術(shù)有限公司；增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒，賽維爾（武漢）科技有限公司；LightCycler96熒光定量PCR儀，瑞士Roche公司；冷凍型高通量組織研磨儀，寧波新芝生物公司；臺式高速冷凍離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；TGrade加熱型程控五段金屬浴，北京天根生化公司；超微量分光光度計(jì)，北京凱奧科技發(fā)展有限公司。

1.3 實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)

1.3.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI網(wǎng)站GenBank數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）公布的牦牛NT-4（NM-001304828）與NTRK2（NM-010808129.3）基因序列，同時以β-actin（NM-173979.3）為內(nèi)參基因，使用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)引物，并送至上海生物工程股份有限公司進(jìn)行合成，引物信息見表1。

1.3.2 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄 用研磨儀充分研磨牦牛與黃牛小腦各區(qū)域組織樣品，使用TriQuick RNA提取試劑盒提取組織總RNA，并用分光光度計(jì)測定RNA濃度，按照Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 牦牛與黃牛小腦不同區(qū)域NT-4及NTRK2基因擴(kuò)增 采用反轉(zhuǎn)錄的cDNA作為模板，對NT-4、NTRK2、β-actin進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并使用10 g·L-1瓊脂糖凝膠對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，以確定目標(biāo)片段的大小和純度。

1.3.4 qRT-PCR檢測NT-4及NTRK2在牦牛與黃牛小腦中的表達(dá) 以β-actin為內(nèi)參基因，使用熒光定量PCR儀分別將牦牛與黃牛小腦不同區(qū)域NT-4及NTRK2進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，每組3個重復(fù)。反應(yīng)體系為20 μL：SYBR High-Sensitivy q-PCR SuperMix 10 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA模板 1 μL，dd H2O 7.4 μL。反應(yīng)條件：50 ℃預(yù)熱2 min，95 ℃預(yù)變性40 s；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)；每個樣品設(shè)4次重復(fù)。反應(yīng)結(jié)束后，使用Light Cycler?96軟件采集Ct值，利用2-ΔΔct法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。

1.4 蛋白免疫印跡（WB）

1.4.1 蛋白樣品制備 稱取牦牛與黃牛小腦不同組織各0.2 g于無酶離心管中，分別加入2 mL RIPA裂解液和20 μL蛋白酶抑制劑，置于預(yù)冷的-10 ℃研磨儀中研磨，然后搖床冰浴2 h，離心后收集上清，蛋白濃度測定后分裝于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 WB檢測 將提取的蛋白與4×蛋白上樣緩沖液按3∶1的比例混勻后，98 ℃恒溫金屬浴進(jìn)行蛋白變性10 min，冷卻至室溫，存于-20 ℃?zhèn)溆谩Ｗ冃缘鞍捉?jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳后，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印至0.22 μm聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidenefluoride，PVDF）上，用50 g·L-1脫脂奶粉室溫封閉4 h后，孵育一抗（NT-4：1∶500，NTRK2：1∶1 000，β-actin：1∶2 000稀釋）4 ℃過夜，磷酸鹽緩沖液+Tween（phosphate buffer solution with Tween，PBST）洗滌4次，每次15 min，室溫?fù)u床孵育二抗（1∶3 000）2 h，PBST洗滌4次，每次15 min，滴加化學(xué)發(fā)光液（enhanced-chemiluminescence，ECL）置于化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行顯影。

1.5 免疫組織化學(xué)（IHC）檢測

石蠟切片經(jīng)二甲苯、苯酒（無水酒精與二甲苯1∶1配制）和梯度酒精脫蠟脫水，然后用檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原熱修復(fù)，冷卻至室溫后，按SP試劑盒說明書依次滴加內(nèi)源性過氧化物阻斷劑和山羊血清工作液進(jìn)行阻斷封閉，隨后滴加一抗，其中NT-4和NTRK2稀釋比例均為1∶100，陰性對照用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）代替，4 ℃過夜孵育，次日用PBS洗滌15 min后，滴加生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG于37 ℃溫箱孵育15 min，PBS洗滌后滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液于37 ℃溫箱中孵育15 min，PBS洗滌15 min后滴加現(xiàn)配的增強(qiáng)型二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）進(jìn)行顯色，在光學(xué)顯微鏡下控制染色并用自來水終止顯色，依次用蘇木精復(fù)染、鹽酸酒精分化、自來水返藍(lán)，脫水透明后用中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 23.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA），所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，并采用Graphpad Prism 8.0進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 qRT-PCR檢測結(jié)果

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳后，片段大小與預(yù)期相符。NT-4（圖1-A）、NTRK2（圖1-B）和β-actin（圖1-C）分別為160、105和158 bp，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶單一，以上結(jié)果說明cDNA模板可用于qRTPCR檢測。

圖1 NT-4 （A）、NTRK2 （B）和β-actin （C）基因擴(kuò)增Fig.1 NT-4 （A），NTRK2 （B） and β-actin （C） gene amplification

qRT-PCR檢測結(jié)果表明，牦牛與黃牛小腦各區(qū)域中均有NT-4基因的表達(dá)，其在牦牛小腦半球皮質(zhì)中表達(dá)量最高，且顯著高于其他區(qū)域（P＜0.05，圖2-A），蚓部髓質(zhì)中表達(dá)量最低。另外，黃牛NT-4基因的相對表達(dá)量在蚓部髓質(zhì)中最高，與其余各區(qū)域相比，具有顯著差異（P＜0.05，圖2-B），小腦半球髓質(zhì)表達(dá)量最低。

圖2 NT-4 基因在牦牛（A）與黃牛（B）小腦不同區(qū)域的表達(dá)結(jié)果Fig.2 The expression of NT-4 gene in different regions of the yaks （A） and cattles （B） cerebellum

NTRK2基因在牦牛與黃牛小腦各區(qū)均有不同程度的表達(dá)。其中，NTRK2基因在牦牛蚓部皮質(zhì)中表達(dá)量最高，且顯著高于其他組織（P＜0.05，圖3-A），小腦半球皮質(zhì)次之，小腦半球髓質(zhì)表達(dá)量最低。而在黃牛小腦半球髓質(zhì)表達(dá)量最高，且顯著高于其他組織（P＜0.05，圖3-B），蚓部皮質(zhì)次之，小腦半球皮質(zhì)表達(dá)量最低。

圖3 NTRK2基因在牦牛（A）與黃牛（B）小腦不同區(qū)域的表達(dá)結(jié)果Fig.3 The expression of NTRK2 mRNA in different regions of the yaks （A） and cattles （B） cerebellum

與黃牛相比，NT-4基因在小腦半球皮質(zhì)和小腦半球髓質(zhì)中的表達(dá)量顯著高于黃牛，而在蚓部髓質(zhì)中低于黃牛（圖4-A）；NTRK2基因在牦牛小腦髓質(zhì)中的表達(dá)量顯著低于黃牛，而在蚓部皮質(zhì)和小腦半球皮質(zhì)的表達(dá)量顯著高于黃牛，蚓部髓質(zhì)的表達(dá)量與黃牛無明顯差異（圖4-B）。

圖4 牦牛與黃牛小腦不同區(qū)域NT-4及NTRK2基因表達(dá)比較Fig.4 Comparative expression of NT-4 and NTRK2 in different regions of the yaks and cattles cerebellum

2.2 WB檢測

WB結(jié)果表明，NT-4蛋白在牦牛與黃牛小腦各區(qū)域均有表達(dá)。牦牛小腦半球皮質(zhì)表達(dá)量最高，且顯著高于其他組織（P＜0.05，圖5-A），小腦半球髓質(zhì)次之，蚓部皮質(zhì)表達(dá)量最低。黃牛蚓部髓質(zhì)表達(dá)量最高，顯著高于其他組織（P＜0.05，圖5-B），蚓部皮質(zhì)次之，小腦半球髓質(zhì)表達(dá)量最低。

圖5 牦牛（A）與黃牛（B）小腦不同區(qū)域中NT-4蛋白表達(dá)情況Fig.5 Expression of NT-4 protein in different regions of the yaks （A） and cattles （B） cerebellum

NTRK2蛋白在牦牛與黃牛小腦各區(qū)域均有表達(dá)，其中，NTRK2在牦牛蚓部皮質(zhì)中表達(dá)最高，且顯著高于其他組織（P＜0.05，圖6-A），小腦半球髓質(zhì)次之，蚓部髓質(zhì)表達(dá)量最低。NTRK2在黃牛小腦半球髓質(zhì)中表達(dá)量最高，顯著高于其他組織（P＜0.05，圖6-B），蚓部皮質(zhì)次之，小腦半球皮質(zhì)表達(dá)量最低。

圖6 牦牛（A）與黃牛（B）小腦不同區(qū)域中NTRK2蛋白表達(dá)情況Fig.6 Expression of NTRK2 protein in different regions of the yaks （A） and cattles （B） cerebellum

與黃牛相比較，NT-4蛋白在牦牛小腦各區(qū)域中的表達(dá)量均高于黃牛（圖7-A）；NTRK2蛋白的表達(dá)量在蚓部髓質(zhì)和小腦半球髓質(zhì)中低于黃?；驘o差異，其余區(qū)域均高于黃牛（圖7-B）。

圖7 牦牛與黃牛小腦不同區(qū)域NT-4 （A）及NTRK2 （B）蛋白表達(dá)比較Fig.7 Comparative expression of NT-4 （A） and NTRK2 （B） in different regions of the yaks and cattles cerebellum

2.3 IHC檢測結(jié)果

通過HE染色觀察牦牛和黃牛小腦組織結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖8、9所示，牦牛和黃牛小腦各區(qū)域組織結(jié)構(gòu)相似。蚓部皮質(zhì)和小腦半球皮質(zhì)從淺到深均可分為分子層、浦肯野細(xì)胞層和顆粒層。分子層主要包括無髓神經(jīng)細(xì)胞纖維和少量神經(jīng)元，如胞體較大的籃狀細(xì)胞；浦肯野細(xì)胞層由排列整齊的浦肯野細(xì)胞胞體組成，胞體呈梨形；顆粒層則由密集的顆粒細(xì)胞和一些高爾基細(xì)胞組成。蚓部髓質(zhì)和小腦半球髓質(zhì)形態(tài)結(jié)構(gòu)相似，主要有神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)纖維組成，并伴有少量血管。

圖8 牦牛小腦不同區(qū)域中NT-4和NTRK2蛋白分布Fig.8 Distribution of NT-4 and NTRK2 proteins in different regions of the yaks cerebellum

圖9 黃牛小腦不同區(qū)域中NT-4和NTRK2蛋白分布Fig.9 Distribution of NT-4 and NTRK2 proteins in different regions of the cattles cerebellum

通過免疫組織化學(xué)染色法檢測牦牛與黃牛小腦各區(qū)域NT-4及NTRK2的分布及定位。結(jié)果如圖8、9所示，黃牛小腦NT-4和NTRK2陽性細(xì)胞的分布和定位趨勢與牦牛一致，陽性產(chǎn)物主要分布于細(xì)胞質(zhì)。在蚓部皮質(zhì)和小腦半球皮質(zhì)的分子層中，可見散亂分布的NT-4和NTRK2陽性反應(yīng)，同時籃狀細(xì)胞的胞質(zhì)中也有少量陽性表達(dá)。浦肯野細(xì)胞的胞質(zhì)中亦有陽性產(chǎn)物分布，而顆粒細(xì)胞的胞質(zhì)中也呈現(xiàn)大量細(xì)胞表達(dá)陽性產(chǎn)物。此外，在蚓部髓質(zhì)和小腦半球髓質(zhì)中，陽性著色多集中于神經(jīng)元胞質(zhì)中，在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中也有少量陽性產(chǎn)物分布。

3 討論

NT-4作為神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中的重要成員之一，可控制脊椎動物神經(jīng)元的存活和分化，同時在腦缺血缺氧后可通過NT-4-NTRK2信號傳導(dǎo)途徑發(fā)揮內(nèi)源性保護(hù)作用［26］。本研究結(jié)果顯示，NT-4基因和蛋白在牦牛與黃牛小腦不同區(qū)域均有表達(dá)，牦牛NT-4蛋白在小腦各區(qū)域中表達(dá)水平顯著高于黃牛，該蛋白在小腦半球皮質(zhì)中表達(dá)量最高，小腦半球髓質(zhì)中表達(dá)量次之，在牦牛蚓部皮質(zhì)中表達(dá)量最低。然而，NT-4基因在牦牛蚓部髓質(zhì)中表達(dá)量最低。有研究報道，基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白的翻譯存在時空差異［27］，這可能是造成NT-4基因及其蛋白存在表達(dá)差異的主要原因。前人研究表明，機(jī)體長期處于高原低氧環(huán)境下，會使小腦半球浦肯野細(xì)胞中酶活性降低、供能不足、機(jī)體免疫能力減弱，進(jìn)而引起炎癥反應(yīng)［28-29］。此外，還有研究報道NT-4可通過降低促炎因子的表達(dá)水平、減輕神經(jīng)炎癥以及改善神經(jīng)功能對缺血缺氧性腦損傷產(chǎn)生保護(hù)作用［25，30］。髓質(zhì)主要由密集的纖維束和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組成，其中神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)營養(yǎng)因子的主要來源，已被證明在控制神經(jīng)發(fā)生、細(xì)胞遷移、軸突生長、維持血腦屏障以及控制體內(nèi)平衡和血管張力等方面發(fā)揮重要作用［31-32］。由此推測NT-4可能在牦牛與黃牛小腦神經(jīng)元的存活、生長以及功能發(fā)揮方面具有調(diào)節(jié)作用，牦牛小腦半球中NT-4的高表達(dá)可能也會參與神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而使腦組織更好的適應(yīng)低氧環(huán)境。

NTRK2是原肌球蛋白受體激酶家族中的重要成員，也是NT-4的高親和力受體，NT-4對腦組織的神經(jīng)保護(hù)作用需NTRK2的激活［33］。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)機(jī)體或細(xì)胞受到缺血缺氧刺激時，會誘導(dǎo)NT-4和NTRK2的表達(dá)增加，NT-4隨后誘導(dǎo)NTRK2形成二聚體，并自動發(fā)生磷酸化，磷酸化受體再通過相關(guān)途徑調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）的表達(dá)［26］。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相一致，即NT-4及NTRK2在牦牛蚓部皮質(zhì)和小腦半球皮質(zhì)中的表達(dá)量均顯著高于黃牛，說明二者協(xié)同對神經(jīng)元發(fā)揮了內(nèi)源性保護(hù)作用，但兩種因子在牦牛蚓部髓質(zhì)的表達(dá)趨勢不一致，提示NT-4與NTRK2并非一一對應(yīng)關(guān)系，可能與低親和力受體競爭NT-4并與之結(jié)合有關(guān)。

已有研究表明，在中樞神經(jīng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中的大多數(shù)神經(jīng)元中均可觀察到NT-4和NTRK2陽性表達(dá)［34］，這與本研究中NT-4和NTRK2蛋白在牦牛和黃牛小腦各區(qū)域均有陽性表達(dá)結(jié)果一致，即在小腦各區(qū)域的皮質(zhì)中主要定位于分子層、浦肯野細(xì)胞層和顆粒層的神經(jīng)元胞質(zhì)中，在髓質(zhì)各區(qū)域中主要分布于神經(jīng)纖維以及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中，說明NT-4和NTRK2對小腦的神經(jīng)保護(hù)作用主要依賴于以上神經(jīng)元的存活來維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。但是，在成年恒河猴腦組織中NT-4僅存在于浦肯野細(xì)胞中，而在顆粒層未見陽性表達(dá)［35］，這與本研究結(jié)果不一致，可能與物種差異以及機(jī)體耗氧量有關(guān)。此外，有研究顯示，NT-4在不同神經(jīng)元中的表達(dá)水平會隨著缺血缺氧性損傷增強(qiáng)而升高［12］，本研究發(fā)現(xiàn)，牦牛小腦各區(qū)域中NT-4和NTRK2蛋白免疫陽性反應(yīng)強(qiáng)度整體強(qiáng)于黃牛，推測可能與牦牛長期處于低氧環(huán)境有關(guān)。腦組織受到低氧刺激時，上述細(xì)胞被激活并誘導(dǎo)NT-4和NTRK2表達(dá)，再通過HIF-1α調(diào)節(jié)參與糖代謝和血管生成的下游蛋白的表達(dá)，有助于牦牛適應(yīng)高原低氧環(huán)境。

4 結(jié)論

NT-4和NTRK2在成年牦牛與黃牛小腦各區(qū)域中均有表達(dá)且存在顯著差異，與黃牛相比，兩種因子在牦牛小腦中的表達(dá)水平更高，提示NT-4和NTRK2除了共同參與調(diào)控機(jī)體正常的生理功能之外，也可能在牦牛小腦神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞低氧適應(yīng)過程中發(fā)揮內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)作用，進(jìn)而使腦組織免受低氧損傷。