詹勝群 葛 城 周榮杰 周 鈞

（澳優(yōu)乳業(yè)（中國）有限公司， 長沙 410200）

母乳低聚糖（HMOs）是一種多功能聚糖，是人乳中的第三大成分［1］，其結構主要由5 種基本單糖組成： 葡萄糖（Glucose， Glc）、半乳糖（Galactose， Gal）、N-乙酰葡糖氨（Nacetylglucosamine， GlcNAc）、巖藻糖（Fucose， Fuc）和N-乙酰神經氨酸（N-Acetylneuraminic acid， NeuAc），通常由半乳糖和葡萄糖與其它一種或多種單糖聚合形成多種結構［2］。HMOs 對于嬰幼兒的生長健康有著重要的意義，除了可預防感染、過敏以外，還能促進腸胃發(fā)育、增強自身免疫、預防糖尿病和心血管疾?。?-5］等。

作為嬰幼兒主要食物來源之一的嬰幼兒配方乳粉，早已朝著母乳化的方向發(fā)展，于2017 年歐盟委員會發(fā)布執(zhí)行決定（EU）2017/2201，授權批準以大腸桿菌BL21 產生的2'-巖藻糖基乳糖（2′-FL）作為新型食品成分，授權2′-FL 粉和液體濃縮物在嬰兒配方奶粉和以及較大嬰兒配方奶粉中使用。我國在2022 年發(fā)布了國食評函［2022］234 號《國家食品安全風險評估中心關于征求聚天冬氨酸鉀等11 種食品添加劑新品種相關意見的函》，其中就包括了HMOs 中含量豐富的2 種寡糖： 2′-FL 和乳糖-N-新四糖（LNnT）。但是截至今日，國內暫時沒有規(guī)定針對嬰幼兒配方乳粉中2′-FL 和LNnT 的標準檢測方法，因此，為保障嬰幼兒配方乳粉產品質量，針對嬰幼兒配方乳粉中這兩種HMOs 建立一種準確、易復現(xiàn)的檢測方法十分必要。

目前，各國學者對于HMOs的測定均有研究，主要測定方法有： 高效液相色譜法［6-9］、液相色譜-串聯(lián)質譜法［10-14］和離子色譜法［15-17］等。高效液相色譜法一般搭配紫外檢測器或熒光檢測器，但由于母乳低聚糖紫外吸收能力弱、熒光性差，一般需要先進行衍生反應［18］才能進行檢測，而且多數(shù)衍生劑存在一定毒害性，且衍生反應過程步驟復雜。Christensen 等［6］便采用了這種方式對乳粉中的2′-FL 和3′-FL 進行了測定。液相色譜-串聯(lián)質譜法也是分析低聚糖的方法之一，其快速測定、高靈敏度以及通過特征碎片進行準確定性使得該方法也是HMOs 的熱門方法之一，Mank 等［14］便采用了液相色譜-串聯(lián)質譜法分析了HMOs 和相關的人乳基團。然而，液相色譜-串聯(lián)質譜法也有其不足之處，由于低聚糖不耐熱易碳化的特性，在質譜離子源脫溶劑和離子傳輸過程中容易受熱裂解，導致響應較差重復性欠佳。離子色譜法是檢測糖類常用的方法之一，例如聚葡萄糖、低聚果糖等的國標方法便是采用離子色譜法，美國分析化學家族協(xié)會（AOAC）也收錄采用離子色譜法測定低聚半乳糖的資料文獻，如AOAC 官方方法2001.02 版：精選食品中反式低聚半乳糖含量的測定。離子色譜法通過搭載電化學檢測器，利用糖在電極表面的氧化還原反應來從而可以直接對糖類做出響應，避免對樣品進行衍生化處理［19］，因此對于母乳低聚糖的研究，采用離子色譜法能夠減少操作步驟、降低不確定因素的影響，便于實驗室后續(xù)使用。本實驗通過對嬰幼兒配方乳粉中2′-FL和LNnT的提取方式進行比對探究，并不斷調整淋洗液比例，從而建立其能夠同時檢測2′-FL和LNnT的離子色譜法，方法簡單便捷，能夠為嬰幼兒配方乳粉中2′-FL 和LNnT 含量的監(jiān)測提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

Dionex ICS-6000 型高效離子色譜儀（HPIC，美國Thermo-Fisher 公司）；Milli-Q 型超純水儀（美國Millipore 公司）；FE28 型pH 計、ME204E 型電子天平（美國METTLER TOLEDO 公司）；CarboPac? PA1 色譜柱（10.0 μm，4×250 mm）及其保護柱（10.0 μm，4×50 mm）、CarboPac ? PA200 色譜柱 （5.5 μm，3×250 mm）及其保護柱 （5.5 μm，3×50 mm） （美國Thermo-Fisher公司）。

亞鐵氰化鉀（K4［Fe（CN）6］，分析純）購自國藥集團化學試劑有限公司；乙酸鋅（（CH3COO）2Zn，分析純）和氫氧化鈉（NaOH，分析純）購自天津市科密歐化學試劑有限公司；乙酸鈉（CH3COONa，色譜純）和氫氧化鈉（NaOH，色譜純）購自美國Sigma-Aldrich 公司；半乳糖苷酶（8000 Units）、果聚糖酶混合物（20000 Units）購自愛爾蘭Megezyme 公司；低聚半乳糖（純度59.8%）、低聚果糖（純度97.0%）購自北京量子高科集團有限公司；0.22 μm 尼龍濾膜和濾紙購自上海安譜實驗科技股份有限公司；25 mL 聚丙烯注射器購自德國CNW公司；去離子水（Milli-Q超純水儀制備）。

標準品： 2′-FL（純度99.3%）、LNnT（純度89.5%）購自中國計量科學研究院；嬰幼兒配方奶粉（市售）。

1.2 分析條件

色譜柱： CarobPac PA1 及其保護柱。流動相： 流動相A 為125 mmol/L NaOH 水溶液； 流動相B 為250 mmol/L NaOH 水溶液； 流動相C 為（150 mmol/L NaOH+500 mmol/L NaAc 水溶液）/%； 流動相D 為純水。流速1.5 mL/min，進樣量25 μL； 洗脫條件如表1所示； 柱溫為30 ℃。

表1 2種HMOs的梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions of two HMOs

1.3 標準工作溶液配制

1） 2′-FL（20 mg/mL）、LNnT（10 mg/mL）標準儲備溶液： 分別稱取20 mg的2′-FL 和10 mg的LNnT 標準品，用去離子水定容至1 mL，避光于4 ℃下保存，有效期30 d。2）再分別吸取適量上述2′-FL 和LNnT的標準儲備液，用去離子水定容，配制成質量濃度為： 2′-FL（200 μg/mL）、LNnT（100 μg/mL）混合標準工作液-A和質量濃度為： 2′-FL（20 μg/mL）、LNnT（10 μg/mL）混合標準工作液-B，臨用現(xiàn)配。3）分別吸取上述混合標準工作液-B體積0.500、1.000、2.000和3.500 mL和混合標準工作液-A體積0.500和0.750 mL于10 mL 容量瓶中，用水稀釋并定容，配制成2′-FL 質量濃度為： 1.0、2.0、4.0，7.0、10.0 和15.0 μg/mL以及LNnT質量濃度為： 0.5、1.0、2.0、3.5、5.0和7.5 μg/mL的標準系列工作溶液。臨用現(xiàn)配。

1.4 前處理方法

準確稱取2 g（精確至0.0001 g）試樣，用50 mL不超過70 ℃的溫水充分溶解，冷卻至室溫后，加入沉淀劑Ⅰ（亞鐵氰化鉀150 g/L）溶液1 mL，搖勻，再加入沉淀劑Ⅱ（乙酸鋅300 g/L）溶液1 mL，搖勻，再加入1 mol/L氫氧化鈉溶液0.7 mL并搖勻，用純水定容至100 mL容量瓶，靜置20 min后，濾紙過濾，取濾液過0.22 μm聚醚砜水相針式濾器凈化，取凈化后的樣液用純水稀釋適當倍數(shù)至進樣瓶中，待測。

1.5 鑒別和測定

將試樣溶液注入離子色譜儀中，記錄色譜圖。根據(jù)保留時間定性，記錄峰面積，根據(jù)標準曲線得到待測液中各組分的質量濃度。

1.6 數(shù)據(jù)處理

液相模塊控制、數(shù)據(jù)采集和定性定量分析為Chromeleon 7.2.10 ES 軟件，實驗數(shù)據(jù)的圖形繪制和表格制作采用Excel 2019軟件和WPS Office 2022軟件。

2 結果與討論

2.1 色譜柱的影響

CarboPac? PA1 和CarboPac? PA200 色譜柱是兩種常用的糖分離柱，本文對該2 種色譜柱進行了比較，分別對2′-FL 和LNnT 輔料樣液進樣25 μL，結果如圖1 示，雖然PA200 的色譜柱粒徑更小，理應靈敏度和分離度更好，但通過譜圖比較發(fā)現(xiàn)PA1色譜柱在峰形和響應上均好于PA200（經PA1色譜柱分離后2′-FL 和LNnT 均呈現(xiàn)瘦高狀的峰，而PA200 分離后的峰形峰高不及PA1色譜柱且存在明顯不對稱的情況），且PA1對2種低聚糖的保留更強，分離度也更好，除固定相組成差異外這可能也與PA1色譜柱更大的柱容量有關，故選擇PA1作為分離柱。

圖1 2種色譜柱對（A）2′-FL和（B）LNnT的分離效果圖Fig.1 The separation effect diagrams of two chromatographic columns for （A） 2′- FL and （B） LNnT

2.2 不同凈化處理的影響

樣液不同的凈化方式對色譜柱壽命、檢測器靈敏度以及譜圖基線、色譜峰的位置和響應可能有不同程度的影響。本實驗共對比了沉淀劑法、超濾離心法和pH調節(jié)法3種去除蛋白質的方式。沉淀劑法具體處理過程為1.4節(jié)中所述，相較之下，超濾離心法主要區(qū)別在于樣品溶解冷卻后不用沉淀劑Ⅰ和沉淀劑Ⅱ沉淀，而是定容到100 mL 后取樣液用截留相對分子質量為1×104的超濾管在12000 r/min 條件下進行30 min 離心處理； pH 調節(jié)法則是參照國標方法GB 5009.89-2016《食品安全國家標準 食品中煙酸和煙酰胺的測定》，即在溶解和冷卻后50 mL樣液中用鹽酸溶液將pH值先調節(jié)至1.7±0.1，靜置2 min后再用1 mol/L 的NaOH 溶液將pH 值調節(jié)至4.5±0.1，考慮到離子色譜淋洗液為堿性，樣液在靜止1 min 后，再繼續(xù)調至pH=7.0，定容后再在10 000 r/min條件下進行10 min離心，該法在實際應用時發(fā)現(xiàn)離心后樣液渾濁，故后續(xù)未對該樣液進行上機分析。通過對沉淀劑法和超濾離心法的譜圖對比，發(fā)現(xiàn)于譜圖2 min處超濾離心法有一響應很高的雜峰，雖然對2′-FL 和LNnT 無影響，但這說明沉淀劑法對樣液中蛋白質的凈化更為徹底，故采用沉淀劑法對樣液進行凈化。

圖2 添加（A）半乳糖苷酶和（B）果聚糖酶的影響Fig.2 Effects of added （A） galactosidase and （B） fructosidase

2.3 酶解的影響

2.3.1 半乳糖苷酶的影響

半乳糖苷酶是一類能水解含半乳糖苷鍵物質的酶類，主要包括α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶，在前處理過程中引入半乳糖苷酶酶解可能有助于消除基質中乳糖、低聚半乳糖（GOS）等的干擾。選擇一款含有2′-FL 和LNnT 的奶粉樣品，通過設置半乳糖苷酶的對照試驗以進行考察。對照實驗組條件為： 移取充分溶解后的質量濃度為0.1 g/mL 的奶液0.2 mL 于10 mL 刻度試管，并添加50 μL 半乳糖苷酶以及1.8 mL 去離子水，60 ℃酶解2 h后，再用去離子水定容至10 mL并稀釋10倍，同時過C18固相萃取小柱和0.22 μm 聚醚砜針式濾器（對照組以等量的去離子水替代半乳糖苷酶）。試驗結果表明： 半乳糖苷酶可酶解2′-FL 峰左側的乳糖，而對2′-FL 無明顯酶解作用。這使得2′-FL 保留時間處基線高度明顯降低，但對于LNnT，半乳糖苷酶已將其完全酶解。故對于同時測定乳粉中的2′-FL和LNnT的方法而言，在前處理過程中用添加半乳糖苷酶的方式消除干擾并不適用，該方式僅對單獨測定乳粉中的2′-FL有效。

2.3.2 果聚糖酶的影響

針對由β-D-果糖組成的果聚糖，果聚糖酶能特異性催化水解其分子中的β-2，1 或β-2，6 糖苷鍵，此外，還可水解菊糖、蔗糖等。故在前處理過程中引入果聚糖酶酶解可能有助于消除基質中菊粉、低聚果糖（FOS）等的干擾。對照實驗參照1.4小節(jié)進行。區(qū)別之處在于酶解過程需加入硼氫化鈉和乙酸，且酶解溫度和時間分別為40 ℃和30 min。實驗結果表明，果聚糖酶對2′-FL和LNnT均無酶解作用，同時，發(fā)現(xiàn)LNnT 右側的23.4 min 處的峰消失，推測其為果聚糖。故色譜條件優(yōu)化過程中如發(fā)現(xiàn)果聚糖對LNnT峰有干擾，則可以在前處理過程中引入果聚糖酶酶解的方式消除干擾。添加半乳糖苷酶和果聚糖酶的效果見圖2所示。

2.4 稀釋倍數(shù)的影響

奶粉樣液前處理和凈化后雖然能去除大部分蛋白質等雜質，但是樣液中可溶性的單糖、雙糖等其他化合物濃度往往較高，離子強度較大，易導致色譜柱過載，出現(xiàn)基線偏高、分離度較差的情況，故需要對凈化后的樣液稀釋合適的倍數(shù)以消除影響，同時保證2′-FL和LNnT有合適的響應。對同一處理后的樣液用去離子水稀釋不同的倍數(shù)進行考察，結果表明稀釋倍數(shù)主要對2′-FL 峰和其左側的干擾峰產生影響，在稀釋5和10倍時，2′-FL 與基線未能完全分離，且峰的基線很高； 稀釋20倍后基線明顯降低，分離度基本可接受； 稀釋50倍時，基線水平平穩(wěn)，2′-FL峰與基線完全分離，但此時LNnT響應很低，可能已經不適合定量，故在兼顧2′-FL的分離度和LNnT的響應上，最終樣液的稀釋倍數(shù)在20～50倍內較為合適。

2.5 梯度洗脫條件的優(yōu)化

合適的梯度條件是色譜分離和定量準確的關鍵。在前述實驗中發(fā)現(xiàn)，未優(yōu)化的洗脫條件下樣品中LNnT的峰并不對稱，有前伸趨勢，故推測LNnT峰中有未分離雜質。通過逐步降低堿的比例對同一樣液進行分離，結果如圖3 所示，可知降低流動相中堿液的比例增加了LNnT 的保留，同時發(fā)現(xiàn)了LNnT 峰中確實有隱藏的雜質峰未能完全分離。故在此結論基礎上繼續(xù)降低堿相的比例，并調整梯度洗脫時間和流速等參數(shù)，最終得到表1中的洗脫條件，此條件下的色譜圖如圖4所示，可見優(yōu)化后的梯度洗脫條件下2′-FL 和LNnT 都得到了很好的分離，且LNnT 峰形對稱，此前在LNnT 右側緊鄰的某未知果聚糖峰也提前流出至左側，這也將減小干擾峰對LNnT的影響。

圖3 降低流動相中堿液的比例對LNnT分離的影響Fig.3 Reducing the effect of the proportion of lye in the mobile phase on LNnT separation

圖4 優(yōu)化后2′-FL和LNnT的分離效果Fig.4 Separation effect of 2′- FL and LNnT after optimization

2.6 線性范圍

合理、合適的工作曲線范圍設置是準確定量的前提。本實驗對2′-FL 和LNnT 分別設置了7 個曲線點以考察質量濃度與峰面積之間的關系，并以每次減少一個范圍上限點的方式考察的線性范圍對工作曲線斜率、相關系數(shù)的影響，結果見圖5，可知，對于2′-FL，在質量濃度范圍0.788～157.5 μg/mL（曲線范圍1）至范圍0.788～36.0838 μg/mL（曲線范圍4）過程中最小二乘法擬合出的斜率、決定系數(shù)呈增加趨勢和截距呈減小趨勢，這說明至少在曲線范圍3的質量濃度設置上是偏高的，而曲線范圍4的質量濃度設置是否合理還需進行考察； 對于LNnT，在質量濃度范圍0.579～115.8 μg/mL（曲線范圍1）至范圍0.579～11.58 μg/mL（曲線范圍4）過程中，斜率、決定系數(shù)（R2）和截距與2′-FL 同樣的規(guī)律。故在曲線范圍4 的基礎上，在各自范圍內增加了更多的點，最終確定2′-FL 和LNnT 的線性范圍分別為1.0～15.0 和0.5～7.5 μg/mL，此時線性方程斜率、截距穩(wěn)定，R2＞0.999，工作曲線見圖6。

圖5 （A） 2′-FL和（B） LNnT線性范圍設置對工作曲線的影響Fig.5 The effect of setting the linear range of （A） 2'-FL and （B） LNnT on the working curve

圖6 2′-FL和LNnT最終的線性范圍以及線性方程Fig.6 The final linear range of 2'-FL and LNnT and the linear equation

2.7 干擾實驗

GOS是一類由乳糖經β-1，4或β-1，6糖苷鍵形成的一般由3～8個半乳糖分子和1個葡萄糖殘基組成的低聚糖，F(xiàn)OS 是一類由果糖以β-2，1或β-2，6糖苷鍵連接而成的末端有連接一個葡萄糖殘基的果糖聚合物，一般聚合度為2～7，GOS和FOS均是多種聚合度不同、含量不一和結構各異的低聚糖混合物，而高效陰離子交換色譜安培檢測法（HPAEC-PAD）的分離和測定是基于這些低聚糖之間羥基解離度的細微差異和糖分子結構中的羥基在金電極表面發(fā)生氧化還原反應時產生的電流實現(xiàn)檢測，而嬰幼兒配方奶粉中通常都有添加GOS和FOS，并期望達到具有類似于 HMOs 的益生元功效，故在處理前的樣品中主動添加GOS和FOS輔料對2′-FL和LNnT的分離進行干擾，考察色譜方法的穩(wěn)定性和適用性很有必要。如圖7A 所示，通過3個不同水平添加GOS，發(fā)現(xiàn)GOS 主要有3 處色譜峰，GOS2和GOS3處在2′-FL 和LNnT峰之間，其中GOS3 的峰雖然未分離且緊鄰LNnT，但是在優(yōu)化后的色譜條件下與LNnT 依舊達到了基線分離，且在20 μg/mL的質量濃度下（相當于樣品中含量2.0 g/100 g）響應較小，而大多數(shù)樣品中GOS的添加量并不會超過該水平，故并不會對LNnT的積分定量造成影響。再由圖7B所示，在3個不同水平添加FOS，發(fā)現(xiàn)FOS主要有2處色譜峰，F(xiàn)OS1出峰較早，F(xiàn)OS2則處于2′-FL和LNnT峰之間，雖然FOS2響應較大，但FOS2與2′-FL和LNnT相距較遠，達到了完全基線分離，故也不會對積分定量過程造成影響。

圖7 GOS（A）和FOS（B）對2′-FL和LNnT的分離影響Fig.7 Effect of GOS （A） and FOS （B） on the separation of 2'-FL and LNnT

2.8 方法驗證

2.8.1 線性和精密度

線性結果見圖6。對同一奶粉樣品進行重復測定以驗證方法精密度，對同一標準溶液進行連續(xù)測定以驗證儀器精密度，根據(jù)GB/T 27417-2017《化學分析方法確認和驗證指南》要求，除2'-FL質量分數(shù)方法精密度變異系數(shù)（CV）需＜2.0%外，其它項變異系數(shù)需滿足＜2.7%，而由表2 精密度數(shù)據(jù)可知，變異系數(shù)均未超過標準要求。

表2 儀器精密度和方法精密度Table 2 Instrument precision and method precision

2.8.2 正確度

正確度采用加標回收方式進行驗證。在奶粉樣品中加入標準溶液，并混合均勻，然后按照本文所建立的分析方法進行檢測實驗，其中2′-FL 的3 個加標水平分別為1.2、0.8 和0.4 g/100 g，LNnT 的3 個加標水平分別為0.6、0.4 和0.2 g/100 g，每個加標水平進行3 次平行實驗，測定結果見表3，可知2′-FL 回收率范圍為95.97%～103.38%，平均回收率為99.60%； LNnT回收率范圍為100.09%～104.01%，平均回收率為102.06%； 結果均滿足GB/T 27417-2017《化學分析方法確認和驗證指南》對回收率95%～105%的要求。

表3 加標回收結果Table 3 The result of spiked recovery

2.8.3 檢出限和定量限

檢出限（LOD）和定量限（LOQ）的驗證采用“信噪比法”進行。即選擇一空白樣品，在前處理過程中加入接近于LOD和LOQ水平的2'-FL和LNnT參考物質，以目標分析物峰高為信號值，與一段噪音的平均高度值之比進行計算，當比值為3時，該目標分析物信號值對應的添加量為檢出限； 當比值為10時，對應添加量為定量限。結果表明，2'-FL的LOD為1.5 mg/100 g、LOQ為5 mg/100 g，LNnT的LOD為3 mg/100 g、LOQ為10 mg/100 g。

3 結 論

本實驗建立了嬰幼兒配方奶粉中2′-FL和LNnT這2種母乳低聚糖的HPAEC-PAD，在方法建立過程中對諸多影響方法正確性、穩(wěn)定性等的條件進行了考察。

在色譜柱對比中，雖然PA200 的色譜柱粒徑更小，理論上靈敏度和分離度應更好，但實際發(fā)現(xiàn)PA1 色譜柱在峰形和響應上均好于PA200。在樣液處理方式上對比了沉淀劑法、超濾離心法和pH 調節(jié)法3 種凈化方式，結果為沉淀劑法對樣液凈化更為徹底，這對色譜柱、儀器的維護均是有利的。在酶解試驗過程中，發(fā)現(xiàn)半乳糖苷酶對乳糖、LNnT 等有酶解作用，而乳糖的酶解反而有利于2′-FL 的測定，故該酶解方式僅對有需要單獨測定乳粉中的2′-FL 時有效；而果糖苷酶對2′-FL 和LNnT 均無酶解作用，但是對LNnT 有一定的干擾，如色譜分離時發(fā)現(xiàn)果聚糖對LNnT 峰有干擾且優(yōu)化色譜條件又難以分開時，則可以在前處理過程中引入果糖苷酶酶解的方式消除干擾。在梯度洗脫條件優(yōu)化過程中，發(fā)現(xiàn)不斷減低流動相中堿液的條件有利于保留和分離，故通過大量試驗得到了一種相對較優(yōu)的梯度條件，且該條件下2′-FL 和LNnT 分離度良好，在有低聚半乳糖和低聚果糖存在的樣品中也不會干擾測定，故前處理中無需引入果糖苷酶進行酶解； 而線性范圍考察過程中發(fā)現(xiàn)工作曲線點濃度設置范圍較高時線性會變差、斜率也下降，反復試驗后確定2′-FL 和LNnT 的最佳線性范圍分別為1.0～15.0 和0.5～7.5 μg/mL。

2'-FL 和LNnT 是HMOs 中含量豐富的2 種寡糖，大約占總 HMOs 的35%，目前已有不少機構可以工業(yè)規(guī)?；a，我國也已于2022 年發(fā)布了2'-FL 和LNnT 作為食品營養(yǎng)強化劑新品種的征求意見函，不少乳企將會在奶粉配方上迅速跟進，而本實驗建立的HPAEC-PAD 將有助于嬰配乳粉企業(yè)對2′-FL 和LNnT進行新產品的應用開發(fā)以及準確檢測，也可為相關機構起草相關檢測標準提供參考。