楊小林，薛敏峰，張舒，李進(jìn)波，呂亮，常向前，張佑宏，龔艷

（1湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥研究所，武漢 430064；2華中作物有害生物綜合治理農(nóng)業(yè)農(nóng)村部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430064；3湖北洪山實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；4湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，武漢 430064；5湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心，武漢 430064）

0 引言

湖北省地處長(zhǎng)江中下游，水稻一直是該省種植面積最大、總產(chǎn)最多的農(nóng)作物，播種面積占全省糧食總播種面積的50%以上，總產(chǎn)占70%左右，商品量占80%。湖北水稻在種植面積、總產(chǎn)、單產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)稻種植面積等方面多年來(lái)一直穩(wěn)居全國(guó)各省市水稻生產(chǎn)的前列（2020年排第5）。襄陽(yáng)地區(qū)是湖北省重要的水稻生產(chǎn)區(qū)，襄陽(yáng)市南漳縣武安鎮(zhèn)、城關(guān)鎮(zhèn)等地自2018年開(kāi)始，已連續(xù)多年發(fā)生水稻收獲前出現(xiàn)不明原因的不正常生長(zhǎng)現(xiàn)象：水稻植株莖稈變褐色，穗褐變，谷粒黃皮紅褐芯或黑皮紅芯；發(fā)生區(qū)域、面積逐年擴(kuò)大，因所收稻谷加工后米粒雜色，糧食收購(gòu)部門拒收，農(nóng)戶直接和間接損失逐年加重。對(duì)于此異常生產(chǎn)現(xiàn)象，襄陽(yáng)地區(qū)的水稻生產(chǎn)未有相似報(bào)道。真菌性病害水稻穗腐病(rice spikelet rot disease，RSRD)，病害初期時(shí)，穎殼上出現(xiàn)黃褐色病斑，后期病斑擴(kuò)展至整個(gè)谷粒，谷粒變成黑褐色或黑色，穗部表面覆蓋白色或黑色霉層，米?；位蜃兩Y(jié)實(shí)率下降，癟粒多，嚴(yán)重影響水稻的產(chǎn)量和質(zhì)量。目前全國(guó)多地對(duì)此病害均有報(bào)道，對(duì)引起病害的病原真菌進(jìn)行了廣泛的研究[1-2]。近年在湖北鄂東南稻區(qū)出現(xiàn)災(zāi)害[3]，發(fā)生區(qū)域、面積逐年擴(kuò)大，損失也逐年加重。包括襄陽(yáng)在內(nèi)的鄂北麥茬稻區(qū)未曾報(bào)道出現(xiàn)穗腐病害。襄陽(yáng)地區(qū)農(nóng)戶把連續(xù)多年自留的稻種用于生產(chǎn)后水稻出現(xiàn)桿枯、穗腐等不良生長(zhǎng)現(xiàn)象，而用種正確的田塊水稻生長(zhǎng)正常，有必要探明穗腐病害和用種不科學(xué)對(duì)襄陽(yáng)地區(qū)水稻生產(chǎn)的影響。2021 年9 月，湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院聯(lián)合襄陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院、襄陽(yáng)市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，對(duì)此生長(zhǎng)異常現(xiàn)象展開(kāi)實(shí)地走訪調(diào)研，對(duì)其受害原因進(jìn)行科學(xué)分析和探討，以期為保障水稻安全生長(zhǎng)提供科學(xué)指導(dǎo)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 異常生產(chǎn)情況調(diào)查與樣品采集

2021 年9 月，在湖北省襄陽(yáng)地區(qū)麥茬稻區(qū)就水稻生長(zhǎng)異常情況進(jìn)行實(shí)地調(diào)查和走訪，在水稻黃熟期分田塊采集水稻枯桿和腐穗病樣多份并分袋保存，于田塊中實(shí)地收集落粒稻谷，并將農(nóng)戶提供的自留6 年的‘黃華占’水稻種子，一并帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。

1.2 供試化學(xué)藥劑

用于毒力測(cè)定的化學(xué)藥劑自購(gòu)于市場(chǎng)。70%唑醚·丙森鋅水分散粒劑(WG)，江西眾和化工有限公司生產(chǎn)；23%醚菌·氟環(huán)唑懸浮劑(SC)，巴斯夫植物保護(hù)（江蘇）有限公司生產(chǎn)。

1.3 自留水稻種子指紋檢測(cè)

為分析農(nóng)戶多年自留稻種對(duì)水稻生長(zhǎng)的影響，對(duì)不同來(lái)源的‘黃華占’稻種進(jìn)行編號(hào)檢測(cè)：編號(hào)1 為農(nóng)戶自留第6年的‘黃華占’稻種混合樣，編號(hào)2為自留種中品相好的稻種，編號(hào)3 為自留種除去編號(hào)2 外的稻種，編號(hào)4為從田間小心收獲的‘黃華占’稻谷（即農(nóng)戶自留6年種植的），編號(hào)5為新鮮的‘黃華占’稻種，購(gòu)于正規(guī)市場(chǎng)，用于數(shù)據(jù)對(duì)照分析。采用CTAB法[4]提取水稻基因組DNA。41 對(duì)水稻特異性SSR 標(biāo)記檢測(cè)由武漢基諾賽克科技有限公司完成。

1.4 病原菌的分離、純化、形態(tài)特征觀察及柯赫氏法則驗(yàn)證

參照方中達(dá)[5]方法進(jìn)行病原菌的分離、純化和形態(tài)特征觀察。于2022年4月中旬按常規(guī)方法進(jìn)行盆栽水稻種植，每盆種植3 株為1 個(gè)重復(fù)，每菌株接種3 盆即為3次重復(fù)處理。參考前人方法于水稻揚(yáng)花期進(jìn)行針刺接種[6-7]，分生孢子液制備參照Li 等[8]方法。接種后14 d后觀察分布情況，分別取樣和分離鑒定，完成病原菌的致病性測(cè)定。以接種無(wú)菌水的‘黃華占’盆栽水稻作為對(duì)照處理(CK)。盆栽水稻置于室外，盆中保持淺水栽培，適時(shí)曬土。接種前移入玻璃溫室中，溫度控制于26℃。

1.5 分離菌分子生物學(xué)鑒定

參照黃世文等[1]的方法進(jìn)行分離真菌的ITS 鑒定。通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGC GG-3′)/ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)合成交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序交由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司完成。在NCBI上通過(guò)BLAST對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。

1.6 毒力測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法[9]測(cè)定供試藥劑對(duì)分離真菌的毒力。將供試藥劑分別配成一定濃度的稀釋液，加入常規(guī)PDA 培養(yǎng)基中，制作70%唑醚·丙森鋅WG 濃度遞度為0.7、7、21、35、70、140 μg/mL 的含藥平板，制作23%醚菌·氟環(huán)唑SC 濃度遞度為0.12、0.23、0.69、1.15、2.3、4.6 μg/mL的含藥平板。將各分離菌培養(yǎng)7 d后，沿菌落外沿切取直徑為5 mm的菌餅，置于含藥平板中央，26℃恒溫培養(yǎng)，各處理重復(fù)3 次，以不含藥劑平板作為空白對(duì)照，7 d后測(cè)量各處理的菌落直徑。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

利用SPSS 22.0 版軟件對(duì)藥劑的毒力測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行Probit 回歸分析，計(jì)算藥劑對(duì)各分離真菌的抑制中濃度EC50等，并進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離和鑒定

湖北省襄陽(yáng)市南漳縣多個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)水稻收獲前出現(xiàn)落粒、桿腐、穗腐、大量秕谷等不正常生產(chǎn)現(xiàn)象（圖1）。從病發(fā)區(qū)采集樣本，于實(shí)驗(yàn)室分離病樣，分離菌經(jīng)菌落培養(yǎng)、顯微鏡檢及分子生物學(xué)鑒定，主要獲得4種不同的菌株，分別記為XN01、XN02、XN03、XN05（圖2）。

圖1 田間采樣及標(biāo)本

圖2 病原菌培養(yǎng)形態(tài)

XN01 菌在PDA 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)初期菌絲灰白色，后期變?yōu)榛液谏?，氣生菌絲發(fā)達(dá)，表面未隆起，邊緣整齊，菌落反面中央深黑色，邊緣灰白色。菌絲短粗有隔，孢子梗短，分生孢子黑色圓形或近圓形，孢子大小約13.59 μm×14.97 μm。XN02 菌在PDA 培養(yǎng)基上初期菌絲白色，后期淡橘色，氣生菌絲發(fā)達(dá)，邊緣棕色，較齊整，菌落反面淡橘紅色。菌絲細(xì)長(zhǎng)，內(nèi)部分隔稀疏，孢子細(xì)長(zhǎng)略彎，有2～4個(gè)分隔膜，孢子大小約5.29 μm×12.10 μm。XN03 菌生長(zhǎng)菌絲淡粉紅色，氣生菌絲發(fā)達(dá)，邊緣齊整，菌落反面黃白色。菌絲細(xì)長(zhǎng)，孢子呈鐮彎形，分隔膜多個(gè)，孢子大小約6.70 μm×30.33 μm。XN05 菌菌落粉色，氣生菌絲發(fā)達(dá)，菌落表面絨狀，邊緣較齊整，菌落反面紫紅色。孢子呈紡錘形，隔膜多為3個(gè)，孢子大小約4.24 μm×13.67 μm。

利用PCR技術(shù)對(duì)XN01、XN02、XN03、XN05菌進(jìn)行ITS序列擴(kuò)增（圖3），4段序列的大小介于547～584 bp，通過(guò)BLAST比對(duì)分析供試菌株的ITS序列和已登錄的模式菌株的序列，結(jié)果表明4個(gè)菌株的ITS序列分別與登錄號(hào)為MH087476.1、MK814399.1、MH087476.1、MK079899.1的ITS序列相似性均達(dá)100%。結(jié)合形態(tài)特征，XN01 被鑒定為子囊菌門Ascomycota 糞殼菌綱Sordariomycetes 炭角菌目Xylariales 梨孢假殼科Apiosporaceae 黑孢屬Nigrospora的稻黑孢Nigrospora oryzae；XN02、XN03 和XN05 依次被鑒定為子囊菌亞門Ascomycota 糞殼菌綱Sordariomycetes 肉座菌目Hypocreales 叢赤殼科Nectriaceae 鐮孢屬Fusarium的層出鐮孢F.proliferatum、木賊鐮孢F.equiseti和禾谷鐮孢F.graminearum。

圖3 分離病菌的ITS序列PCR產(chǎn)物

于水稻揚(yáng)花期進(jìn)行人工接種，接種后14 d后調(diào)查發(fā)病情況。健康水稻在接種4種菌液后葉鞘處莖桿均大面積開(kāi)始變深褐色壞死狀（圖4）。接種XN01（稻黑孢菌），穗部出現(xiàn)淺褐色至深褐色谷粒，從谷粒尖端開(kāi)始至整個(gè)谷粒，濕度大時(shí)病谷粒外包裹白色菌絲。接種菌XN02（層出鐮刀菌），穗部谷粒多數(shù)變紫褐色，穗尖谷粒著色更深。接種菌XN03（木賊鐮刀菌），穗部谷粒出紅褐色，濕度大時(shí)整個(gè)穗部被白色菌絲包裹。接種菌XN05（禾谷鐮孢菌），穗部谷粒上100%出現(xiàn)紅褐色病斑，外面包裹白色菌絲?；厥詹幼鞑【蛛x、純化，分離菌株的培養(yǎng)性狀與原接種菌株一致。

圖4 接種XN01～XN05后稻穗和稻桿

2.2 自留水稻種的指紋檢測(cè)

經(jīng)41 對(duì)水稻特異性SSR 指紋（標(biāo)記）檢測(cè)（如圖5所示），發(fā)現(xiàn)調(diào)研時(shí)從田間收獲的‘黃華占’稻種有12個(gè)指紋不同于其他分類，即農(nóng)戶自留6 年的‘黃華占’稻種，種于田間當(dāng)年收獲所得的稻谷其檢測(cè)指紋與‘黃華占’原種有差異，可能已經(jīng)發(fā)生變異或非原種。

圖5 水稻特異性指紋檢測(cè)（部分）

2.3 防治藥劑的毒力測(cè)定

本研究獲得4種致病菌，分別是稻黑孢菌、層出鐮孢菌、木賊鐮孢菌和禾谷鐮孢菌，為明確藥劑對(duì)病原菌生長(zhǎng)的抑制作用，開(kāi)展相關(guān)藥劑的毒力測(cè)定，結(jié)果表明，70%唑醚·丙森鋅WG 對(duì)菌XN01～XN05 的EC50分別是15.2190、8.2373、7.6310、10.6223 μg/mL，23%醚菌·氟環(huán)唑SC對(duì)菌XN01～XN05的EC50分別是0.5657、0.2873、0.5623、0.9580 μg/mL，表明70%唑醚·丙森鋅和23%醚菌·氟環(huán)唑?qū)? 種菌株菌絲生長(zhǎng)均有良好的抑制作用（表1）。

表1 藥劑對(duì)XN01～XN05的毒力測(cè)定

3 結(jié)論與討論

本研究實(shí)地走訪和取樣，采取常規(guī)分析方法和分子生物學(xué)技術(shù)，從植物病理和種子變異角度，通過(guò)菌株分離和鑒定、谷種鑒定等研究，對(duì)湖北省襄陽(yáng)市南漳縣內(nèi)水稻出現(xiàn)大面積的不正常生長(zhǎng)現(xiàn)象的原因進(jìn)行了綜合解析。襄陽(yáng)市南漳縣地處湖北省西北方，一直保留稻-麥輪作方式，前茬小麥機(jī)械收割時(shí)就地粉碎秸桿，待水源充足時(shí)田塊進(jìn)行旋耕栽種水稻。農(nóng)民連續(xù)自留第6年的‘黃華占’稻種，自主育秧，人工插秧方式種于麥茬稻田，麥茬稻田未經(jīng)過(guò)深耕曬田。自留第6 年的常規(guī)稻‘黃華占’當(dāng)年所結(jié)的稻谷易提前脫落，經(jīng)41對(duì)水稻特異性SSR 標(biāo)記檢測(cè)，顯示所結(jié)稻谷不再是‘黃華占’，表明常規(guī)稻‘黃華占’在連續(xù)自留種多年后再播種，在大田生境作用下會(huì)發(fā)生物種變異，且其在田間生長(zhǎng)后期表現(xiàn)為植株衰枯。

本研究分離主要獲得4種致病菌，有稻黑孢菌、層出鐮孢菌、木賊鐮孢菌和禾谷鐮孢菌。稻黑孢菌是世界范圍內(nèi)危害植物的重要致病真菌[10]，寄主范圍廣泛，能夠侵染棉花[11]、蘆薈[12]、鐵皮石斛[13]、薄荷[14]、雜草類[15-16]等植物引起紅褐、紫褐或黑褐色葉斑病；侵染植物莖桿引起桿腐病[17]，侵染果實(shí)引起黑斑病或褐斑病[8]。2013 年報(bào)道在廣東稻區(qū)發(fā)現(xiàn)水稻稻葉褐條斑病，其病原鑒定為Nigrosporaoryzae[18]。本研究鑒定發(fā)現(xiàn)稻黑孢菌可危害水稻的葉鞘、莖桿和稻穗，危害癥狀與前人報(bào)道的相同。2016 年之前穗腐病在湖北稻區(qū)零星發(fā)生，筆者在鄂東南稻區(qū)采集穗腐病樣本，分離獲得穗腐病病原包括鏈格孢屬真菌和稻黑孢菌[3]。比較浙江稻區(qū)（鑒定病原菌有層出鐮刀菌、澳大利亞平臍蠕孢菌、鏈孢菌）[1,19]、新疆稻區(qū)（層出鐮刀菌，新月彎孢菌、細(xì)交鏈孢菌）[20]、黑龍江稻區(qū)（鏈格孢菌、鐮孢菌、青霉菌）[21]、江西稻區(qū)（厚垣鐮刀菌、細(xì)交鏈格孢菌、香茅彎孢菌、稻黑孢菌）[2]、安徽稻區(qū)（層出鐮刀菌、新月彎孢菌、細(xì)交鏈格孢菌、稻黑孢菌）[22]的穗腐病病原，發(fā)現(xiàn)引起穗腐病的病原真菌種類不同稻區(qū)具有多樣性，也有一定的共性[23]。安徽、江西和湖北稻區(qū)的穗腐病病原菌都包含稻黑孢菌，浙江、新疆稻區(qū)的穗腐病病原菌都包含層出鐮刀菌。2021 年采樣于南漳縣的水稻樣本，病狀不同于典型的穗腐病。從病理角度分析，分離獲得的致病菌中稻黑孢菌占52.4%，4種病原菌均可引起水稻葉鞘、莖桿、稻穗腐爛，谷粒發(fā)生褐變，溫室人工接種出現(xiàn)典型的穗腐病癥狀。

本研究獲得的4 種致病菌中有3 種同屬鐮孢菌。鐮孢菌是植物重要的致病菌，能夠引起植物維管束病害，導(dǎo)致病株莖干腐爛直至死亡[24]。禾谷鐮孢菌是玉米莖腐病、小麥赤霉病的主要致病菌；層出鐮刀菌是河南玉米穗腐病的優(yōu)勢(shì)致病種群[25]，作為優(yōu)勢(shì)致病菌可引起水稻穗腐[1]。木賊鐮刀菌是引起橡膠樹(shù)根部和莖基部腐爛致樹(shù)勢(shì)衰弱、葉片脫落、樹(shù)梢發(fā)黃至枯萎死亡的致病菌[24]。

綜上，南漳稻田不明原因的落粒、桿枯、穗腐及谷粒變色等不正常生長(zhǎng)現(xiàn)象，其原因認(rèn)為是農(nóng)戶自留第6 年的稻種（與第一代稻種相隔7 年）播于大田后對(duì)水稻的健康生長(zhǎng)產(chǎn)生不良影響，在生長(zhǎng)后期水稻生命力已衰弱，在適宜的氣候條件下，穗腐病病原菌的加持下，田間水稻大面積出現(xiàn)稻桿、稻穗褐變腐爛、結(jié)實(shí)率差或不結(jié)實(shí)，谷粒易脫落、稻谷紫黑色，米粒雜色等病理或非病理的不正常生長(zhǎng)現(xiàn)象。

70%唑醚·丙森鋅和23%醚菌·氟環(huán)唑?qū)χ虏【z的生長(zhǎng)均有良好的抑制作用，與他人的研究結(jié)果有相似[26]，表明施用甲氧基丙烯酸酯類、三唑類單劑或復(fù)配藥劑對(duì)稻田病害有防控作用。稻田的病原菌是否來(lái)自于土壤（育秧田還是麥茬輪作田），需作進(jìn)一步的研究。王玉正等[27]根據(jù)既要控制病蟲害增長(zhǎng)又要保護(hù)生態(tài)的原則，利用正交法研究了藥劑、烤田方式、施肥水平、水稻品種等13 種稻田主要可控因素對(duì)病蟲害防控、水稻產(chǎn)量等綜合效應(yīng)，提出了水稻病蟲害系統(tǒng)最優(yōu)控制。正確選擇和利用抗病品種[28]、科學(xué)管理及適期藥劑防治有助于水稻的安全生產(chǎn)。