宋紹森，楊 杰，段旺軍，陳思昂，王衛(wèi)民，張 力，許嘉陽，4，韓 丹，許自成，賈 瑋

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院，河南 鄭州 450046；2.四川中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，四川 成都 610011；3.浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，浙江 杭州 310009；4.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，河南 鄭州 450046）

煙草為環(huán)境敏感型作物。海拔高度是影響煙葉產(chǎn)質(zhì)量的重要生態(tài)因素之一，海拔高度不同，空氣溫濕度、光照強(qiáng)度、光照時(shí)間、降雨量等生態(tài)指標(biāo)也有所差異[1-4]。研究表明，在一定范圍內(nèi)，隨著海拔升高，煙田降雨量增多、日照時(shí)數(shù)增加、溫度降低，達(dá)到適宜煙草生長的要求，煙葉農(nóng)藝性狀較為優(yōu)良，總糖含量升高，糖堿比適宜，化學(xué)成分趨于協(xié)調(diào)，烤煙品質(zhì)顯著上升[5]。但海拔過高時(shí)，光照過強(qiáng)、溫度過低、晝夜溫差大等因素會(huì)導(dǎo)致烤煙品質(zhì)顯著下降。甚至有研究發(fā)現(xiàn)，同一種植區(qū)，海拔高度對烤煙質(zhì)量的影響顯著高于植煙土壤差異造成的影響[6-7]。目前，雖然有相關(guān)研究探討海拔與煙葉品質(zhì)的關(guān)系，但均限于海拔與烤后煙葉質(zhì)量的關(guān)系，尚未有海拔對鮮煙葉品質(zhì)影響的相關(guān)報(bào)道。

代謝組學(xué)研究始于20 世紀(jì)90 年代，由英國倫敦帝國大學(xué)NICHOLSON 等[8]提出，是一種研究生命體受外界因素干擾后體內(nèi)代謝產(chǎn)物水平變化規(guī)律的系統(tǒng)生物學(xué)。植物代謝組學(xué)是代謝組學(xué)的一個(gè)分支，可用于研究不同環(huán)境條件下植物體內(nèi)次生代謝物的變化特征[9-11]。因其能夠直接、準(zhǔn)確地反映生物體的生理狀態(tài)，揭示生命活動(dòng)機(jī)制，近年來在煙草中被廣泛應(yīng)用[12]。如MHLONGO 等[13-14]用植物防御誘導(dǎo)劑刺激煙草細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)脂多糖等植物誘導(dǎo)劑可引起煙草細(xì)胞中綠原酸的積累，進(jìn)一步運(yùn)用代謝組學(xué)方法揭示了植物中產(chǎn)生順式綠原酸異構(gòu)體的生物途徑。近年來，生態(tài)環(huán)境對煙葉代謝的影響逐漸受到學(xué)者們關(guān)注。如LI 等[15]使用代謝組學(xué)分析方法分析了河南、云南、貴州3個(gè)煙區(qū)的煙草差異代謝物及其與氣候因子（降雨、日照和溫度）的關(guān)系。SUN 等[16]采用GC-MS 技術(shù)分析了云南玉溪和湖北宣恩2 個(gè)煙草品種（翠碧-1 與中煙-100）的代謝譜，論證了不同地區(qū)2 個(gè)品種的代謝產(chǎn)物差異，并強(qiáng)調(diào)了環(huán)境和品種對煙葉代謝的影響。盡管越來越多的研究基于代謝組學(xué)分析環(huán)境因子對煙葉代謝的影響，但罕見有關(guān)海拔影響煙葉代謝的報(bào)道。因此，采用非靶向代謝組學(xué)技術(shù)探討不同海拔高度下煙葉的代謝差異特征，并結(jié)合葉片超微結(jié)構(gòu)變化規(guī)律，明確海拔因子對煙葉品質(zhì)形成的影響，為培育優(yōu)質(zhì)煙葉提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)供試烤煙品種為YKS-9，供試煙田土壤類型為紅壤。海拔1 800 m 處試驗(yàn)地紅壤基本理化性質(zhì)為有效氮含量107.24 mg/kg、速效磷含量38.35 mg/kg、有效鉀含量160.03 mg/kg、有機(jī)質(zhì)含量27.32 g/kg，pH 值6.52；海拔2 000 m 處試驗(yàn)地紅壤基本理化性質(zhì)為有效氮含量114.44 mg/kg、速效磷含量36.24 mg/kg、有效鉀含量163.04 mg/kg、有機(jī)質(zhì)含量26.02 g/kg，pH值6.42；海拔2 200 m處試驗(yàn)地紅壤基本理化性質(zhì)為有效氮含量122.12 mg/kg、速效磷含量32.07 mg/kg、有效鉀含量154.35 mg/kg、有機(jī)質(zhì)含量24.25 g/kg，pH值6.32。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2020年在四川省涼山州會(huì)東縣進(jìn)行，選取1 800、2 000、2 200 m 三種海拔高度。試驗(yàn)共設(shè)計(jì)3 組處理：海拔1 800 m（M1800）、海拔2 000 m（M2000）和海拔2 200 m（M2200）。各海拔地區(qū)試驗(yàn)地四周設(shè)保護(hù)行，每塊試驗(yàn)地面積為80 m2。煙株行距為120 cm，株距為0.5 m，每株留葉數(shù)為20～22片。各處理的煙草生產(chǎn)管理除試驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)操作的要求外，其他生產(chǎn)管理措施均按照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

1.3 測定項(xiàng)目及方法

1.3.1 煙株農(nóng)藝性狀 大田成熟期，從3 個(gè)海拔高度各選取10 株代表性煙株，參照YC/T 142—2010《煙草農(nóng)藝性狀調(diào)查測量方法》測定農(nóng)藝性狀，指標(biāo)包括株高、葉片數(shù)、莖圍、節(jié)距、腰葉長和腰葉寬。

1.3.2 烤后煙葉外觀質(zhì)量 待煙葉烘烤、分級(jí)后取C3F 檔次的烤煙，按照GB 2635—1992 測定方法對煙葉外觀質(zhì)量進(jìn)行評定。

1.3.3 烤后煙葉常規(guī)化學(xué)成分 待煙葉烘烤、分級(jí)后取C3F 檔次的烤煙，采用近紅外光譜法檢測常規(guī)化學(xué)成分。

1.3.4 烤后煙葉感官質(zhì)量 待煙葉烘烤、分級(jí)后取C3F檔次的烤煙，參照YC/T 530—2015，由評吸專家對其感官質(zhì)量進(jìn)行打分評判。

1.3.5 鮮煙葉超微結(jié)構(gòu) 待煙草生長發(fā)育至大田成熟期，各處理選取10 株代表性煙株，對從下往上數(shù)第10 葉位煙葉進(jìn)行取樣。取樣時(shí)煙葉樣品必須保證盡可能新鮮，1～3 min 完成取樣，樣品組織大小2 mm×2 mm，盡量薄。將樣品組織投入電鏡固定液（2.5%戊二醛），用濾紙將樣品組織塞進(jìn)固定液內(nèi)，不能使其漂浮在固定液表面，4 ℃冰袋保存。

使用0.1 mol/L 磷酸緩沖液（pH 值7.4）漂洗煙葉樣品組織后，再進(jìn)行后固定處理，然后依次放入30%、50%、70%、80%、95%、100%、100%乙醇中進(jìn)行脫水。完成脫水處理后，依次進(jìn)行滲透包埋、聚合處理、切片和染色。最后，將銅網(wǎng)盒內(nèi)干燥的樣品放置在透射電子顯微鏡下進(jìn)行觀察，采集圖像。

1.3.6 鮮煙葉代謝組的測定 待煙草生長發(fā)育至大田成熟期，各處理選取10 株代表性煙株，對從下往上數(shù)第10 葉位煙葉進(jìn)行取樣。使用AB Triple TOF 6600 質(zhì) 譜 儀 和Agilent 1290 Infinity LC 超 高 壓液相色譜儀進(jìn)行代謝組學(xué)試驗(yàn)，取樣時(shí)避開葉脈，用剪刀剪碎煙葉，迅速放入用液氮預(yù)冷的離心管中，將離心管置于干冰中保存運(yùn)輸。將煙葉樣本在4 ℃環(huán)境下緩慢解凍后，取適量樣本加入預(yù)冷甲醇/乙腈/水溶液（2∶2∶1，V/V），渦旋混合，低溫超聲30 min，-20 ℃靜 置10 min，14 000×g4 ℃離 心20 min，取上清真空干燥，質(zhì)譜分析時(shí)加入100 μL乙腈/水溶液（1∶1，V/V）復(fù)溶，渦旋，14 000×g4 ℃離心15 min，取上清液進(jìn)樣分析。

上清液采用Agilent 1290 Infinity LC 超高效液相色譜系統(tǒng)（UHPLC）HILIC 色譜柱進(jìn)行分離，樣本隊(duì)列中插入質(zhì)量控制樣品（QC 樣品），用于監(jiān)測和評價(jià)系統(tǒng)的穩(wěn)定性及試驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。對得到的數(shù)據(jù)，首先進(jìn)行代謝物結(jié)構(gòu)鑒定、數(shù)據(jù)預(yù)處理，然后進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)質(zhì)量評價(jià)，最后再進(jìn)行單變量統(tǒng)計(jì)分析、多維統(tǒng)計(jì)分析、差異代謝物篩選、差異代謝物相關(guān)性分析、KEGG通路分析等數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同海拔高度對煙株農(nóng)藝性狀和烤后煙葉品質(zhì)的影響

2.1.1 煙株農(nóng)藝性狀 農(nóng)藝性狀能夠直觀地反映植物本身的生長狀態(tài)，整體來看，煙株長勢以M2000 處理最好，相較于M2200 處理，株高、葉片數(shù)、莖圍、腰葉長和腰葉寬分別提高了11.0%、23.0%、5.2%、16.3% 和17.0%（表1）。M2000 和M1800 處理的葉片數(shù)、腰葉長和腰葉寬均高于M2200 處理，除M1800 處理株高和莖圍顯著低于M2000 處理外，M2000 與M1800 處理其余指標(biāo)差異均不顯著。由此可知，M2000 處理煙株農(nóng)藝性狀表現(xiàn)較好，而M1800、M2200處理表現(xiàn)稍差。

表1 不同海拔高度對煙株農(nóng)藝性狀的影響Tab.1 Effect of different altitudes on agronomic traits of tobacco plants

2.1.2 烤后煙葉外觀質(zhì)量 如表2 所示，3 個(gè)海拔高度處理的烤煙外觀質(zhì)量幾乎相同，僅M2200 處理烤后煙葉身份和油分指標(biāo)分別表現(xiàn)為稍薄—中等和有—稍有，略差于M1800、M2000處理。

表2 不同海拔高度對烤后煙葉外觀質(zhì)量的影響Tab.2 Effects of different altitudes on appearance quality of flue-cured tobacco

2.1.3 烤后煙葉化學(xué)成分 不同海拔高度對烤煙化學(xué)成分的影響如表3所示，整體來看，隨著海拔高度的升高，烤煙的還原糖、總糖、總煙堿含量均呈先升高后降低的趨勢，其中M2000 處理總糖、還原糖、總煙堿的含量最高，顯著高于M1800、M2200 處理，M1800 和M2000 處理糖堿比和氮堿比顯著低于M2200 處理，糖堿比更接近10，氮堿比在0.8 左右，均處于適宜范圍。整體而言，與M1800 和M2200 處理相比，M2000 處理烤煙兩糖含量較高、化學(xué)成分更加協(xié)調(diào)。

表3 不同海拔高度對烤后煙葉化學(xué)成分的影響Tab.3 Effects of different altitudes on chemical quality of flue-cured tobacco

2.1.4 烤后煙葉感官質(zhì)量 感觀質(zhì)量是烤煙品質(zhì)好壞最直觀的評判依據(jù)，不同海拔高度對烤后煙葉感官質(zhì)量的影響如表4 所示，總分結(jié)果為M2000＞M1800＞M2200，其中M2000 處理的香氣量、雜氣、柔和度、干燥感、余味得分均高于其他處理，而M1800處理的香氣質(zhì)和細(xì)膩度高于M2200 處理。M2000處理C3F 等級(jí)烤后煙葉感官質(zhì)量評價(jià)分?jǐn)?shù)較高，煙葉質(zhì)量較好。

表4 不同海拔高度對烤后煙葉感官質(zhì)量的影響Tab.4 Effects of different altitudes on sensory quality of flue-cured tobacco

總之，從煙株農(nóng)藝性狀，烤后煙葉外觀質(zhì)量、化學(xué)成分和感官質(zhì)量四方面綜合判斷，2 000 m海拔處的煙葉質(zhì)量最好。

2.2 不同海拔高度對鮮煙葉超微結(jié)構(gòu)的影響

液泡是植物細(xì)胞特有的細(xì)胞器，具有貯藏營養(yǎng)物質(zhì)、維持細(xì)胞滲透壓、促進(jìn)物質(zhì)交流等多種生理功能。隨著海拔的升高，煙葉細(xì)胞內(nèi)的液泡呈現(xiàn)出增大的趨勢（圖1）。

圖1 不同海拔高度下鮮煙葉葉肉細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)（比例尺=20.0 μm）Fig.1 Submicroscopic structure of tobacco leaf mesophyll cells under different altitudes（bar=20.0 μm）

較低海拔高度下，葉綠體貼細(xì)胞壁排列且有部分淀粉粒產(chǎn)生（圖1a、b），隨著海拔高度的不斷升高，葉綠體內(nèi)累積的淀粉粒數(shù)目逐漸增多，體積逐漸增大，M2200 處理葉肉細(xì)胞內(nèi)的葉綠體向細(xì)胞中間轉(zhuǎn)移（圖1b、c）。

如圖2a—c 所示，M1800 處理煙葉細(xì)胞葉綠體中的基粒片層較多，隨著海拔高度升高，葉綠體中嗜鋨顆粒體積明顯增大。M1800 處理葉綠體的基粒數(shù)目較多、類囊體垛疊程度清晰完整，而M2200處理葉綠體基粒片層數(shù)與類囊體垛疊程度明顯降低，類囊體被膜逐漸降解，結(jié)構(gòu)變得不完整。

圖2 不同海拔高度下鮮煙葉葉綠體及線粒體超微結(jié)構(gòu)（比例尺=1.0 μm）Fig.2 Ultrastructure of tobacco leaf chloroplasts and mitochondria under different altitudes（bar=1.0 μm）

海拔高度的升高造成植物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生更多、更小的線粒體（圖2d—f）。高海拔下的植物細(xì)胞線粒體和葉綠體逐漸靠近，分布間距變小，甚至出現(xiàn)了線粒體嵌入葉綠體內(nèi)部的現(xiàn)象（圖2e、f）。

2.3 不同海拔高度對鮮煙葉代謝物的影響

2.3.1 總體樣本主成分分析（PCA） 從圖3 可以看出，正、負(fù)離子模式下QC 樣本緊密聚集在一起，這說明試驗(yàn)的重復(fù)性好，數(shù)據(jù)可靠。M1800、M2000、M2200 三個(gè)處理均處不同象限，間隔較遠(yuǎn)，表明各組樣品間差異顯著。

圖3 正、負(fù)離子模式總體樣本的PCA分析Fig.3 PCA analysis of overall samples under positive and negative ion modes

2.3.2 代謝物鑒定 正負(fù)離子模式合并后共鑒定到354 種代謝物，其中正離子模式下鑒定到212 種代謝物，負(fù)離子模式下鑒定到179 種。各代謝物的化學(xué)分類歸屬信息如圖4 所示。鑒定到的代謝物中，有機(jī)酸及其衍生物占比最大，達(dá)13.559%；其次是有機(jī)氧化合物，占比12.147%；之后是脂質(zhì)及類脂質(zhì)分子，占比10.452%。

圖4 鑒定的代謝物在各化學(xué)分類的數(shù)量占比Fig.4 The number proportion of identified metabolites in various chemical classification

2.3.3 差異代謝物篩選 經(jīng)由OPLS-DA（正交偏最小二乘判別分析）模型得到變量權(quán)重值（Variable importance for the projection，VIP）。 本 試 驗(yàn) 以O(shè)PLS-DA VIP＞1 和P＜0.05 為顯著差異代謝物篩選標(biāo)準(zhǔn)。

經(jīng)數(shù)據(jù)處理后，共篩選出102 種顯著差異代謝物，如圖5 所示，M1800、M2200 處理與M2000 處理間分別存在68、56 種差異代謝物。M1800 vs M2000組有18 種特有的差異代謝物，表明這18 種差異代謝物對海拔1 800～2 000 m 變化的響應(yīng)更為強(qiáng)烈。而M2000 vs M2200 組中特有的差異代謝物僅有3種，表明這3 種差異代謝物對海拔2 000～2 200 m變化的響應(yīng)更為強(qiáng)烈。而M1800 vs M2200 組中特有差異代謝物有9種，而這9種代謝物在另外2組中變化不顯著，表明這些物質(zhì)是通過緩慢積累來響應(yīng)海拔高度的變化。整體來看，3 個(gè)對比組中有13 種共同差異代謝物，與其他代謝物相比，這13 種代謝物可能更易受到海拔高度變化的擾動(dòng)。

圖5 不同海拔處理間煙葉差異代謝物Venn圖Fig.5 Venn diagram of differential metabolites in tobacco leaf treated at different altitudes

2.3.4 差異代謝物鑒定 隨著海拔高度的變化，代謝物差異倍數(shù)的變化趨勢如圖6A、B 所示，整體而言，L-天冬酰胺、L-色氨酸、L-組氨酸、煙酰胺、D-脯氨酸、L-谷氨酰胺、2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇、D-葡萄糖酸鹽、2，3-二羥基-3-甲基丁酸、莽草酸、間氯硫嘌呤酸、泛酸、胸苷、二氫胸腺素、α-D-葡萄糖、D-來蘇糖等代謝物差異倍數(shù)大于1，顯著上調(diào)，表明此類差異代謝物在低海拔（1 800 m）地區(qū)相對含量較高。而L-苯丙氨酸、檸檬酸、丙醇二酸、腺嘌呤、鳥苷、奎尼酸、綠原酸、莨菪亭、山奈酚、蕓香苷（蘆?。Ⅺ溠刻?、蔗糖、D-塔格糖、D-甘露糖、D-阿洛糖、新煙堿等差異代謝物差異倍數(shù)小于1，呈顯著下調(diào)趨勢，表明這些差異代謝物在高海拔地區(qū)（2 200 m）相對含量較高，在低海拔（1 800 m）地區(qū)相對含量較低，且差異顯著。

圖6 不同海拔處理間煙葉差異代謝物鑒定信息Fig.6 Differential metabolites identification information in tobacco leaf treated at different altitudes

但由圖6C—F 發(fā)現(xiàn)，隨海拔高度的變化，多數(shù)物質(zhì)相對含量變化趨勢也會(huì)發(fā)生改變。如D-甘露糖、D-阿洛糖、D-塔格糖、奎尼酸、琥珀酸鹽、L-天門冬氨酸、L-瓜氨酸、D-半乳糖醛酸、L-蘇氨酸、D-脯氨酸、2，3-二羥基-3-甲基丁酸等代謝物差異倍數(shù)的變化趨勢為在M1800 vs M2000 組中顯著下調(diào)，在M2000 vs M2200 組中顯著上調(diào)，表明此類差異代謝物相對含量隨著海拔升高呈先升后降的趨勢。而L-色氨酸、L-異亮氨酸、文多靈堿、異莨菪亭、4-氨基丁酸、3-甲基吲哚、二十碳五烯酸、薰衣草醇等物質(zhì)的差異倍數(shù)則在M1800 vs M2000 組中顯著上調(diào)，在M2000 vs M2200 組中顯著下調(diào)，表明其相對含量隨著海拔升高呈先降后升的趨勢。但也有一些物質(zhì)在2 組對比中表現(xiàn)出相同的變化趨勢，如腺嘌呤和綠原酸，它們的差異倍數(shù)在M1800 vs M2000組和M2000 vs M2200組中均呈顯著下調(diào)趨勢。

2.3.5 代謝網(wǎng)絡(luò)分析 如圖7 所示，不同海拔之間的差異代謝物主要集中在氨基酸代謝、半乳糖代謝、果糖和甘露糖代謝、莽草酸代謝、TCA 循環(huán)、嘌呤代謝等通路中。在糖類的相關(guān)代謝途徑中，D-半乳糖酸、D-甘露糖、D-阿洛糖、D-塔格糖的含量隨海拔升高呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢，而D-果糖、蔗糖、乳糖含量則在M2200 處理中升高，果糖含量在M2200 處理升高的原因可能為D-阿洛糖和D-塔格糖的轉(zhuǎn)化，同時(shí)，也正因?yàn)镈-果糖、蔗糖、乳糖含量在M2200 處理中較高，它們的分解產(chǎn)物α-D-葡萄糖含量在M2000 以及M2200 處理中下調(diào)的趨勢得到緩解；嘌呤代謝中，L-谷氨酰胺含量隨海拔升高急劇下降，鳥嘌呤、腺苷含量急劇上升，這也是一種受海拔高度影響的較為直接的轉(zhuǎn)化關(guān)系。根據(jù)烤煙品質(zhì)以及超微結(jié)構(gòu)的變化趨勢綜合考量發(fā)現(xiàn)，烤煙品質(zhì)也是隨海拔的升高呈現(xiàn)出先升后降的趨勢，在海拔2 000 m處最優(yōu)。因此，α-D-葡萄糖、D-半乳糖酸、D-甘露糖、D-阿洛糖、D-塔格糖等糖類物質(zhì)，莽草酸、奎尼酸、琥珀酸等有機(jī)酸，苯丙氨酸、丙氨酸、脯氨酸等氨基酸，這些差異代謝物含量的變化趨勢與煙株品質(zhì)變化趨勢較為一致或完全相反，表明這些差異代謝物在受到海拔因素調(diào)控的同時(shí)，也較易受到煙株自身代謝系統(tǒng)的調(diào)控，且該類物質(zhì)可能與煙株品質(zhì)密切相關(guān)。值得注意的是，苯丙氨酸與脯氨酸含量雖先升后降，但與M1800 處理相比，M2200 處理仍有上調(diào)趨勢。隨著海拔高度的升高，蔗糖、乳糖、D-果糖、組氨酸、L-谷氨酰胺、鳥苷、腺嘌呤等物質(zhì)的含量遞增或遞減，表明此類物質(zhì)可能對海拔變化的響應(yīng)更為強(qiáng)烈，其含量與海拔高度直接相關(guān)。

圖7 不同海拔高度下煙葉差異代謝物的網(wǎng)絡(luò)分析Fig.7 Network analysis of differential metabolites in tobacco at different altitudes

2.3.6 KEGG 途徑富集分析 根據(jù)農(nóng)藝性狀以及代謝物特征結(jié)果發(fā)現(xiàn)，M2000 處理煙株長勢最好，3 種不同海拔高度煙株的烤后煙葉品質(zhì)整體呈先升后降的趨勢。因此，以M1800 vs M2000 和M2000 vs M2200 兩組對比為主進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，對篩選出的差異代謝通路進(jìn)行差異豐度得分比較（圖8）。M1800 vs M2000對比下共篩選出27個(gè)代謝通路，而M2000 vs M2200 對比下僅篩選出18 個(gè)代謝通路。其中氨基酸代謝相關(guān)通路中，2 個(gè)對比組均有6 條代謝通路，但隨著海拔高度上升，除纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成代謝通路的表達(dá)趨勢無明顯變化，色氨酸代謝通路的表達(dá)呈先降后升趨勢外，其余氨基酸代謝通路的表達(dá)均呈先升后降的趨勢；碳水化合物代謝途徑中，僅半乳糖代謝和丙酮酸代謝的表達(dá)隨海拔升高呈先升后降的趨勢，其余碳水化合物代謝途徑的表達(dá)趨勢均表現(xiàn)為在海拔1 800～2 000 m 顯著上升，在海拔2 000～2 200 m 無顯著變化；脂質(zhì)代謝、膜運(yùn)輸、輔助因子和維生素的代謝、其他氨基酸的代謝、翻譯等代謝途徑中，除不飽和脂肪酸的生物合成、β-丙氨酸的代謝以及氨?；?tRNA 的生物合成3 種代謝通路的表達(dá)在海拔1 800～2 000 m 隨海拔升高而下降，在海拔2 000～2 200 m處無顯著差異外，其余代謝通路均表現(xiàn)出先升后降，或先無顯著變化后降低的表達(dá)趨勢。整體而言，在海拔1 800～2 000 m下，隨高度升高，煙株代謝通路的表達(dá)多呈現(xiàn)升高的趨勢；而在海拔2 000～2 200 m，隨高度升高，煙株代謝通路的表達(dá)多數(shù)為降低趨勢。

圖8 所有差異代謝通路的差異豐度得分Fig.8 Differential abundance score of all the differential metabolic pathways

3 結(jié)論與討論

3.1 海拔高度對煙草品質(zhì)的影響

整體而言，不同海拔處理烤煙的農(nóng)藝性狀、外觀質(zhì)量、化學(xué)質(zhì)量、評吸質(zhì)量指標(biāo)表現(xiàn)為M2000＞M1800＞M2200，隨著海拔高度的增加，烤后煙葉品質(zhì)呈先升高后降低的趨勢。這一變化規(guī)律與魏國平等[4]、李雪芳等[5]的研究結(jié)果一致，均表現(xiàn)為在某一海拔高度區(qū)間內(nèi)，隨著海拔的升高，烤煙產(chǎn)質(zhì)量先升后減。其主要原因在于煙草種植的海拔高度不同，煙株生長發(fā)育所處氣候環(huán)境不同，環(huán)境溫濕度、光照強(qiáng)度、光照時(shí)間等生態(tài)指標(biāo)隨之改變，在適宜的海拔高度下，煙株生長的環(huán)境條件良好，農(nóng)藝性狀較為優(yōu)良，烤煙品質(zhì)顯著上升。但當(dāng)海拔過高時(shí)，高海拔地區(qū)的天氣變化會(huì)使煙草遭受冷脅迫，損害煙葉的產(chǎn)質(zhì)量。LI等[17]發(fā)現(xiàn)，海拔2 450 m以上的煙草種植區(qū)，晝夜溫差突變（日氣溫下降20 ℃以上）和降雨會(huì)對大田種植煙草造成冷脅迫；而OVERSTREET 等[18]研究表明，冷脅迫會(huì)降低鮮煙葉的品質(zhì)。在海拔高度的變化過程中，光照強(qiáng)度、輻射、溫度等環(huán)境因素的變化可能是調(diào)控?zé)煵輧?nèi)部代謝，影響烤后煙葉最終品質(zhì)的關(guān)鍵因素。

3.2 海拔高度對煙葉超微結(jié)構(gòu)的影響

本研究表明，隨著海拔的升高，煙葉細(xì)胞內(nèi)的液泡體積變大，淀粉粒數(shù)目逐漸增多，但是葉綠體片層數(shù)和類囊體垛疊程度降低，而夏春等[19]發(fā)現(xiàn)，隨著液泡面積增大，植物細(xì)胞中葉綠體等細(xì)胞器數(shù)量減少，與本研究結(jié)論一致。說明高海拔地區(qū)對煙株產(chǎn)生了一定的非生物脅迫，促使煙葉細(xì)胞改變其自身結(jié)構(gòu)來抵御此類脅迫。

海拔高度過高時(shí)，會(huì)對植物產(chǎn)生低溫、強(qiáng)輻射等脅迫效應(yīng)，淀粉粒的積累是高海拔植物對低溫環(huán)境的一種適應(yīng)性表現(xiàn)，隨著海拔高度的升高，葉綠體內(nèi)累積的淀粉粒數(shù)目逐漸增多，體積逐漸增大；海拔高度過高時(shí)，強(qiáng)輻射等脅迫效應(yīng)促使葉綠體的基粒片層數(shù)和類囊體垛疊程度在膜結(jié)構(gòu)的降解下逐漸降低，結(jié)構(gòu)被破壞[20]。葉綠體片層數(shù)減少、片層垛疊程度降低也可能是葉肉細(xì)胞在高海拔地區(qū)的適應(yīng)性變化，這種變化能有效地降低植物的光捕獲能力，從而保護(hù)葉綠體免受捕獲過多光能所造成的傷害[21-22]。本研究中，在2 200 m 高度下，葉肉細(xì)胞內(nèi)的葉綠體向細(xì)胞中間轉(zhuǎn)移，這可能是由于高海拔下，紫外輻射較強(qiáng)，光能相對豐富甚至過剩，葉綠體位置內(nèi)移甚至在細(xì)胞中央分布，可以有效地減少光線的直接穿透，避免強(qiáng)輻射的灼傷；海拔高度的升高造成植物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生更多、更小的線粒體，低CO2分壓下生長的高山植物通過增加線粒體數(shù)目、縮小線粒體體積從而擴(kuò)大內(nèi)膜系統(tǒng)來提高植物的呼吸速率，保證植物即使處于極端環(huán)境中，也有正常的能量供應(yīng)。以上這些變化都是植物對高海拔環(huán)境的一種有效適應(yīng)。王玉萍等[23]發(fā)現(xiàn)，珠芽蓼葉片中嗜鋨顆粒與淀粉粒的數(shù)目隨海拔升高而增加，而葉綠體基粒數(shù)目和類囊體垛疊程度均隨海拔升高呈現(xiàn)先升后降的趨勢，與本研究結(jié)論基本一致。

本研究中，高海拔下的植物細(xì)胞線粒體和葉綠體逐漸靠近，分布間距變小，甚至出現(xiàn)線粒體嵌入葉綠體內(nèi)部的現(xiàn)象。這種“零接觸”現(xiàn)象作為植物適應(yīng)高海拔條件的特殊生存方式，是為了縮短兩者之間代謝物質(zhì)、能量和氣體的運(yùn)輸和交換距離，提高植物物質(zhì)與能量利用的有效性[24]。

3.3 海拔高度對煙葉代謝物的影響

差異代謝物分析結(jié)果表明，除α-D-葡萄糖、D-來蘇糖以外，多數(shù)糖類物質(zhì)以及山奈酚、蕓香苷、莨菪亭等多酚類香氣物質(zhì)的相對含量隨著海拔升高呈顯著上升趨勢；而多數(shù)氨基酸類化合物的相對含量隨著海拔的升高呈顯著下降趨勢。結(jié)合代謝網(wǎng)絡(luò)分析與KEGG 富集途徑分析發(fā)現(xiàn)，多數(shù)糖類代謝通路、氨基酸的生物合成代謝通路的表達(dá)及其相關(guān)代謝物相對含量的變化均呈先升后降趨勢，如D-脯氨酸、丙氨酸參與的丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑，莽草酸、奎尼酸參與的莽草酸代謝途徑（苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成）以及D-半乳糖酸、D-甘露糖、D-阿洛糖、D-塔格糖參與的相關(guān)糖類代謝途徑，這些差異代謝物的含量及其所在的代謝通路表達(dá)趨勢在海拔1 800～2 000 m 升高的原因可能是，在適宜的海拔高度會(huì)促進(jìn)煙草的生長發(fā)育，使烤煙煙葉內(nèi)含物增多，化學(xué)成分更加協(xié)調(diào)，而在海拔2 000～2 200 m，因海拔高度過高，氣溫較低，光照過強(qiáng)，煙株部分生理代謝功能受到抑制，此時(shí)，煙株體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生一系列的變化來應(yīng)對外界環(huán)境脅迫，如產(chǎn)生嘌呤類物質(zhì)以緩解輻射脅迫，增加糖類物質(zhì)以及部分氨基酸的積累以緩解冷脅迫[25]。

蔗糖可被水解為葡萄糖和果糖，為植物生理代謝功能運(yùn)轉(zhuǎn)提供能量，其含量增加是植物在逆境中生長發(fā)育的基礎(chǔ)。在植物應(yīng)對強(qiáng)輻射脅迫的過程中，核苷類物質(zhì)扮演著重要角色，過強(qiáng)的紫外線照射可使DNA 分子中同一條鏈兩相鄰的胸腺嘧啶堿基之間形成二聚體，影響DNA 的雙螺旋結(jié)構(gòu)，使其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄功能均受到阻礙，故胸苷、二氫胸腺素的相對含量因海拔過高而下降；而腺嘌呤是維持生物體代謝功能的必要成分，鳥苷的重要組成部分之一鳥嘌呤則對紫外線有強(qiáng)烈的吸收性，故兩者含量隨著海拔高度升高而升高。

植物遭受冷脅迫時(shí)，苯丙氨酸不但是多酚類物質(zhì)生成的重要前體物，在寒冷條件下還可激活植物體內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)來提高植物自身的耐寒性[26]。隨著海拔高度的改變，多數(shù)氨基酸相對含量在2 200 m 處下調(diào)，而L-苯丙氨酸相對含量在代謝網(wǎng)絡(luò)圖中海拔2 200 m 處較高，可能與植物抵御冷脅迫的機(jī)制有關(guān)。而苯丙氨酸經(jīng)過苯丙烷途徑的降解，其轉(zhuǎn)化生成的多酚類物質(zhì)也隨海拔升高而升高。多酚類物質(zhì)對植物生長和植物防御機(jī)制至關(guān)重要，同時(shí)也是煙草中重要的香味物質(zhì)，很大程度上影響著烤煙的香吃味。大量研究表明，酚類物質(zhì)往往具有抗氧化能力，多酚的積累可以保護(hù)細(xì)胞免受低溫應(yīng)激產(chǎn)生自由基所引起的氧化損傷[27-28]，SUN等[16]研究表明，煙葉中多酚含量主要受溫度和陽光照射的影響，與溫度呈負(fù)相關(guān)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，奎尼酸、綠原酸、莨菪亭、山奈酚、蕓香苷（蘆?。┑榷喾宇愇镔|(zhì)相對含量隨海拔升高而升高，該結(jié)論與此前報(bào)道[29-30]基本一致。

綜上，根據(jù)烤煙質(zhì)量評價(jià)結(jié)果以及代謝組學(xué)鑒定結(jié)果綜合考量發(fā)現(xiàn)，隨海拔升高，涼山會(huì)東煙區(qū)煙株品質(zhì)整體呈現(xiàn)先升后降的趨勢，以海拔2 000 m處的烤煙品質(zhì)最好，海拔升高至2 200 m 處烤煙品質(zhì)較差；隨海拔升高，煙葉細(xì)胞內(nèi)液泡體積增大，線粒體數(shù)目增多，葉綠體內(nèi)淀粉粒數(shù)目增多，體積增大，但葉綠體片層數(shù)和垛疊程度減少，線粒體與葉綠體間開始出現(xiàn)“零接觸”現(xiàn)象；氨基酸代謝、糖類代謝、莽草酸代謝途徑發(fā)生顯著變化，在響應(yīng)海拔高度變化的過程中起著關(guān)鍵作用。