曾婉寧，王彥譞，王繁珍，陳招榮，劉慧芹，，姜永成，艾則麥提·圖爾洪，李寶通，

（1.天津農(nóng)學(xué)院 園藝園林學(xué)院，天津 300384；2.天津農(nóng)學(xué)院 計(jì)算機(jī)與信息工程學(xué)院，天津 300384；3.和田職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆 和田 848000；4.天津農(nóng)學(xué)院 工程技術(shù)學(xué)院，天津 300384）

番茄葉霉病是由黃褐孢霉菌（Cladosporium fulvumCooke）引發(fā)的番茄上一種極為嚴(yán)重的葉部病害。葉霉病一旦發(fā)生，會(huì)迅速擴(kuò)展，流行性極強(qiáng)，其防治往往是在加強(qiáng)栽培管理的基礎(chǔ)上，依靠化學(xué)藥劑防治控制病情[1]。但是化學(xué)藥劑防治病害造成的病原菌抗藥性增強(qiáng)、環(huán)境污染、農(nóng)產(chǎn)品安全等問(wèn)題日益嚴(yán)重。生物防治以其安全、健康、綠色的理念受到廣泛關(guān)注[2-5]。目前的研究表明，芽孢桿菌因其種類繁多、存在廣泛、功能豐富、適應(yīng)性強(qiáng)，已成為植物病害生物防治中重要的菌種資源[6-10]。因此，深入開展芽孢桿菌對(duì)番茄葉霉病的生物防治研究，對(duì)進(jìn)一步探明芽孢桿菌的生防機(jī)制及開展番茄葉霉病的綠色綜合防控具有重要意義。近年來(lái)，眾多學(xué)者在番茄葉部病害生物防治方面開展了生防菌挖掘篩選、生防效果和作用機(jī)制等的深入研究。WANG 等[11]研究表明，枯草芽孢桿菌WXCDD105 對(duì)番茄葉霉病的防效可達(dá)72.07%，對(duì)番茄種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)均有促進(jìn)作用。GAO 等[12]篩選了28 株拮抗細(xì)菌，其中貝萊斯芽孢桿菌ZSY-1 對(duì)番茄多種葉部病害有突出防效，且該菌可產(chǎn)生脂肽類抗菌物質(zhì)伊枯草菌素A。SONG 等[13]的研究表明，高地芽孢桿菌B1-15 可產(chǎn)生揮發(fā)性有機(jī)物和較高水平的蛋白酶，有效促進(jìn)番茄幼苗生長(zhǎng)，減輕果實(shí)采后病害，延長(zhǎng)貯藏期。此外，芽孢桿菌的微生物菌劑、微生物菌肥、微生物農(nóng)藥等生防產(chǎn)品的研發(fā)應(yīng)用都取得了巨大進(jìn)展[14]。目前，我國(guó)建立了較為完善的有害生物生防體系，形成了農(nóng)用微生物菌劑和微生物肥料的標(biāo)準(zhǔn)體系，對(duì)引導(dǎo)和規(guī)范行業(yè)發(fā)展發(fā)揮著重要作用[15-16]。暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamensis）是芽孢桿菌屬近10 a 研究發(fā)現(xiàn)的新種[17]，因其廣譜抗菌性及具有其他生物活性成為極具有開發(fā)潛力的新型芽孢桿菌[18]。暹羅芽孢桿菌Y-54 是從健康紅掌分離出的一株內(nèi)生拮抗菌，對(duì)多種植物病原真菌有較強(qiáng)的抑制作用[19]。該菌株及其應(yīng)用已于2021 年獲國(guó)家發(fā)明專利（專利號(hào)：20202010730157.5）。目前，雖然對(duì)番茄葉部病害生物防治的研究較為深入，但能夠有效抑制番茄葉霉病菌并對(duì)該病害有突出防效的拮抗菌株還較少，涉及生防菌定殖情況和促生表現(xiàn)等的研究不夠全面深入。因此，需要深入挖掘生防資源并就其功能和機(jī)制開展研究。為深入挖掘菌株Y-54 的生防潛力和擴(kuò)寬應(yīng)用范圍，研究該菌株對(duì)番茄葉霉病菌的抑制作用及其定殖變化和促生作用，并分析其在盆栽試驗(yàn)中的防治效果，以期為番茄葉部病害的綠色防控提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試菌種：暹羅芽孢桿菌（B.siamese）Y-54、番茄葉霉病菌（C.fulvumCooke），由天津農(nóng)學(xué)院植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供；番茄品種：春野、精品L400，由遼寧綠野農(nóng)業(yè)科技有限公司提供；培養(yǎng)基：LB 固體及液體培養(yǎng)基、PDA 培養(yǎng)基；藥劑：10%苯醚甲環(huán)唑WDG（山東百農(nóng)思達(dá)生物科技有限公司）、50%多菌靈WP（浙江一帆化工有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化、發(fā)酵液及孢子懸浮液的制備 菌株活化：挑取菌株Y-54 單菌落在LB 培養(yǎng)基中劃線，于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。使用打孔器打取直徑5 mm 番茄葉霉病菌菌餅，接種于PDA 培養(yǎng)基，于25 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d。

菌株Y-54 發(fā)酵液制備：挑取菌株Y-54 單菌落至裝有250 mL LB 液體培養(yǎng)基的三角瓶中，28 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)24～36 h，形成菌液，調(diào)節(jié)菌液濃度至1.0×108cfu/mL，再依次稀釋為10×、20×、50×、100×發(fā)酵液。

番茄葉霉病菌孢子懸浮液制備：活化好的葉霉菌產(chǎn)孢后，用無(wú)菌水洗脫孢子，過(guò)濾菌絲，10 000 r/min 離心1 min，棄上清液，收集孢子，再用無(wú)菌水沖洗孢子，用血球計(jì)數(shù)板調(diào)節(jié)孢子濃度為1.0×107cfu/mL。

1.2.2 拮抗菌株Y-54 對(duì)番茄葉霉病菌的抑制作用測(cè)定 菌株對(duì)峙：將病原菌接種至PDA 平板中間位置，距病原菌四周1.5 cm 處劃線接種拮抗菌；發(fā)酵液抑制：采用四點(diǎn)對(duì)峙培養(yǎng)的方法，將病原真菌接種在PDA 培養(yǎng)基的正中央，距病原菌四周1.5 cm 處放置4 個(gè)濾紙片，然后分別在濾紙片上滴10 μL 拮抗菌發(fā)酵液；無(wú)菌濾液抑制：拮抗菌發(fā)酵液經(jīng)12 000 r/min 離心20 min，取上清液經(jīng)0.22 μm 一次性微孔濾膜過(guò)濾后得到無(wú)菌濾液。將其與PDA 培養(yǎng)基（1∶9）充分混合，制成平板后將病原菌菌塊接至培養(yǎng)基中央。以空白PDA 培養(yǎng)基為CK，均放入28 ℃培養(yǎng)7 d，重復(fù)3次，測(cè)定抑菌率。

菌絲生長(zhǎng)抑制：挑取適量病原菌菌絲于無(wú)菌離心管中，分別加入1 mL 菌株Y-54 無(wú)菌濾液、1 000×苯醚甲環(huán)唑、500×多菌靈，充分浸泡24 h 后在顯微鏡下觀察菌絲的形態(tài)變化，以加入無(wú)菌水為CK[20]。

1.2.3 拮抗菌株Y-54 抗利福平篩選及其定殖能力測(cè)定 參照劉慧芹等[21]及高振峰等[22]的利褔平（Rif）標(biāo)記法對(duì)菌株Y-54進(jìn)行不同濃度梯度的抗性標(biāo)記，使其抗生素抗性達(dá)到100 μg/L。將抗性菌株的菌液濃度調(diào)至約1.0×108cfu/mL，取100 mL 菌液澆灌在番茄幼苗基部，以澆灌無(wú)菌水為對(duì)照。每3 d 在番茄苗根、莖、葉等不同部位取樣，每部位隨機(jī)取樣5 次，共3.0 g。樣品經(jīng)超聲波清洗并用75%乙醇消毒，研磨后加100 mL 無(wú)菌水稀釋，在含有50 μg/L Rif 的LB 平板上涂布100 μL，于28 ℃培養(yǎng)72 h后計(jì)算菌落數(shù)。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.4 拮抗菌株Y-54 對(duì)番茄種子萌發(fā)的影響試驗(yàn) 番茄種子用0.1%高錳酸鉀液浸泡5 min，無(wú)菌水沖洗后，分別在0×（原液）、10×、20×、50×、100×菌株Y-54發(fā)酵液中浸泡24 h，以無(wú)菌水為CK，無(wú)菌培養(yǎng)皿中放30 粒種子，25 ℃黑暗培養(yǎng)，每日定時(shí)補(bǔ)添無(wú)菌水保持種子濕潤(rùn)，設(shè)3 次重復(fù)，7 d 后測(cè)定發(fā)芽率。

1.2.5 拮抗菌株Y-54 對(duì)番茄幼苗生長(zhǎng)的影響試驗(yàn) 選取有2～3 片真葉時(shí)的盆栽番茄幼苗，分別用0×（即原液）、10×、20×、50×、100×發(fā)酵液進(jìn)行灌根，每株10 mL，10 d 補(bǔ)施1 次，以無(wú)菌水為CK，室溫培養(yǎng)，播種30 d 后測(cè)量株高、鮮質(zhì)量、葉長(zhǎng)、葉寬及根長(zhǎng)。采用YT-YD 便攜式葉綠素測(cè)定儀測(cè)定葉片的SPAD值，均設(shè)3次重復(fù)。

1.2.6 拮抗菌株Y-54 對(duì)番茄葉霉病的防治效果測(cè)定 于盆栽番茄幼苗長(zhǎng)至3～4 片真葉期時(shí)，使用0×（原液）、50× Y-54 發(fā)酵液澆灌番茄幼苗，每株10 mL，以無(wú)菌水為對(duì)照，14 d后再補(bǔ)灌第2次菌液。第1 次澆灌Y-54 菌液7 d 后，利用針刺接種葉霉病菌，保濕24 h，室溫20～32 ℃，待其發(fā)病。針刺接種約14 d 后發(fā)病，一部分對(duì)照分別噴施50%多菌靈WP 500 倍液和10%苯醚甲環(huán)唑WDG 1 000 倍液，另一部分對(duì)照作空白。發(fā)病后7 d 和14 d 調(diào)查病情指數(shù)及防效。病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參考陳樂樂等[23]的方法。每個(gè)處理10 株，3 次重復(fù)。病情指數(shù)=∑（各級(jí)病株數(shù)×該病級(jí)值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)值）×100；防治效果=[1-（對(duì)照區(qū)藥前病情指數(shù)×施藥區(qū)藥后病情指數(shù)）/（對(duì)照區(qū)藥后病情指數(shù)×施藥區(qū)藥前病情指數(shù)）]×100%。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0 和Excel 2007 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行處理間差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株Y-54對(duì)番茄葉霉病菌的抑制作用

菌株Y-54 對(duì)番茄葉霉病菌的抑制作用如圖1所示。菌株對(duì)峙培養(yǎng)、發(fā)酵液和無(wú)菌濾液均對(duì)番茄葉霉病菌有較強(qiáng)的抑制作用，抑制率分別達(dá)到78.42%、86.42%和91.26%。由此可見，菌株經(jīng)過(guò)發(fā)酵后抑制效果更佳。

圖1 菌株Y-54對(duì)番茄葉霉病菌的抑制作用Fig.1 The inhibition effect of strain Y-54 on C.fulvum

菌株Y-54 對(duì)葉霉病菌菌絲生長(zhǎng)的影響如圖2所示。CK（圖2A）菌絲粗細(xì)均勻，形態(tài)飽滿，結(jié)構(gòu)完整。無(wú)菌濾液和1 000×苯醚甲環(huán)唑、500×多菌靈處理后會(huì)嚴(yán)重影響其生長(zhǎng)發(fā)育，菌絲生長(zhǎng)變形彎曲，菌絲體前端膨脹呈圓球狀，中段萎縮形成拐點(diǎn)或節(jié)點(diǎn)（圖2B、C）；菌絲內(nèi)物質(zhì)外滲（圖2D），菌絲出現(xiàn)中空斷裂等現(xiàn)象（圖2B）。

圖2 菌株Y-54對(duì)番茄葉霉病菌菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of strain Y-54 on mycelium of C.fulvum

2.2 拮抗菌株Y-54在番茄中的定殖情況

抗性菌株Y-54 在番茄幼苗中的定殖情況如圖3 所示。在30 d 內(nèi)，菌株Y-54 均可在番茄的根、莖、葉中定殖，但不同時(shí)間及不同部位的定殖量不同，整體上定殖量為根＞葉＞莖。在根部和葉部，18 d時(shí)定殖量達(dá)到最大，分別為8.37×105cfu/mL 和3.29×105cfu/mL，而在莖部則表現(xiàn)為15 d 時(shí)定殖量最大，為2.24×105cfu/mL。在莖、葉部，定殖的菌量變化趨勢(shì)較為一致，進(jìn)入高峰期后，回落較平穩(wěn)；而在根部定殖的菌量則表現(xiàn)為升降較明顯?？梢?，該菌株可以在番茄不同部位定殖，且更易在根部存活。

圖3 菌株Y-54在番茄幼苗中的定殖情況Fig.3 Colonization of strain Y-54 in tomato seedlings

2.3 拮抗菌株Y-54對(duì)番茄種子萌發(fā)的影響

菌株Y-54對(duì)番茄種子萌發(fā)的影響如表1所示。5 個(gè)稀釋倍數(shù)的發(fā)酵液均對(duì)種子萌發(fā)有促進(jìn)作用。其中發(fā)酵原液（0×）對(duì)番茄種子萌發(fā)的促進(jìn)作用最明顯，發(fā)芽率達(dá)93.33%；其次是10×與20×發(fā)酵液處理，番茄種子發(fā)芽率雖然顯著低于發(fā)酵原液處理，但也達(dá)86%以上，顯著高于50×和100×發(fā)酵液處理（P＜0.05）；50×和100×處理發(fā)芽率有所下降，但仍保持在76%以上，顯著高于CK（P＜0.05）。整體上看，隨著稀釋倍數(shù)的增加，番茄種子發(fā)芽率降低，即濃度越高，發(fā)芽率越高。

表1 菌株Y-54對(duì)番茄種子萌發(fā)的影響Tab.1 Effects of strain Y-54 on tomato seed germination

2.4 拮抗菌株Y-54對(duì)番茄幼苗生長(zhǎng)的影響

采用不同稀釋倍數(shù)的菌株Y-54 發(fā)酵液對(duì)番茄幼苗灌根處理后，幼苗的生長(zhǎng)狀況如表2 所示。根長(zhǎng)、株高、莖粗、葉長(zhǎng)、葉寬、鮮質(zhì)量、葉綠素含量（SPAD 值）的變化較為一致，即隨著稀釋倍數(shù)增加，其各指標(biāo)遞減。原液（0×）處理后幼苗各指標(biāo)的表現(xiàn)最佳。0×、10×、20×發(fā)酵液處理對(duì)幼苗的影響均明顯，對(duì)各指標(biāo)的促生作用影響均顯著高于CK（P＜0.05）。

表2 菌株Y-54對(duì)番茄幼苗生長(zhǎng)的影響Tab.2 Effects of strain Y-54 on tomato seedlings growth

2.5 拮抗菌株Y-54對(duì)番茄葉霉病的防治效果

菌株Y-54 對(duì)番茄葉霉病的防治效果如表3 所示。苯醚甲環(huán)唑?qū)Ψ讶~霉病的防效最好，7 d 和14 d 的防效均在70%以上；其次是原液（0×）處理，7 d 時(shí)其防效略低于苯醚甲環(huán)唑處理，為68.04%，但二者之間并無(wú)顯著差異（P＞0.05），14 d 時(shí)則顯著低于苯醚甲環(huán)唑處理，但2 次的防效均顯著高于多菌靈處理（P＜0.05）；50× Y-54 發(fā)酵液處理的防效較差，均顯著低于其他處理（P＜0.05）。

表3 菌株Y-54對(duì)番茄葉霉病的防效Tab.3 Control effect of strain Y-54 on tomato leaf mold

3 結(jié)論與討論

每個(gè)植物都是一個(gè)獨(dú)立的微生態(tài)個(gè)體，其體內(nèi)的微生物體系在其適應(yīng)環(huán)境、調(diào)節(jié)自身生長(zhǎng)發(fā)育等方面發(fā)揮著重要作用[24]，但外來(lái)的有益菌或致病菌往往會(huì)打破植物體內(nèi)原有的微生態(tài)平衡，干擾植物的生長(zhǎng)和生理變化。前期研究發(fā)現(xiàn)，菌株Y-54 可廣泛地生存在多種植物中[19]，在本研究中，菌株Y-54可以定殖在番茄中，并與其他眾多芽孢桿菌具有相同的定殖特性[25-26]，即更容易從根部經(jīng)莖部到達(dá)葉部，且在根中的定殖量多高于其他部位，定殖菌量隨著接種時(shí)間延長(zhǎng)呈先上升后下降的變化趨勢(shì)。在植物體內(nèi)的生防菌能否成功控制病害，取決于其在植物、土壤等環(huán)境中的定殖能力和存活能力[27]，該菌株具有定殖能力強(qiáng)、定殖范圍廣、在植物體內(nèi)容易轉(zhuǎn)運(yùn)的特點(diǎn)，表明其具備防控病害的優(yōu)質(zhì)潛力。

本試驗(yàn)采用菌株對(duì)峙、發(fā)酵液以及無(wú)菌濾液3種方式均驗(yàn)證了菌株Y-54 對(duì)番茄葉霉病菌有較強(qiáng)的抑制作用，尤其是發(fā)酵液及無(wú)菌濾液的抑菌效果較好，分別達(dá)到86.42%和91.26%，接近于WANG等[11]篩選的枯草芽孢桿菌WXCDD105 對(duì)該病菌的抑制率（94.44%）。芽孢桿菌可抑制病菌菌絲的正常生長(zhǎng)發(fā)育，其抑菌機(jī)制表現(xiàn)在多個(gè)方面，如莫哈韋芽孢桿菌[28]和蠟蚧芽孢桿菌[29]可產(chǎn)生多種揮發(fā)性有機(jī)化合物；貝萊斯芽孢桿菌[30]可產(chǎn)生活性二肽等，引起菌絲變形、膨脹、萎縮、斷裂等現(xiàn)象。暹羅芽孢桿菌Y-54 同以上芽孢桿菌一樣，嚴(yán)重導(dǎo)致葉霉病菌菌絲變形，因此，推測(cè)菌株Y-54 也可能會(huì)產(chǎn)生類似的抑制物質(zhì)，或通過(guò)誘導(dǎo)作用對(duì)病菌直接產(chǎn)生作用。

通過(guò)提前澆灌和后期補(bǔ)灌的方式，菌株Y-54對(duì)番茄葉霉病的防效比較突出，尤其是發(fā)酵原液在接種發(fā)病后7 d 和14 d 的防效達(dá)到70%左右，接近苯醚甲環(huán)唑處理，明顯好于多菌靈處理?？梢?，該菌株對(duì)番茄葉霉病有較理想的防治效果。該菌株對(duì)番茄的促生作用也較為明顯，其中原液作用最明顯，使種子發(fā)芽率達(dá)到93.33%；在幼苗生長(zhǎng)過(guò)程中，各濃度發(fā)酵液均能促進(jìn)番茄幼苗根長(zhǎng)、株高、莖粗、鮮質(zhì)量、葉綠素含量等指標(biāo)增長(zhǎng)，且發(fā)酵原液（0×）和10×、20×發(fā)酵液可顯著提高幼苗的各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)。這與楊曉云等[27]研究的解淀粉芽孢桿菌B1619、陳秀香等[31]研究的枯草芽孢桿菌FC21 的作用效果一致。

生防微生物防治病害的機(jī)制是多方面的，包括對(duì)靶標(biāo)菌的抑制作用、與病原物競(jìng)爭(zhēng)作用位點(diǎn)，以及能夠產(chǎn)生蛋白質(zhì)、多肽類、植物激素等物質(zhì)，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生多樣抗病性[25]。本研究?jī)H測(cè)定了菌株Y-54抑菌、定殖、促生、防治作用，鑒于菌株Y-54具有較好的潛力，在后續(xù)研究中將就其抗病機(jī)制和生產(chǎn)應(yīng)用開展深入的探索。

綜上，菌株Y-54 對(duì)番茄葉霉病菌有著較強(qiáng)的抑制作用，可導(dǎo)致病菌菌絲變形、膨脹、萎縮、斷裂等。菌株Y-54 可在番茄的根、莖、葉部位進(jìn)行定殖，定殖菌量在30 d 內(nèi)的變化趨勢(shì)呈先上升后下降，且在15～18 d 時(shí)達(dá)到最大。菌株Y-54 可以有效促進(jìn)番茄種子的萌發(fā)，特別是發(fā)酵原液浸泡的種子發(fā)芽率最高，達(dá)93.33%；并且能有效促進(jìn)幼苗根長(zhǎng)、株高、鮮質(zhì)量、葉綠素含量等各項(xiàng)指標(biāo)的增長(zhǎng)，以發(fā)酵原液（0×）和10×、20×發(fā)酵液的促生作用較好，顯著高于對(duì)照。菌株Y-54 的發(fā)酵原液（0×）對(duì)番茄葉霉病發(fā)病后7 d 和14 d 內(nèi)的防效接近于苯醚甲環(huán)唑處理，達(dá)到70%左右，顯著高于多菌靈的防效。